一種用於重組tPA衍生物的大規模包涵體復性純化技術的製作方法
2023-07-03 23:13:01 2
專利名稱：一種用於重組tPA衍生物的大規模包涵體復性純化技術的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，更具體地涉及對組織纖溶酶原激活劑的包涵體的復性純化技術。
背景技術：
大腸桿菌表達的組織纖溶酶原激活劑的包涵體變性及復性研究是蛋白質包涵體復性及純化研究的難點問題。由於蛋白質分子中大量二硫鍵的存在，使得其復性及純化工藝較為複雜，且成本較高。純化工藝的成本直接導致了藥品價位的居高不下。
對於大腸桿菌表達的以無活性的包涵體形式存在的重組蛋白質，常用的復性方法是首先用高濃度的鹽酸胍或尿素將其變性溶解，之後通過變性劑的去除得到復性的重組蛋白質。
在蛋白質的復性過程中，同時存在兩種反應蛋白質的復性及無活性的聚合體的生成。為了獲得較好的復性效果，復性過程常常需要在較低的蛋白質濃度條件下進行。這樣蛋白質復性時的溶液體積一般較大。有研究表明，重組tPA的復性常常需要在20ug/ml左右的濃度以下方能達到較高的復性效果。
另外，多數重組蛋白質均含有二硫鍵，二硫鍵的正確配對對於重組蛋白質的復性至關重要。二硫鍵的正確配對有助於整個蛋白質分子的正確摺疊，另一方面，蛋白質分子多肽鏈的部分摺疊也有助於相應半胱氨酸殘基間的結合與二硫鍵的正確配對。為了提高二硫鍵的正確配對，常常需要加入氧化還原對(如一定配比的氧化型及還原型穀胱甘肽)。
目前常用的復性工藝中，重組tPA的濃度需要稀釋至較低濃度(如約10-100ug/ml)才能達到較好的復性結果，由於tPA或其衍生物分子中含有大量的二硫鍵(tPA含17對，tPA衍生物含9對)，在復性過程中需要添加氧化還原對以保證二硫鍵的正確配對。然而，由於氧化型及還原型穀胱甘肽價格很高(其中氧化型幾十美金/克)，如果在復性反應的整個過程中均加入氧化還原試劑，將大大增加蛋白質復性及純化過程的成本。
tPA是一種具有顯著療效和巨大應用潛力的重組藥物，九十年代初開發成功的tPA衍生物也已投入市場。迄今為止，大多數基因工程藥物已在我國仿製成功，作為具有巨大商業價值的tPA，至今始終未能仿製成功，一個十分重要的因素在於生產工藝技術研究的不足和缺乏。由於tPA或其衍生物使用劑量很大，同時蛋白質復性純化工藝十分複雜，因此，大規模、低成本的製備工藝，是tPA或其衍生物形成產品無法迴避的必要條件。如何能夠降低純化與生產成本，成為這一重組蛋白質能否投入應用的十分重要的課題。
因此，本領域迫切需要開發低成本的tPA衍生物的復性純化技術。
發明內容
本發明的目的就是提供一種低成本的、使tPA衍生物等重組蛋白的復性的技術。
在本發明的第一方面，提供了一種蛋白質復性方法，包括步驟(a)將目標蛋白質的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體蛋白質的上清液；(b)用第一復性液稀釋上清液，形成目標蛋白質的濃度為100-1000微克/毫升的第一稀釋溶液，其中，第一復性液含3-7M選自尿素或鹽酸胍的變性劑和緩衝液，pH7.5-9.0，並且第一復性液中所含的氧化型穀胱甘肽及還原型穀胱甘肽與目標蛋白質之比為4-10mmol穀胱甘肽0.1-1mg目標蛋白，且還原型穀胱甘肽與氧化型穀胱甘肽的摩爾比為4-6∶0.8-1.2；(c)在20-28℃下，放置第一稀釋溶液16-24小時；(d)用第二復性液稀釋第一稀釋溶液，形成目標蛋白質的濃度為10-100微克/毫升的第二稀釋溶液，其中，第二復性液含0.1-2.5M尿素和緩衝液，pH7.5-9.0；(e)在20-28℃下，放置第二稀釋溶液16-24小時；(f)過濾第二稀釋溶液，將濾液體積超濾濃縮為原體積的1/8-1/40，獲得第一濃縮濾液；(g)過濾第一濃縮濾液，然後將濾液稀釋於3-7倍體積的pH調節緩衝液中，所述的pH調節緩衝液含有10-100mM醋酸鹼土金屬鹽或醋酸銨，pH4.0-5.5；(h)過濾步驟(g)的稀釋溶液，將溶液體積超濾濃縮為原體積的1/3-1/10，獲得含有復性的目標蛋白的第二濃縮濾液。
在另一優選例中，第一復性液還含有0.5-1M精氨酸，第二復性液含有0.3-1M精氨酸。
在另一優選例中，第一復性液中氧化型穀胱甘肽及還原型穀胱甘肽與目標蛋白質之比為4-6mmol穀胱甘肽0.2-0.8mg目標蛋白。
在另一優選例中，第一復性液中還原型穀胱甘肽與氧化型穀胱甘肽的摩爾比為4-6∶1。
在另一優選例中，步驟(f)中使用孔徑為0.22-0.45um的濾膜或截留分子量為10Kd超濾膜；步驟(g)中使用的孔徑為0.22-0.45um的濾膜；且步驟(h)中使用截留分子量為10Kd的超濾膜。
在另一優選例中，該方法還包括步驟(i)對第二濃縮液進行離子交換柱層析純化，從而獲得純化的目標蛋白。較佳地，所述的離子交換柱層析的條件是用洗脫溶液進行兩次洗脫，即用含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨，pH4.5-6.0的洗脫溶液及含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨，pH5.5-7.0的洗脫溶液進行洗脫。
在另一優選例中，第一復性液的pH為8.0-9.0，所述變性劑的濃度為3-5M。
在另一優選例中，步驟(g)中pH調節緩衝液中所述的pH為4.0-5.5。
在另一優選例中，所述的目標蛋白選自下組組織纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑衍生物、尿激酶、尿激酶原。
在本發明的第二方面，提供了一種對大腸桿菌表達的重組包涵體蛋白質進行分離的方法，它包括本發明上述的復性步驟和常規的純化步驟。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現，在復性過程中，可以採用分段稀釋的方法，並且僅需第一次復性的條件中，即在tPA較高濃度(100-1000微克/升)以及較小溶液體積的情況下添加氧化還原對就可使保證二硫鍵的正確配對，並且使tPA蛋白質分子正確摺疊，沒有必要在更低濃度下添加氧化還原對，從而大幅縮減了氧化型及還原型穀胱甘肽使用量(減少90％)，在此基礎上完成了本發明。
如本文所用，術語「tPA」或「組織纖溶酶原激活劑」指一種具有溶解血栓作用的蛋白質分子，其蛋白質分子的胺基酸序列以及cDNA編碼序列已知(見Pennica et al.，1983；Nature，301，214)。tPA蛋白質分子量為67kDa，由指形區、表皮生長因子區、兩個三角區(K1及K2)以及蛋白酶活性區組成。
如本文所用，術語「tPA衍生物」或「組織纖溶酶原激活劑衍生物」指僅保留有tPA分子K2區及蛋白酶活性區的蛋白質分子。這在眾多文獻和專利申請中有詳細的描述，例如美國專利5223256。
簡而言之，在本發明中，首先用8M尿素或7M鹽酸胍溶解重組蛋白質包涵體，之後利用梯度稀釋的方法分步降低變性劑的濃度，以儘量減少蛋白質分子間的重新聚合。在初次稀釋時，加入氧化還原對(如氧化型及還原型穀胱甘肽)，以促進變性蛋白二硫鍵的正確復性。而在二次稀釋過程中則省去氧化還原對的加入。由於一定濃度的變性劑的存在，第一次稀釋時可以在較高蛋白質濃度與較小體積的條件下進行。在本發明中，包涵體溶解液與第一次稀釋、第二次稀釋的體積比約為1∶8-10∶60-100。因此，本發明的復性純化工藝大大降低了試劑的消耗，降低了成本，同時對於tPA衍生物重組蛋白質的復性也取得了很好的復性效果。
具體而言，本發明的復性方法通常包括以下步驟(a)將目標蛋白質的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體的上清液。
該步驟與本領域的常規方法相同，因此可以採用本領域常規方法的反應條件。
(b)第一次稀釋。
在該步驟中，用第一復性液稀釋上清液，形成目標蛋白質的濃度為100-1000微克/毫升的第一稀釋溶液，其中，第一復性液含3-7M尿素和緩衝液，pH7.5-9.0，並且第一復性液中所含的氧化型穀胱甘肽及還原型穀胱甘肽與目標蛋白質之比為4-10mmol穀胱甘肽0.1-1mg目標蛋白，且還原型穀胱甘肽與氧化型穀胱甘肽的摩爾比為4-6∶0.8-1.2。
(c)第一階段復性通常在室溫(20-28℃)下，緩慢攪拌第一稀釋溶液16-20小時。該步驟的條件與本領域現有方法基本相同。
(d)第二次稀釋該步驟與本領域的常規方法相同，因此可以採用本領域常規方法的反應條件。
在一優選例中，用第二復性液稀釋第一稀釋溶液，形成目標蛋白質的濃度為10-100微克/毫升的第二稀釋溶液，其中，第二復性液含0.1-2.5M尿素和緩衝液，pH7.5-9.0，但不必含有氧化型穀胱甘肽及還原型穀胱甘肽。
(e)第二階段復性通常室溫(20-28℃)下，緩慢攪拌第二稀釋溶液15-20小時。該步驟的條件與本領域現有方法基本相同。
(f)第一次濃縮該步驟與本領域的常規方法相同，因此可以採用本領域常規方法的反應條件。通常，過濾第二稀釋溶液，將濾液體積超濾濃縮為原體積的1/8-1/40，獲得第一濃縮濾液。其中可用0.45/0.22um濾膜過濾，或選用截留分子量為10Kd超濾膜進行超濾濃縮。
(g)調節pH至酸性該步驟與本領域的常規方法相同，因此可以採用本領域常規方法的反應條件。
在另一優選例中，可過濾第一濃縮濾液，然後將濾液稀釋於3-5倍體積的pH調節緩衝液中，所述的pH調節緩衝液含有10-100mM醋酸鹼土金屬鹽或醋酸銨，pH4.0-5.5。
較佳地，步驟(g)中使用0.45/0.22um的濾膜。
(h)第二次濃縮該步驟與本領域的常規方法相同，因此可以採用本領域常規方法的反應條件。通常，過濾步驟(g)的稀釋溶液，將溶液體積超濾濃縮為原體積的1/3-1/10，這樣，就獲得含有復性的目標蛋白的第二濃縮濾液。
較佳地，步驟(h)中使用截留分子量為10Kd的超濾膜。
該含有復性的目標蛋白的第二濃縮濾液即為本發明的蛋白質復性產物。當然，還可用本領域常規的純化方法，對復性產物進行純化。這可用本領域常見的試劑和反應條件進行純化。一種優選的方法是離子柱層析方法。
本發明不僅可用於大腸桿菌表達的重組組織纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑衍生物，還適用於重組尿激酶、尿激酶原等。
以tPA為例，本領域現有的各種生產tPA或其衍生物的大腸桿菌工程菌(如ATCC 53227等)都可用於本發明。在眾多文獻和專利中公開了生產tPA或其衍生物的大腸桿菌，例如美國專利H2,055(申請人ZymoGenetics，Inc.，申請號Appl.No.778203，申請日1985年9月20日)，美國專利6,027,888(申請人BoardofRegents，The University of Texas System，申請號834516，申請日1997年4月4日)，美國專利5,106,741(申請人The Upjohn Company，申請號714365；申請日1991年6月12日)。
本發明的主要優點在於(a)成本低，其中氧化型穀胱甘肽與還原型穀胱甘肽的用量下降了80-90％以上。整個復性工藝成本大幅度下降。
(b)復性效果好，與整個過程都使用氧化型穀胱甘肽與還原型穀胱甘肽的復性效果基本無差別。
(c)本發明的蛋白質復性的工藝的適用面很廣，不僅可用於組織纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑衍生物，還適用於尿激酶、尿激酶原等。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1組織纖溶酶原激活劑的包涵體的復性取溼重10克的已純化tPA包涵體，溶解於1000ml變性溶液中(8M尿素或7M鹽酸胍，20mM DDT)，室溫攪拌2-5小時後，15,000rpm離心50分鐘。
將離心上清液稀釋至8-12升復性液I中(3-7M尿素，0.5-1M精氨酸，50mMTris·HCl，pH8.2-9.0，1-10mM還原型穀胱甘肽GSH，0.05-5mM氧化型穀胱甘肽GSSG)。室溫攪拌過夜後，0.45μm濾膜過濾。
將濾液稀釋到80-120立升復性液II中(0.1-2.5M尿素，0.3-1M精氨酸，50mMTris·HCl，pH8.2-9.0)。在室溫復性16-20小時。
過濾(濾膜規格0.22um)，濾液用10K-Millipore超濾膜超濾濃縮至3-10立升，獲得第一濃縮液。
用0.45μm濾膜過濾第一濃縮液，濾液稀釋到15-30立升pH調節緩衝液中(10-100mM醋酸銨pH4.0-5.5)。
0.22μm濾膜過濾，用10K-Millipore超濾膜超濾濃縮至3-10立升，獲得含組織纖溶酶原激活劑的第二濃縮液。全部用於實施例2。
實施例2組織纖溶酶原激活劑的包涵體的純化在本實施例中，用常規的離子柱層析方法對實施例1製備的含組織纖溶酶原激活劑的第二濃縮液進行純化。
方法將實施例1獲得的復性樣品上Pharmacia SP-Sepharose Fast Flow柱，上樣後用洗脫溶液I(含有0-1M NaCl的50mM醋酸銨pH4.0-5.0)洗脫，之後再用洗脫溶液II(含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨pH4.5-6.0)及洗脫溶液III(含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨pH5.5-7.0)洗脫，得到純化的重組tPA衍生物。
結果最終獲得150-200mg左右比活為40,000-200,000IU/mg蛋白質的純化重組tPA衍生物。復性工藝中穀胱甘肽的使用量下降了90％，成本下降了一半以上。目標蛋白質回收率5-10％左右，與常規方法相同。
實施例3-5組織纖溶酶原激活劑的包涵體的復性重複實施例1，不同點在於改變實施例1中部分復性條件，如表1所示。
表1 復性條件
結果同樣最終獲得80-220mg左右比活為40,000-200,000IU/mg蛋白質的純化重組tPA衍生物。復性工藝中穀胱甘肽的使用量下降了80-90％，成本下降了一半以上。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種蛋白質復性方法，其特徵在於，包括步驟(a)將目標蛋白質的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體蛋白質的上清液；(b)用第一復性液稀釋上清液，形成目標蛋白質的濃度為100-1000微克/毫升的第一稀釋溶液，其中，第一復性液含3-7M選自尿素或鹽酸胍的變性劑和緩衝液，pH7.5-9.0，並且第一復性液中所含的氧化型穀胱甘肽及還原型穀胱甘肽與目標蛋白質之比為4-10mmol穀胱甘肽∶0.1-1mg目標蛋白，且還原型穀胱甘肽與氧化型穀胱甘肽的摩爾比為4-6∶0.8-1.2；(c)在20-28℃下，放置第一稀釋溶液16-24小時；(d)用第二復性液稀釋第一稀釋溶液，形成目標蛋白質的濃度為10-100微克/毫升的第二稀釋溶液，其中，第二復性液含0.1-2.5M尿素和緩衝液，pH7.5-9.0；(e)在20-28℃下，放置第二稀釋溶液16-24小時；(f)過濾第二稀釋溶液，將濾液體積超濾濃縮為原體積的1/8-1/40，獲得第一濃縮濾液；(g)過濾第一濃縮濾液，然後將濾液稀釋於3-7倍體積的pH調節緩衝液中，所述的pH調節緩衝液含有10-100mM醋酸鹼土金屬鹽或醋酸銨，pH4.0-5.5；(h)過濾步驟(g)的稀釋溶液，將溶液體積超濾濃縮為原體積的1/3-1/10，獲得含有復性的目標蛋白的第二濃縮濾液。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，第一復性液還含有0.5-1M精氨酸，第二復性液含有0.3-1M精氨酸。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，第一復性液中氧化型穀胱甘肽及還原型穀胱甘肽與目標蛋白質之比為4-6mmol穀胱甘肽∶0.2-0.8mg目標蛋白。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，第一復性液中還原型穀胱甘肽與氧化型穀胱甘肽的摩爾比為4-6∶1。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(f)中使用孔徑為0.22-0.45um的濾膜或截留分子量為10Kd超濾膜；步驟(g)中使用的孔徑為0.22-0.45um的濾膜；且步驟(h)中使用截留分子量為10Kd的超濾膜。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，還包括步驟(i)對第二濃縮液進行離子交換柱層析純化，從而獲得純化的目標蛋白。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的離子交換柱層析的條件是用洗脫溶液進行兩次洗脫，即用含有0-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨，pH4.5-6.0的洗脫溶液及含有0.1-1M精氨酸，0.1-1M NaCl的50mM醋酸銨，pH5.5-7.0的洗脫溶液進行洗脫。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，第一復性液的pH為8.0-9.0，所述變性劑的濃度為3-5M。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(g)中pH調節緩衝液中所述的pH為4.0-5.5。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的目標蛋白選自下組組織纖溶酶原激活劑、組織纖溶酶原激活劑衍生物、尿激酶、尿激酶原。
全文摘要
本發明提供了一種蛋白質復性方法，包括步驟(a)將目標蛋白質的包涵體溶解，離心獲得溶解有包涵體蛋白質的上清液；(b)用第一復性液稀釋，其中第一復性液含氧化還原對；(c)放置一段時間；(d)用第二復性液稀釋，第二復性液不含氧化還原對；(e)放置一段時間；(f)過濾、濃縮，獲得第一濃縮濾液；(g)過濾，然後將濾液稀釋於pH調節緩衝液中，調節pH至4.0－5.5；(h)過濾步驟(g)的稀釋溶液，濃縮獲得含有復性的目標蛋白的第二濃縮濾液。本發明復性方法成本低，用於大腸桿菌表達的重組tPA或其衍生物的低成本的重組蛋白質。
文檔編號C12N9/72GK1613869SQ20031010842
公開日2005年5月11日 申請日期2003年11月5日 優先權日2003年11月5日
發明者張毅, 陸堅峰, 楊勝利, 褚仲梅, 劉成, 屈賢銘 申請人:上海中科伍佰豪生物工程有限公司