一種草魚呼腸孤病毒rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法
2023-12-09 08:59:36 2
專利名稱：一種草魚呼腸孤病毒rt-pcr檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明屬於魚類病毒檢測技術領域，具體涉及一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒，還涉及一種利用草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測草魚呼腸孤病毒的方法。
背景技術：
草魚出血病是傳染性、致病性都很強的一種嚴重病毒性疾病，主要危害草魚魚種。1972年首次在湖北灄口發現，並命名為草魚出血病。1978年首次通過電鏡觀察證實該病原為病毒。1983年首次分離出爆發性草魚出血病病原，並根據其形態學、理化特性等研究鑑定該病毒為呼腸孤病毒。1991年國際病毒分類委員會第五次會議將該病毒正式命名為草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus, GCRV),並納入呼腸孤病毒科(Reoviridae)水生呼腸孤病毒屬(Aquareovirus)。草魚呼腸孤病毒是我國分離鑑定的第一株魚類病毒,現在已有資 料證實該病毒是水生呼腸孤病毒屬中致病力最強的毒株，目前國內已報導了 20多個分離株。對草魚呼腸孤病毒的檢測的方法很多，電鏡觀察是最直接的方法，細胞培養分離病毒、空斑試驗、病毒核酸聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)等經典方法較為複雜，目前國內外檢測草魚呼腸孤病毒最常用的還是免疫學檢測方法及RT-PCR方法等。免疫學方法在敏感性和特異性上有待提高，並且存在空窗期、交叉反應、血清型差異等問題。在現有的關於RT-PCR檢測GCRV的公開文獻中，都是採用傳統的兩步法RT-PCR技術，即將反轉錄和PCR反應分管分步進行。RT-PCR檢測病原在近年來越來越趨向於採用一步法進行反應。與兩步法相比，簡化了操作程序、降低了樣品交叉汙染的可能性，對反應的幹擾因素少，能獲得良好的重現性，又降低了成本，為開發同時檢測多種病原的多重RT-PCR創造了有利條件。
發明內容
本發明的一個目的是在於提供了一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒，通過分析比對GenBank中已有的草魚呼腸孤病毒基因序列(AF260512、AF284502、GQ896335、HQ231199、JN967630)，針對病毒核酸第2片段序列設計並篩選了一對兼併引物，從而實現一步法檢測GCRV病毒的目的，所用的試劑均為國產試劑，大大降低了實驗成本，從分子水平對草魚呼腸孤病毒進行快速檢測，具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點。本發明的另一個目的是在於提供了一種利用草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測草魚呼腸孤病毒的方法，本方法可在3小時內準確檢測出樣品中的GCRV，能檢測GCRV感染的草魚組織，也能檢測GCRV感染的細胞(例如CIK細胞)，非常適用於GCRV的快速檢測。為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒，包括以下成分該試劑盒包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 GCRVF 和 GCRVR，AMV 酶，Taq 酶。GCRVF: 5，-GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3，；
GCRVR: 5 』 -ffDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3 』。一種利用草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測草魚呼腸孤病毒的方法，其步驟是I、病毒RNA的獲取採用TRWix或TRW : LS試劑或柱吸附洗脫法等提取樣本總RNA。2、RT-PCR 擴增採用25 μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5 μ L, 5 X AMVbufferl μ L, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) O. 5-3 μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，補力口
滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行RT-PCR反應，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35個循環，最後72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置陽性對照和陰性空白對照。3、檢測結果判定取擴增產物，用I. 5% (w/v,以下相同)的瓊脂糖凝膠電泳後，置於凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示在650bp大小處有條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。一種利用草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測草魚呼腸孤病毒的方法(最佳條件)，其步驟是I、病毒RNA的獲取採用TRi/υΙκ或TRIzrf LS試劑或柱吸附洗脫法等提取樣本總RNA，模板RNA在950C 5分鐘後迅速置於冰浴中的預處理可以增加檢測的靈敏度。2、RT-PCR 擴增採用25 μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5 μ L，5 X AMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，補力口滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行RT-PCR反應，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35個循環，最後72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置陽性對照和陰性空白對照。3、檢測結果判定取擴增產物，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳後，置於凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示在650bp大小處有條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。與現有技術相比，本發明具有以下優點I、本發明公開了一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒，能夠檢測出目前分離的所有的GCRV病毒株。2、特異性好，能有效檢測出GCRV病毒；3、全部採用國產試劑，大大降低了檢測成本；4、一步法提高了檢測效率，縮短了檢測時間。
圖I為一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測方法的特異性的示意圖
從左至右的泳道依次為水的空白對照、GCRV-873、GCRV-HZ08株和104株感染CIK細胞的總RNA、SVCV感染EPC細胞的總RNA、CRV感染CCO細胞的總RNA、DLl, OOOMarker0圖2為一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測草魚組織的結果示意圖從左至右的泳道依次為DL5，OOOMarker,8個疑似草魚組織的總RNA、GCRV-104株感染CIK細胞的總RNA、水的空白對照。
具體實施例方式下列實例進一步說明本發明，但不應該當做對本發明的限制。本發明 全部試劑均為上海生工公司產品。實施例I :一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒，包括以下成分該試劑盒它包括以下成分5XAMVbuffer, Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free),MgCl2, dNTPs，引物 GCRVF 和 GCRVR，AMV 酶，Taq 酶。實施例2 草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒所用緩衝液的優化一、取待檢樣品提取病毒RNA:培養草魚腎臟細胞(CIK細胞)至匯合單層，吸出培養液，以感染複數為O. I的劑量，接種ImL經4000r/min離心5min除去細胞碎片的草魚呼腸孤病毒細胞毒材料GCRV-104(CCTCC N0:V201217)，添加 10 μ L 的 Polybrene (終濃度 10μ g/ml)，置於 28°C 培養箱中吸附lh，使病毒吸附細胞，吸附過程中每20min輕輕晃動培養瓶一次，使病毒液與細胞單層充分均勻接觸，吸附Ih後，吸棄病毒液，加入5mL2%胎牛血清(V/V)的培養液，置28°C培養，直至細胞出現明顯的致細胞病變效應，收集細胞病變材料，於_80°C至室溫(20-25°C)反覆凍融3次，5000r/min離心30min,取上清250 μ I,用TRIzol LS (Invitrogen)試劑按照說明書提取RNA，最後溶於50 μ I滅菌水，-80°C保存備用。二、RT-PCR擴增的反應體系採用25 μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板(預處理方法將獲得的模板RNA在95°C 5分鐘後迅速置於冰浴中的預處理可以增加檢測的靈敏度，以下同)5 μ L，5 X AMV buffer，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free), MgCl2 (25mM) 2 μ L, dNTPs (25mM) 0. 5 μ L,引物(20 μ M)各0· 5 μ L，AMV酶O. 5 μ L，Taq酶O. 5 μ L，補加滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行 RT-PCR 反應，先 45°C 30min,95°C 3min，再按 95°C 20s_52°C 20s_72°C 40s 作 35 個循環，最後72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置空白對照。其中5XAMV buffer 和 Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free)米用不同的組合I) 5 X AMV buffer O μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2. 5 μ L2) 5 X AMV buffer I μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L3) 5 X AMV buffer 2 μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) I. 5μ L4) 5 X AMV buffer 3 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) I μ L5) 5 X AMV buffer 4 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 0. 5 μ L6) 5 X AMV buffer 5 μ L，Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) OyL三、檢測結果判定
取8 μ I擴增產物，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳後，置於凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示 5XAMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L 時結果最好。實施例3 草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒不同濃度的Mg2+的優化一、取待檢樣品提取病毒RNA:待GCRV-104感染的CIK細胞出現90%病變後收穫(製備方法同實施例2)，於_80°C至室溫反覆凍融3次，5000r/min離心30min，取上清250 μ 1，用TRb.ol LS試劑按照說明書提取RNA，最後溶於50 μ I滅菌水，-80°C保存備用。二、RT-PCR擴增的反應體系採用25 μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5 μ L, 5 X AMVbufferl μ L, Taq 酶 10 X PCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM)，dNTPs (25mM) 0· 5 μ L，引物(20 μ Μ)各O. 5 μ L，AMV酶O. 5 μ L，Taq酶0· 5 μ L，補加滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行 RT-PCR 反應，先 45°C 30min, 95°C 3min,再按 95°C 20s_52°C 20s_72°C 40s 作 35 個循環，最後72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置空白對照。其中MgCl2 (25mM)添加量分別為 O μ L、0. 5 μ L、I μ L、I. 5 μ L 和 2 μ L。三、檢測結果判定取8μ I擴增產物，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳後，置於凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示MgCl2 (25mM)添加量為I μ L時結果最好。
實施例4 草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測方法的特異性—、取待檢樣品提取病毒RNA:接種SVCV (張朋，劉葒，陳孝煊，等.鯉春病毒血症病毒單克隆抗體的製備及其特性鑑定[J]，中國預防獸醫學報，2011,33 (4):305-308.)的EPC細胞、接種CRV (曾令兵、徐進、李豔秋，等.斑點叉尾鮰出血病病原呼腸孤病毒的分尚與鑑定[J]，病毒學報，2009, 25
(6):460-466.)的 CCO 細胞、接種 GCRV-HZ08 株、GCRV-873 株和 GCRV-104 株的 CIK 細胞出現90%病變後收穫(上述病毒的製備方法同GCRV-104)，於-80°C至室溫反覆凍融3次，5000r/min離心30min，取上清250 μ 1，用TRIzof LS試劑按照說明書提取RNA，最後溶於50 μ I滅菌水，-80°C保存備用。目前GCRV至少有30個分離株，分為3個基因型，GCRV-104、GCRV_HZ08、GCRV-873是各型的代表。二、RT-PCR擴增的反應體系採用25 μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5 μ L，5 X AMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，補力口滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行RT-PCR反應，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35個循環，最後72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置空白對照。三、檢測結果判定取8 μ I擴增產物，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳後，置於凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示能夠檢測出GCRV-104、GCRV-HZ08和GCRV-873，而SVCV、CRV和空白對照均無法檢出(圖1)，表明利用本發明的試劑盒，能夠檢測出目前分離的所有的GCRV病毒株，並具有特異性。實施例5 一種利用草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測草魚呼腸孤病毒的方法，其步驟是一、取待檢樣品提取病毒RNA:取IOOmg疑似感染草魚呼腸孤病毒的草魚組織加入Iml TRIzof試劑用玻璃勻漿器於室溫研磨，按照說明書提取RNA，最後溶於50 μ I滅菌水，-80°C保存備用。以下為本發明中判斷疑似草魚感染了呼腸孤病毒的依據
仔細檢查草魚有無異常表徵，如發現其尾鰭末端變黑、不食、反應遲鈍、獨遊、易失平衡的；口腔、上下頜、頭頂部、眼眶周圍、鰓蓋及鰭條基部充血、鰓絲呈點狀出血；病魚出血嚴重時，鰓呈「白鰓」症狀；或魚體暗黑，小的魚種在陽光或燈光透視下，皮下肌肉充血。可作疑似草魚出血病對待，並進一步診斷。經初步判斷為疑似草魚出血病的患病魚，抽樣進行解剖檢查，根據下述病變，可初步判斷為草魚出血病a)剝開皮膚，肌肉充血和點狀出血，呈鮮紅色；b)腸壁充血或出血，全腸或局部呈鮮紅色，腸壁彈性較好，腸內無食物，粘液較少；c)腸繫膜、周圍脂肪、鰾、膽囊、肝、腎有出血點或血絲；d)個別情況下，鰾及膽囊呈紫紅色；e)當肌肉出血嚴重時，肝、脾、腎的顏色變淡。二、RT-PCR擴增的反應體系採用25 μ I反應體系在PCR管中加入預處理的核酸模板5 μ L，
5X AMV bufferl μ L，Taq 酶 10XPCR buffer (Mg2+free) 2 μ L, MgCl2 (25mM) I μ L,dNTPs(25mM)0. 5μ L,引物(20 μ Μ)各 O. 5 μ L，AMV 酶 O. 5 μ L，Taq 酶 O. 5 μ L，補力口滅菌水至25 μ L。放入PCR儀進行RT-PCR反應，先45 V 30min, 95 V 3min,再按950C 20s-52°C 20s_72°C 40s作35個循環，最後72°C延伸5min，4°C下保溫。同時設置陽性對照和陰性空白對照。三、檢測結果判定取8 μ I擴增產物，用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳後，置於凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示對照成立，8個魚樣均呈陽性(圖2)，與細胞培養方法檢測的結果一致。
權利要求
1.一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒，其特徵在於，包括以下成分 5 XAMV 緩衝液，無鎂 Taq 酶 IOXPCR 緩衝液，MgCl2 , dNTPs，引物 GCRVF 和 GCRVR，AMV 酶，Taq 酶；GCRVF: 5』 -GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3』 ；GCRVR: 5』 -WDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3』。
2.利用權利要求I所述的一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒檢測草魚呼腸孤病毒的方法，其步驟是 1)、病毒RNA的獲取 採用TRIzof或TRIzol LS試劑或柱吸附洗脫法提取樣本總RNA ； 2)、RT-PCR擴增: 採用25 μ I反應體系在PCR管中加入步驟I)中提取的樣本總RNA 5yL,5XAMV緩衝液 I μ L，無鎂 Taq 酶 IOXPCR 緩衝液 2yL，25mM MgCl2 I μ L,25mM dNTPs O. 5 μ L, 20 μ M引物各0.5yL，AMV酶0.5 μ L，Taq酶O. 5 μ L，補加滅菌水至25 μ L，放入PCR儀進行RT-PCR 反應，先 45°C 30 min, 95V 3min,再按 95°C 20s_52°C 20s_72°C 40s 做 35 個循環，最後72°C延伸5min，4°C下保溫，同時設置陽性對照和陰性空白對照； 3)、檢測結果判定，採用下述方式 取擴增產物，用I. 5% w/v的瓊脂糖凝膠電泳後，置於凝膠成像系統中成像，電泳圖片顯示在650bp大小處有條帶，則結果為陽性；如無任何條帶，則結果為陰性。
全文摘要
本發明公開了一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒及檢測方法，一種草魚呼腸孤病毒RT-PCR檢測試劑盒，包括以下成分5×AMV緩衝液，無鎂Taq酶10×PCR緩衝液，MgCl2，dNTPs，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶。本發明具有簡便、快速、高特異性和靈敏性的特點，可在3小時內準確檢測出樣品中的GCRV，能檢測GCRV感染的草魚組織，也能檢測GCRV感染的細胞，非常適用於GCRV的快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102876809SQ20121039848
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者張輝, 曾令兵, 周勇, 範玉頂, 徐進 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所