半乳糖的測定方法與半乳糖診斷/測定試劑盒--9049的製作方法

2023-07-04 04:45:51

專利名稱：半乳糖的測定方法與半乳糖診斷/測定試劑盒--9049的製作方法
半乳糖的測定方法與半乳糖診斷/測定試劑盒一9049
技術領域：
本發明涉及醫學/食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發明涉及半乳糖診斷/測 定方法及其試劑盒。
背景技術：
牛奶在營養界素有「液體黃金」的美稱，我國早在1992年由七部位聯合提出「一 杯牛奶強壯一個民族」的口號。奶類除不含纖維素外，幾乎含有人體所需要的各種營養素。 牛奶中的乳糖進入人體後，經小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是嬰兒大腦 發育的必需物質，與嬰兒大腦的迅速成長有密切關係。牛奶雖好但並不是所有的人都能享受，有些人由於乳糖酶的缺乏，人體不能很好 的消化吸收牛奶中的營養素，還會造成鈣、磷、鉀、鐵等元素的吸收障礙，影響嬰幼兒的體格 和智力發育，在老年人中，乳糖酶缺乏是造成骨質疏鬆的重要原因。中國成年人飲用牛乳後 乳糖吸收不良的發病率高達86. 7%，不耐受指數為0. 9。為了避免不適當飲奶對健康造成的損害，因此最好在飲奶前檢查自己是否耐受乳 糖，在飲用牛奶後，測試尿液中半乳糖的濃度，這是目前國外最常用的一種方法，更為簡便、 經濟、可靠。

發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種半乳糖的測定方法。本發明的另一個目的是提供一種半乳糖診斷/測定試劑盒。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明的方法是一種採用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯法(Couple Reaction)的聯用技術，利用測定還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處的吸光度變化測定半乳糖的方法。本發明半乳糖測定方法的的技術原理是根據下述半乳糖激酶、氨甲醯磷酸合成 酶、異檸檬酸脫氫酶的系列催化反應完成半乳糖+腺苷三磷酸 半乳糖激酶 腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲醯磷酸 氨甲醯磷酸合成酶2腺苷三磷酸+氨+ 二氧化碳+水二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶 異檸檬酸脫氫酶 異檸檬酸+輔酶本發明的方法利用半乳糖激酶(galactokinase ;EC 2.7.1.6)酶(偶)聯氨 甲醯磷酸合成酶(carbamoyl-phosphate synthase ；EC 6. 3. 4. 16)、異檸檬酸脫氫酶 (isocitratedehydrogenase ；EC 1. 1. 1. 41 ；EC 1. 1. 1. 42)酶促反應終點法。半乳糖激酶酶 解半乳糖反應產生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯合氨甲醯磷酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)， 從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光 度下降的程度，可以測算半乳糖的濃度大小。本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種半乳糖的測定方法。該半乳糖測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的製備將一定量的半乳糖溶於水或緩衝液中，再將半乳糖濃度調整到100微摩爾/升，得 到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品預處理待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品 一樣溶於水或緩衝液中；A. 3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品，其半乳糖濃度為0微摩爾/升；B、試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、半乳糖激酶、氨甲醯磷酸合成酶、異 檸檬酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽(磷酸根)、氨甲醯磷酸與酮戊二酸，然後將它們 混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0.1-0.35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、 l-100mmol/L,l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在 溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設 副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數據處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到
半乳糖的含量
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的半乳糖濃度測定方法，其測定的技術原理是根據 下述半乳糖激酶、氨甲醯磷酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶的系列催化反應完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸 2腺苷二磷酸+磷酸根+氨甲醯磷酸氨甲醯磷酸合成酶 2腺苷三磷酸+氨+ 二氧化碳+水二氧化碳+酮戊二酸+還原型輔酶異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸+輔酶
2.一種半乳糖的測定方法，其特徵在於該方法的步驟如下 2. 1樣品準備·2. 1. 1標準樣品的製備將一定量的半乳糖溶於水或緩衝液中，再將其濃度調整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測樣品預處理待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像製備標準樣品一樣 溶於水或緩衝液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩衝液作為空白樣品，其半乳糖濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的製備分別移取或稱取緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、半乳糖激酶、氨甲醯磷酸合成酶、異檸 檬酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽(磷酸根)、氨甲醯磷酸與酮戊二酸，然後將它們混 合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、 l-100mmol/L,l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；·2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫 度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設 副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；·2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩衝液作為空白溶液 的吸光度隨時間的變化；·2.6數據處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到 半乳糖的含量
3.根據權利要求1、2所述的測定方法，其特徵在於使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然後在下述條 件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副 波長405nm，被測半乳糖樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為負反應，延遲時 間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特徵在於，所述的穩定劑是一種或多種 選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩定劑；所述的 緩衝液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液、磷酸鹽緩衝液、咪唑-鹽酸 緩衝液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液、硼砂-鹽酸緩衝液、甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液、巴比妥 鈉-鹽酸緩衝液、硼酸-硼砂緩衝液、二乙醇胺緩衝液或「PBS」緩衝液的緩衝液；所述的還 原型輔酶是一種或多種選自NADPH、NADH或thio_NADH的還原型輔酶。
5.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特徵在於 5. 1所述的試劑溶液配製成如下單劑試劑它是由所述的緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、氨甲醯磷酸、酮 戊二酸、半乳糖激酶、氨甲醯磷酸合成酶與異檸檬酸脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配製成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、氨甲醯磷 酸與酮戊二酸組成的；試劑2，它是由所述的緩衝液、穩定劑、半乳糖激酶、氨甲醯磷酸合成酶與異檸檬酸脫氫 酶組成的；其中還原型輔酶、半乳糖激酶、氨甲醯磷酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價 磷酸鹽、氨甲醯磷酸、酮戊二酸在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配製成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、氨甲醯磷 酸與酮戊二酸組成的；試劑2，它是由所述的緩衝液、穩定劑、氨甲醯磷酸合成酶與異檸檬酸脫氫酶組成的；試劑3，它是由所述的緩衝液、穩定劑與半乳糖激酶組成的；其中還原型輔酶、半乳糖激酶、氨甲醯磷酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價 磷酸鹽、氨甲醯磷酸、酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種半乳糖診斷/測定試劑盒，其特徵在於6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度範圍的可直 接使用的液體試劑緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0.1-0. 35mmol/L半乳糖激酶1000-80000U/L氨甲醯磷酸合成酶1000-80000U/L異檸檬酸脫氫酶1000-80000U/L腺苷三磷酸l-100mmol/L單價磷酸鹽l-100mmol/L氨甲醯磷酸l-100mmol/L酮戊二酸l-100mmol/Lo6. 2根據權利要求6.1所述的半乳糖診斷組成如下的試劑1 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0. 001-7mol/L還原型輔酶0. 1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸l-100mmol/L單價磷酸鹽l-100mmol/L氨甲醯磷酸l-100mmol/L酮戊二酸l-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0. 001-7mol/L半乳糖激酶1000-80000U/L氨甲醯磷酸合成酶1000-80000U/L異檸檬酸脫氫酶1000-80000U/L。6. 3根據權利要求6.1所述的半乳糖診斷組成如下的試劑1 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0. 001-7mol/L還原型輔酶0. 1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸l-100mmol/L單價磷酸鹽l-100mmol/L氨甲醯磷酸l-100mmol/L酮戊二酸l-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0. 001-7mol/L氨甲醯磷酸合成酶1000-80000U/L異檸檬酸脫氫酶1000-80000U/L ；組成如下的試劑3 緩衝液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L半乳糖激酶1000-80000U/L。測定試劑盒，其特徵在於它有
全文摘要
本發明涉及利用酶比色法及酶聯法技術的半乳糖含量的測定方法、試劑的組成及成分，還涉及一種半乳糖診斷/測定試劑盒。本發明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用於臨床醫學/食品檢驗。
文檔編號C12Q1/54GK102087273SQ200910231960
公開日2011年6月8日 申請日期2009年12月4日 優先權日2009年12月4日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司