用於改良蛋白質性能的方法

2023-07-03 22:45:01

專利名稱：用於改良蛋白質性能的方法
技術領域：
本發明提供了用於改造蛋白質以優化其在某些目的環境條件下的性能的方法。在某些實施方案中，本發明提供了用於改造酶以優化其在特定環境條件下的催化活性的方 法。在某些優選實施方案中，本發明提供了用於改變酶(例如，金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白 酶)的淨表面電荷和/或表面電荷分布的方法，以獲得與起始或親本酶比較在洗滌劑製劑 中表現出改良性能的酶變體。
背景技術：
蛋白質在其天然環境外工作時，性質通常是次佳的。例如，酶(例如，蛋白酶、月旨 肪酶、澱粉酶、纖維素酶等)通常用於衣物洗滌劑中清潔織物上的汙漬，所述衣物洗滌劑一 般包括活性成分的複雜組合。事實上，大多數清潔用品包括表面活性劑系統、漂白劑、助洗 齊U、抑泡劑、汙垢懸浮劑、汙垢釋放劑、螢光增白劑、軟化劑、分散劑、染料轉移抑制化合物、 磨料、殺菌劑和香料，以及用於清潔的酶。因此，儘管目前洗滌劑的複雜性，但仍存在難以完 全去除的許多汙漬，部分原因就在於亞最佳的酶性能。儘管有許多酶開發研究，但本領域仍 需要改造蛋白質以用於特定用途和條件的方法。事實上，本領域仍需要快速且系統地修改 蛋白質的靜電性質以優化其在商業應用中的性能的方法。特別地，本領域仍需要改造在工 業上有用的酶的方法，所述酶包括但不限於脂肪酶、澱粉酶、角質酶、甘露聚糖酶、氧化還原 酶、纖維素酶、果膠酶、蛋白酶和其他酶，以便在清潔溶液中提供改良的活性、穩定性和溶解 性。發明概述本發明提供用於改造蛋白質以優化其在某些目的環境條件下的性能的方法。在某 些實施方案中，本發明提供用於改造酶以優化其在特定環境條件下的催化活性的方法。在 某些優選實施方案中，本發明提供用於改變酶(例如，金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶)的淨表 面電荷和/或表面電荷分布、以獲得與起始或親本酶比較在洗滌劑製劑中顯示改良性能的 酶變體的方法。在某些實施方案中，本發明提供用於在蛋白質，特別是酶中進行電荷置換的方法。 在某些優選實施方案中，本發明提供產生具有改良的洗滌性能的酶的方法。本發明可以用 於改造各種酶以及其他蛋白質。特別地，本發明可以用於開發改良的工業有用酶，所述工業 包括但不限於清潔(例如，衣物、餐具、硬表面等)。然而，本發明不旨在局限於任何具體酶 或蛋白質。本發明提供用於產生與親本中性金屬蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的中性金 屬蛋白酶變體的方法，其包括置換親本中性金屬蛋白酶中一個或多個位置處的胺基酸殘 基，以產生與親本比較具有更多正電荷或更多負電荷的中性金屬蛋白酶變體。在某些特別優選的實施方案中，該方法進一步包括通過比較親本和變體去除汙漬的能力，測試變體的 洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為值1.0，具有改良的洗滌性能的變體達到大於1. 0的 值。在進一步的實施方案中，本發明提供用於產生具有改良的洗滌性能的變體的方法。在 某些實施方案中，親本中性金屬蛋白酶是野生型成熟形式的中性金屬蛋白酶。在某些其他 實施方案中，變體衍生自芽孢桿菌科(Bacillaceae)中性金屬蛋白酶。在某些優選實施方 案中，變體衍生自芽孢桿菌屬(Bacillus)中性金屬蛋白酶。在某些特別優選的實施方案 中，洗滌性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液體洗滌劑組合物中進行測試。在某些優選實施 方案中，洗滌性能在具有鹼性PH的液體衣物洗滌劑中進行測試。在某些備選優選實施方案 中，親本中性金屬蛋白酶中的一個或多個位置是具有大於約50%的溶劑可及表面(SAS)的 位置。在某些另外的優選實施方案中，親本中性金屬蛋白酶中的一個或多個位置是具有大 於約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。本發明還提供用於產生與親本中性金屬蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的中性金屬蛋白酶變體的方法，其包括置換親本中性金屬蛋白酶中一個或多個位置處的胺基酸 殘基，以產生與親本比較具有更多正電荷或較少負電荷的中性金屬蛋白酶變體；和置換親 本中性金屬蛋白酶中一個或多個位置處的胺基酸殘基，以產生與親本比較具有更多負電荷 或較少正電荷的中性金屬蛋白酶變體。在某些特別優選的實施方案中，該方法進一步包括 通過比較親本和變體去除汙漬的能力，測試變體的洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為 值1.0，具有改良的洗滌性能的變體達到大於1. 0的值。在再其它實施方案中，該方法包括 產生具有改良的洗滌性能的變體。這些步驟旨在以任何合適的順序進行。在某些實施方案 中，親本中性金屬蛋白酶是野生型成熟形式的中性金屬蛋白酶。在某些其他實施方案中，變 體衍生自芽孢桿菌科中性金屬蛋白酶。在某些優選實施方案中，變體衍生自芽孢桿菌屬中 性金屬蛋白酶。在某些特別優選的實施方案中，洗滌性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液體 洗滌劑組合物中進行測試。在某些優選實施方案中，洗滌性能在具有鹼性PH的液體衣物洗 滌劑中進行測試。在某些備選優選實施方案中，親本中性金屬蛋白酶中的一個或多個位置 是具有大於約50%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某些另外的優選實施方案中，親本中 性金屬蛋白酶中的一個或多個位置是具有大於約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某 些優選實施方案中，至少一個酸性胺基酸殘基用至少一個鹼性胺基酸殘基置換，而在其他 實施方案中，至少一個酸性胺基酸殘基用至少一個中性胺基酸殘基置換，並且在某些另外 的實施方案中，至少一個中性胺基酸殘基用鹼性胺基酸殘基置換。在某些實施方案中，提供 各種置換組合。在另外的實施方案中，至少一個鹼性胺基酸殘基用至少一個酸性胺基酸殘 基置換，而在其他實施方案中，至少一個鹼性胺基酸殘基用至少一個中性胺基酸殘基置換， 並且在再其它實施方案中，至少一個中性胺基酸殘基用至少一個酸性胺基酸殘基置換。在 其他另外的實施方案中，親本中性金屬蛋白酶中的至少一個中性胺基酸殘基用至少一個中 性胺基酸殘基置換，以產生與親本比較具有相同電荷的中性金屬蛋白酶變體。本發明不旨 在局限於任何具體的置換組合。所述置換也不旨在以任何特定順序執行。本發明提供用於產生與親本絲氨酸蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的絲氨酸蛋 白酶變體的方法，其包括置換親本絲氨酸蛋白酶中一個或多個位置處的胺基酸殘基，以產 生與親本比較具有更多正電荷或更多負電荷的絲氨酸蛋白酶變體。在某些特別優選的實施 方案中，該方法進一步包括通過比較親本和變體去除汙漬的能力，測試變體的洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為值1.0，具有改良的洗滌性能的變體達到大於1. 0的值。在進一步 的實施方案中，本發明提供用於產生具有改良的洗滌性能的變體的方法。在某些實施方案 中，親本絲氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的絲氨酸蛋白酶。在某些其他實施方案中，變體衍 生自芽孢桿菌科絲氨酸蛋白酶。在某些優選實施方案中，變體衍生自芽孢桿菌屬絲氨酸蛋 白酶。在某些特別優選的實施方案中，洗滌性能在具有6. 5-12. OpH的粉末或液體洗滌劑組 合物中進行測試。在某些優選實施方案中，洗滌性能在具有鹼性PH的液體衣物洗滌劑中進 行測試。在某些備選優選實施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的一個或多個位置是具有大於 約50%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某些另外的優選實施方案中，親本絲氨酸蛋白酶 中的一個或多個位置是具有大於約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。本發明還提供用於產生與親本絲氨酸蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的絲氨酸蛋白酶變體的方法，其包括置換親本絲氨酸蛋白酶中一個或多個位置處的胺基酸殘基，以 產生與親本比較具有更多正電荷或較少負電荷的絲氨酸蛋白酶變體；和置換親本絲氨酸 蛋白酶中一個或多個位置處的胺基酸殘基，以產生與親本比較具有更多負電荷或較少正電 荷的絲氨酸蛋白酶變體。在某些特別優選的實施方案中，該方法進一步包括通過比較親本 和變體去除汙漬的能力，測試變體的洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為值1.0，具有改 良的洗滌性能的變體達到大於1.0的值。在再進一步的實施方案中，該方法包括產生具有 改良的洗滌性能的變體。所述步驟旨在以任何合適的順序進行。在某些實施方案中，親本 絲氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的絲氨酸蛋白酶。在某些其他實施方案中，變體衍生自微 球菌亞目(Micrococcineae)絲氨酸蛋白酶。在某些優選實施方案中，變體衍生自纖維單 胞菌屬(Cellulomonas)絲氨酸蛋白酶。在某些特別優選的實施方案中，洗滌性能在具有 6. 5-12. OpH的粉末或液體洗滌劑組合物中進行測試。在某些優選實施方案中，洗滌性能在 具有鹼性PH的液體衣物洗滌劑中進行測試。在某些備選優選實施方案中，親本絲氨酸蛋白 酶中的一個或多個位置是具有大於約50%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某些另外的 優選實施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的一個或多個位置是具有大於約65 %的溶劑可及表 面(SAS)的位置。在某些優選實施方案中，至少一個酸性胺基酸殘基用至少一個鹼性氨基 酸殘基置換，而在其他實施方案中，至少一個酸性胺基酸殘基用至少一個中性胺基酸殘基 置換，並且在某些另外的實施方案中，至少一個中性胺基酸殘基用鹼性胺基酸殘基置換。在 某些實施方案中，提供各種置換組合。在另外的實施方案中，至少一個鹼性胺基酸殘基用至 少一個酸性胺基酸殘基置換，而在其他實施方案中，至少一個鹼性胺基酸殘基用至少一個 中性胺基酸殘基置換，並且在再其它實施方案中，至少一個中性胺基酸殘基用至少一個酸 性胺基酸殘基置換。在其他另外的實施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的至少一個中性氨基 酸殘基用至少一個中性胺基酸殘基置換，以產生與親本比較具有相同電荷的絲氨酸蛋白酶 變體。本發明不旨在局限於任何具體的置換組合。這些置換也不旨在以任何特定的順序執 行。本發明還提供用於產生與親本絲氨酸蛋白酶比較，具有改良的洗滌性能的絲氨酸 蛋白酶變體的方法，其包括置換親本絲氨酸蛋白酶中一個或多個位置處的胺基酸殘基，以 產生與親本比較具有更多正電荷或較少負電荷的絲氨酸蛋白酶變體；置換親本絲氨酸蛋白 酶中一個或多個位置處的胺基酸殘基，以產生與親本比較具有更多負電荷或較少正電荷的 絲氨酸蛋白酶變體；和獲得通過這些步驟產生的絲氨酸蛋白酶變體。在另外的實施方案中，該方法包括通過比較親本和變體去除汙漬的能力，測試變體的洗滌性能，其中親本的洗滌性能被定為值1.0，具有改良的洗滌性能的變體達到大於1. 0的值。在進一步的實施方案 中，該方法包括產生具有改良的洗滌性能的變體。所述步驟旨在以任何合適的順序進行。在 某些實施方案中，親本絲氨酸蛋白酶是野生型成熟形式的絲氨酸蛋白酶。在某些其他實施 方案中，變體衍生自微球菌亞目絲氨酸蛋白酶。在某些優選實施方案中，變體衍生自纖維單 胞菌屬絲氨酸蛋白酶。在某些特別優選的實施方案中，洗滌性能在具有6. 5-12. OpH的粉末 或液體洗滌劑組合物中進行測試。在某些優選實施方案中，洗滌性能在具有鹼性PH的液體 衣物洗滌劑中進行測試。在某些備選優選實施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的一個或多個 位置是具有大於約50%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在某些另外的優選實施方案中，親 本絲氨酸蛋白酶中的一個或多個位置是具有大於約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置。在 某些優選實施方案中，至少一個酸性胺基酸殘基用至少一個鹼性胺基酸殘基置換，而在其 他實施方案中，至少一個酸性胺基酸殘基用至少一個中性胺基酸殘基置換，並且在某些另 外的實施方案中，至少一個中性胺基酸殘基用鹼性胺基酸殘基置換。在某些實施方案中，提 供各種置換組合。在另外的實施方案中，至少一個鹼性胺基酸殘基用至少一個酸性胺基酸 殘基置換，而在其他實施方案中，至少一個鹼性胺基酸殘基用至少一個中性胺基酸殘基置 換，並且在再其它實施方案中，至少一個中性胺基酸殘基用至少一個酸性胺基酸殘基置換。 在其他另外的實施方案中，親本絲氨酸蛋白酶中的至少一個中性胺基酸殘基用至少一個中 性胺基酸殘基置換，以產生與親本比較具有相同電荷的絲氨酸蛋白酶變體。本發明不旨在 局限於任何具體的置換組合。這些置換也不旨在以任何特定的順序執行。本發明提供用於產生與親本蛋白質比較，具有改良的洗滌性能的至少一種蛋白 質變體的方法，其包括修飾親本蛋白質中一個或多個位置處的至少一個胺基酸殘基，以產 生與親本蛋白質比較，具有更多正電荷、更多負電荷、更少正電荷或更少負電荷的至少一種 蛋白質變體。在某些實施方案中，所述修飾包括置換、添加和/或缺失，而在其他實施方 案中，修飾包括化學修飾。在某些實施方案中，蛋白質是酶。在某些特別優選的實施方案 中，酶是蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質酶、果膠酶、氧化酶、轉移酶、 alkalase或過氧化氫酶。在某些進一步特別優選的實施方案中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶或 中性金屬蛋白酶。在某些另外的實施方案中，使用至少一種目的測驗，評估至少一種蛋白 質變體的性能。在某些進一步的實施方案中，所述至少一種目的測驗包括測量底物結合、 酶抑制、表達水平、洗滌劑穩定性、熱穩定性、反應速率、反應進度(extentof reaction)、熱 活性、澱粉液化、酯水解、酶促漂白、洗滌性能、生物質降解、溶解性、螯合劑穩定性和/或糖 化。在某些其他另外的實施方案中，與親本蛋白質比較，至少一種蛋白質變體在至少一種目 的測驗中顯示改良的性能。本發明還提供用於產生與親本酶比較，具有改良的洗滌性能的至少一種酶變體的 方法，其包括修飾親本酶中一個或多個位置處的至少一個胺基酸殘基，以產生與親本酶比 較，具有更多正電荷、更多負電荷、更少正電荷或更少負電荷的至少一種酶變體。在某些實 施方案中，修飾包括置換、添加和/或缺失，而在備選實施方案中，修飾包括化學修飾。在某 些另外的實施方案中，該方法進一步包括測試酶變體和親本酶的洗滌性能，以提供關於酶 變體和親本酶的性能指數。在某些實施方案中，酶變體的性能指數具有大於1.0的值，而親 本酶的洗滌性能具有1.0的性能指數。在某些特別優選的實施方案中，該方法進一步包括產生具有改良的洗滌性能的變體酶。在某些另外的實施方案中，酶是蛋白酶、澱粉酶、纖維 素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質酶、果膠酶、氧化酶、轉移酶、alkalase或過氧化氫酶。在某 些優選實施方案中，蛋白酶是絲氨酸蛋白酶或中性金屬蛋白酶。在某些特別優選的實施方 案中，蛋白酶是芽孢桿菌屬蛋白酶。在某些再進一步的實施方案中，洗滌性能在具有5-12. O 的PH的粉末或液體洗滌劑組合物中進行測試。在某些實施方案中，洗滌性能在具有鹼性PH 的液體衣物洗滌劑中進行測試，而在某些其他實施方案中，洗滌性能在包含鹼性PH的冷水液體洗滌劑中進行測試。在某些實施方案中，置換發生在親本酶中具有大於約25%的溶劑 可及表面(SAS)的位置中。在某些進一步的實施方案中，置換發生在親本酶中具有大於約 50%或大於約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置中。本發明還提供用於產生與親本酶比較，具有改良的洗滌性能的酶變體的方法，其 包括a)修飾親本酶中一個或多個位置處的至少一個胺基酸殘基，以產生與親本酶比較， 具有更多正電荷、更多負電荷、更少正電荷或更少負電荷的第一酶變體；和b)修飾親本酶 中一個或多個位置處的至少一個胺基酸殘基，以產生與親本酶比較，具有更多正電荷、更多 負電荷、更少正電荷或更少負電荷的第二酶變體。在某些實施方案中，修飾包括置換、添加 和/或缺失，而在其他實施方案中，修飾包括化學修飾。在某些另外的實施方案中，重複這 些步驟以產生多種酶變體。在某些進一步的實施方案中，親本酶是蛋白酶、澱粉酶、纖維素 酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質酶、果膠酶、氧化酶、轉移酶、alkalase或過氧化氫酶。在某 些優選實施方案中，蛋白酶是中性金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶。在某些特別優選的實施方 案中，親本酶是芽孢桿菌屬蛋白酶。在某些進一步的實施方案中，該方法進一步包括測試變 體酶和親本酶的洗滌性能，並且在該洗滌性能測驗中比較親本和變體酶去除汙漬的能力， 其中親本酶的洗滌性能被定為值1. 0，具有改良的洗滌性能的變體酶達到大於1. 0的值。在 某些實施方案中，該方法進一步包括產生與親本酶比較具有改良的洗滌性能的酶變體。在 某些優選實施方案中，親本酶是絲氨酸蛋白酶。在某些特別優選的實施方案中，絲氨酸蛋白 酶是芽孢桿菌屬絲氨酸蛋白酶或纖維單胞菌屬絲氨酸蛋白酶。在某些進一步的實施方案 中，洗滌性能在具有5-12. 0的pH的粉末或液體洗滌劑組合物中進行測試。在某些另外的 實施方案中，洗滌性能在具有鹼性PH的液體衣物洗滌劑中進行測試。在再進一步的實施方 案中，洗滌性能在包含鹼性PH的冷水液體洗滌劑中進行測試。在某些備選實施方案中，置 換發生在親本酶中具有大於約25%的溶劑可及表面(SAS)的位置中，而在某些其他實施方 案中，置換發生在親本酶中具有大於約50%或大於約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置 中。在某些實施方案中，至少一個酸性胺基酸殘基用至少一個鹼性胺基酸殘基置換，而在其 他實施方案中，至少一個酸性胺基酸殘基用至少一個中性胺基酸殘基置換，至少一個中性 胺基酸殘基用至少一個鹼性胺基酸殘基置換，至少一個鹼性胺基酸殘基用至少一個酸性氨 基酸殘基置換，至少一個鹼性胺基酸殘基用至少一個中性胺基酸殘基置換，至少一個中性 胺基酸殘基用至少一個酸性胺基酸殘基置換，和/或親本酶中的至少一個中性胺基酸殘基 用至少一個中性胺基酸殘基置換以產生與親本酶比較具有相同電荷的酶變體。本發明旨在 按需使用任何合適的置換組合。本發明還提供用於產生與親本蛋白質比較，具有改良的洗滌性能的至少一種蛋白 質變體的方法，其包括修飾親本蛋白質中一個或多個位置處的至少一個胺基酸殘基，以產 生與親本蛋白質比較，具有更多正電荷、更多負電荷、更少正電荷或更少負電荷的至少一種蛋白質變體，並且其中該一個或多個位置具有大於約25%的溶劑可及表面(SAS)。在某些 實施方案中，一個或多個位置在包含親本蛋白質和至少一種另外蛋白質的同源蛋白質序列 胺基酸比對中是非保守的。在某些優選實施方案中，親本蛋白質是酶。在某些特別優選的實 施方案中，酶是蛋白酶、澱粉酶、纖維素酶、聚酯酶、酯酶、脂肪酶、角質酶、果膠酶、氧化酶、 轉移酶、alkalase或過氧化氫酶。在某些進一步的實施方案中，改良的性能包括選自下述的 一種或多種性能的增加底物結合、酶抑制、表達、洗滌劑中的穩定性、熱穩定性、反應速率、 反應進度、熱活性、澱粉液化、生物質降解、糖化、酯水解、酶促漂白、洗滌性能、溶解性、螯合 劑穩定性和/或紡織品變性(textilemodification)。在某些另外的實施方案中，修飾包括 置換、添加和/或缺失，而在其他實施方案中，修飾包括化學修飾。在某些實施方案中，至少 一個置換包含，相對於親本蛋白質，0、-1或-2的淨電荷改變，而在其他實施方案中，至少一 個置換包含，相對於親本蛋白質，+1或+2的淨電荷改變。在某些進一步的實施方案中，親 本蛋白質中的至少一個置換包含O、-1或-2的電荷改變，並且其中親本蛋白質中的至少一 個另外置換包含，相對於親本蛋白質，+1或+2的電荷改變。在某些備選實施方案中，相對於親本蛋白質，蛋白質變體具有+1或+2的淨電荷改變，而在其他實施方案中，相對於親本 蛋白質，蛋白質變體具有0、-1或-2的淨電荷改變。在某些另外的實施方案中，置換發生在 親本酶中具有大於約50%或大於約65%的溶劑可及表面(SAS)的位置中。附圖簡述圖IA描述了在AATCC液體洗滌劑(實心三角)以及匹配pH和傳導性的緩衝液 (空心三角)(5mM HEPES pH8. 0,2. 5mM NaCl)中測量的，隨著相對於野生型ASP的淨電荷改 變，ASP變體的血液、乳、墨(BMI)微型布樣(microswatch)相對活性(基於最佳性能者進行 標準化後)。相似地，圖IB描述了隨著相對於野生型的電荷改變，ASP組合電荷文庫(CCL) 的BMI微型布樣相對活性。圖2描述了在具有各種NaCl濃度——2. 5mM(空心圓圈)、16mM(灰色圓圈)禾口 IOOmM(黑色圓圈)——的5mM HEPES pH8. 0中測量的，隨著相對於野生型ASP的電荷改變， ASP變體的相對BMI微型布樣活性(基於最佳性能者進行標準化後)。圖3A描述了隨著電荷改變，FNA CCL在北美衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。相似 地，圖3B描述了隨著電荷改變，GG36 CCL在北美衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。圖4A描述了隨著電荷改變，FNA CCL在西歐液體衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。 相似地，圖4B描述了隨著電荷改變，GG36 CCL在西歐液體衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。圖5A描述了隨著電荷改變，FNA CCL在日本粉末衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。 相似地，圖5B描述了隨著電荷改變，GG36 CCL在日本粉末衣物洗滌劑中的BMI清潔性能。圖6A描述了隨著電荷改變，FNA CCL在自動餐具洗滌的洗滌劑中的烤蛋黃清潔性 能。相似地，圖6B描述了隨著電荷改變，GG36 CCL在自動餐具洗滌的洗滌劑中的烤蛋黃清 潔性能。圖7A描述了隨著電荷改變，AmyS-S242Q CCL在BODIPY澱粉上的比酶活性。類似 地，圖7B針對與親本AmyS酶相比跨越-12至+4的電荷改變梯度的AmyS表面電荷變體，描 述了玉米澱粉液化後的粘度。圖8描述了隨著相對於野生型ASP的淨電荷改變，ASP變體在枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)中的表達水平。
圖9描述了隨著相對於親本FNA的淨電荷改變，FNA變體的LAS/EDTA穩定性。

圖10描述了隨著相對於野生型ASP的淨電荷改變，ASP變體的熱穩定性。圖11描述了隨著相對於野生型AmyS的電荷改變，第一 AmyS電荷梯的熱穩定性。圖12提供隨著pH的改變，第一 AmyS電荷梯的稻澱粉清潔活性。pH3. 0-4. 25是 200mM 甲酸鈉 +0. 01% Tween-80。pH4. 25-5. 5 是 200mM 乙酸鈉 +0. 01% Tween-80。數據擬 合成滴定曲線，各自具有單個pKa值。圖13提供依據相對於野生型AmyS的電荷改變繪製的在圖12中測定的pKa值。發明_既述本發明提供用於改造蛋白質以優化其在某些目的環境條件下的性能的方法。在某 些實施方案中，本發明提供用於改造酶以優化其在特定環境條件下的催化活性的方法。在 某些優選實施方案中，本發明提供用於改變酶(例如，金屬蛋白酶或絲氨酸蛋白酶)的淨表 面電荷和/或表面電荷分布的方法，以獲得與起始或親本酶比較在洗滌劑製劑中顯示改良 性能的酶變體。蛋白酶枯草桿菌蛋白酶是在衣物洗滌劑中使用的主要酶，並且可能是全世界最廣 泛使用的酶。大約20年前，注意到表面靜電效應可能調節枯草桿菌蛋白酶的催化活性(參 見例如，Russell和Fersht，Nature 328 :496_500[1987])。較為近來，觀察到涉及改變枯 草桿菌蛋白酶的淨電荷的突變顯著影響在洗滌劑中的洗滌性能(參見例如，引入本文作為 參考的EP專利號0479870B1)。這個有利效應被認為是使枯草桿菌蛋白酶pi (等電點)朝 向洗滌液的PH遷移的結果。然而，隨後的工作證實這個結論並非總是適用(參見例如，引 入本文作為參考的美國專利號6，673，590B1)。如本專利中指出的，枯草桿菌蛋白酶中電荷 突變的效應顯著地依賴於洗滌劑濃度，其中降低親本枯草桿菌蛋白酶的pi的突變提供在 低洗滌劑濃度下更有效的酶，而提高pi的突變提供在高洗滌劑濃度下更有效的酶。這具有 極大用途，因為洗滌液中的洗滌劑濃度在全世界範圍內變化極大。因此，對於本領域技術人 員已經顯而易見的是，對於枯草桿菌蛋白酶的洗滌性能，存在依賴於洗滌液中的pH和洗滌 劑濃度的最適pi。改善枯草桿菌蛋白酶在衣物洗滌劑中的活性的其它努力已經描述(參見 美國專利
發明者A·肖, J·T·小凱利斯, L·G·卡斯考-佩雷拉, W·埃赫勒 申請人:丹尼斯科美國公司