在表面活性劑存在下穩定的膽固醇氧化酶的製作方法

2023-07-04 16:00:01

專利名稱：在表面活性劑存在下穩定的膽固醇氧化酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及表面活性劑存在下具有穩定性的一種新的膽固醇氧化酶以及編碼這種新的膽固醇氧化酶的基因。
背景技術：
膽固醇氧化酶是一種催化3β-羥類固醇與氧之間的反應從而形成相應的3-氧類固醇與過氧化氫的氧化酶。到目前為止它的研究與開發目的是將其應用於測定體液的膽固醇濃度(例如，JP-A-6-169765)、生產膽固醇衍生物(例如，JP-A-6-113883)、殺蟲劑(例如，美國專利5,558,862)、去汙劑(例如，WO 89/09813)等。
眾所周知所述酶由諸如鏈黴菌屬(例如，JP-A-62-285789(對應於EP-A-0560983))、短桿菌屬(例如，JP-A-4-218367(對應於EP-A-0452112))、紅球菌屬(例如，JP-T-3-503487(對應於WO 90/05788))與假單胞菌屬(例如，JP-A-6-189754)的許多屬的微生物產生。
從洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderia cepacia)ST-200(根據舊的分類標準屬於假單胞菌屬ST-200，於1998年2月4日保藏National Instituteof Bioscience and Human Technology(NIBH)、Ministry of InternationalTrade and Industry(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，保藏號為FERM MP-6661)(例如，日本專利號3,241,712(對應於US-A-2003/153051))分離的膽固醇氧化酶的特徵在於當膽固醇用作底物時與迄今已知的其他膽固醇氧化酶相比它的產物是不同的，它的反應機理是不同的，並且它具有較高的有機溶劑抗性和溫度穩定性。因為來源于洋蔥伯克霍爾德菌ST-200的膽固醇氧化酶的基因已經被克隆，所以可通過分泌或者細胞內的累積在不同的宿主中高水平生產重組膽固醇氧化酶(例如，JP-A-2002-65271)。
在用於臨床診斷的試劑中使用的酶所需的特性是在大多數情況下對對象的高反應性和特異性以及影響產物保存穩定性的熱穩定性，但是在測定膽固醇的情況下，為了高特異性測定對象的目的，經常以高濃度表面活性劑開處方，因此除上述特性之外，與表面活性劑共存的保存穩定性對於所使用的酶同樣非常需要。雖然來源于洋蔥伯克霍爾德菌ST-200的膽固醇氧化酶具有上述的優良特性，但是這種酶在與表面活性劑共存的保存穩定性方面較差，因此難以將這種酶應用於膽固醇測定試劑。
在用於膽固醇測定系統的表面活性劑中，1-戊基磺酸鹽、1-己基磺酸鹽、1-庚基磺酸鹽、1-辛基磺酸鹽、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽、十二烷基苯磺酸鈉、膽酸鹽(膽酸鈉)、膽酸、脫氫膽酸鹽、脫氧膽酸、脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、N，N-雙(3-D-葡糖醯氨基丙基(gluconamidopropyl))膽醯胺、N，N-雙-3-D-葡糖醯氨基丙基膽醯胺、十二烷基苯磺酸鈉、月桂醯肌氨酸等用作陰離子表面活性劑(例如，JP-A-8-116996，日本專利2,799,835(對應於JP-A-7-13607)，JP-A-11-56395，JP-A-2000-60600(對應於EP-A-0964249)，JP-A-2002-142799(對應於EP-A-1342792)，日本專利3,529,081(對應於JP-A-10-232219)，JP-A-10-84997(對應於EP-A-0821239)。此外正-氯化十二烷基三甲銨、氯化十六烷基吡啶鎓等用作陽離子表面活性劑(例如，JP-A-10-84997(對應於EP-A-0821239))。
聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物、醯基聚氧乙烯山梨聚糖酯、烷基聚氧乙烯醚、正-十二烷基-β-右旋麥芽糖苷、蔗糖單月桂酸酯、聚氧乙烯月桂基醚、聚氧乙烯烷撐苯基醚、聚氧乙烯烷撐三苄基苯基醚、聚氧乙烯甘油p-t-辛基苯基醚、聚氧乙烯高級醇醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、甘油脂肪酸酯、n-辛基-β-右旋硫葡糖苷、十六烷基醚(C16)、月桂基醚(C12)、油基醚、二十二烷基醚(C20)、聚氧乙烯單月桂酸酯等作為非離子型表面活性劑使用(例如，日本專利2,799,835(對應於JP-A-7-13607)，JP-A-11-56395，JP-A-2000-60600(對應於EP-A-0964249)，JP-A-2002-142799(對應於EP-A-1342792)，日本專利3,529,081(對應於JP-A-10-232219)，JP-A-10-84997(對應於EP-A-0821239)，JP-A-2000-325097，JP-A-2001-124780，JP-A-2000-116400，JP-A-9-299，JP-A-2001-346598，JP-A-9-224697，日本專利3,193,634(對應於JP-A-9-313200)，JP-A-10-210999)。
此外，甜菜鹼衍生物、烷基甜菜鹼衍生物、咪唑甜菜鹼衍生物、硫甜菜鹼衍生物、氨基羧酸衍生物、咪唑啉衍生物、胺oxanoide衍生物、膽汁酸衍生物等用作兩性表面活性劑(例如，JP-A-2000-60600(對應於EP-A-0964249)，JP-A-10-84997(對應於EP-A-0821239)，JP-A-2000-325097，JP-A-2001-124780)。

發明內容
本發明的目的是通過克服來源于洋蔥伯克霍爾德菌ST-200的傳統膽固醇氧化酶的缺點，提供在表面活性劑存在下具有高穩定性的膽固醇氧化酶與編碼該酶的基因。
本發明的這個及其他目標通過在表面活性劑存在下具有穩定性的新膽固醇氧化酶與編碼該新膽固醇氧化酶的基因得以實現。


圖1是顯示本發明的氧化酶的最適pH的圖表。
圖2是顯示本發明的氧化酶最適反應溫度範圍的圖表。
圖3是顯示本發明的氧化酶的穩定pH值範圍的圖表。
圖4是顯示本發明的氧化酶的熱穩定性的圖表。
具體實施例方式
為了解決上述問題本發明者進行了深入細緻的研究並發現由經修飾的來源于洋蔥伯克霍爾德菌ST-200(在JP-A-2002-65271中描述的)的膽固醇氧化酶基因可以獲得在表面活性劑存在下具有高穩定性的新的膽固醇氧化酶並因此完成了本發明。
也就是說本發明涉及以下(1)至(3)(1)一種新的具有以下物理化學特性的膽固醇氧化酶，其中的膽固醇氧化酶對表面活性劑具有提高的穩定性(a)作用與底物特異性其作用於膽固醇將其轉換成膽甾-5-烯-3-酮；其作用於膽甾-5-烯-3-酮並將其轉換成6β-全羥基膽甾-4-烯-3-酮；其作用於3β-甾醇而不作用於3α-羥基類固醇，以及(b)分子量約60,000(SDS-PAGE)。
(2)一種具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質，所述蛋白質是選自以下(a)至(f)的蛋白質(a)包含SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的蛋白質，(b)由在SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入的胺基酸序列組成並且具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質，(c)由與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有80％或更高同源性的胺基酸序列組成並具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質，(d)包含SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質，(e)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入的胺基酸序列組成並且具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質，以及(f)由與SEQ ID NO5所示的胺基酸序列具有80％或更高同源性的胺基酸序列組成並具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質。
(3)選自以下(a)至(f)的DNA的基因(a)包含SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA，(b)嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列組成的全長DNA，與由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列組成的DNA中連續15個或更多鹼基，或與由其互補核苷酸序列組成的DNA雜交並編碼具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質的DNA，(c)與由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列組成的全長DNA，或與SEQ ID NO4所示的核苷酸序列中的連續15個或更多鹼基具有80％或更高同源性並且編碼具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質的DNA，(d)包含SEQ ID NO6所示的核苷酸序列的DNA，(e)嚴格條件下與由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列組成的全長DNA，與由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列組成的DNA中連續15個或更多鹼基，或與由其互補核苷酸序列組成的DNA雜交，並且編碼具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質的DNA，以及(f)與由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列組成的全長DNA，或與由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列組成的DNA中連續15個或更多鹼基具有80％或更高同源性並且編碼具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質的DNA。
在本發明中提供了一種對表面活性劑具有進一步高的穩定性的膽固醇氧化酶，所述膽固醇氧化酶工業上可作為一種酶應用於試劑中用於臨床診斷，本發明還提供了編碼該酶的基因。
本發明的新膽固醇氧化酶(以下簡稱「本發明的氧化酶」)是具有以下物理化學特性的膽固醇氧化酶，其中其在表面活性劑存在下的保存穩定性得以提高(a)作用與底物特異性其作用於膽固醇將其轉化成膽甾-5-烯-3-酮；其作用於膽甾-5-烯-3-酮並將其轉化成6β-全羥基膽甾-4-烯-3-酮；其作用於3β-甾醇，但不作用於3α-羥基類固醇，並且(b)分子量約60,000(SDS-PAGE)。
利用Multigel 10/20(Daiichi Pure Chemicals生產)通過SDS-PAGE常規方法獲得分子量。
因此，本發明的氧化酶在物理化學的特性方面與任何一種傳統膽固醇氧化酶均不同並因此是一種新的膽固醇氧化酶。所以，本發明的氧化酶作為一種具有優良保存穩定性的酶可用於試劑盒試劑用於臨床診斷。
作為本發明的氧化酶，可以舉例說明來源於通過從自然界篩選獲得的不同生物的氧化酶與通過修飾傳統已知的膽固醇氧化酶獲得的氧化酶，並且可以引用例如下列本發明(c)，(d)，(e)，(f)，(g)或(h)的氧化酶(c)包含SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的膽固醇氧化酶；(d)由在SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入的胺基酸序列組成的膽固醇氧化酶；(e)由與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有80％或更高同源性的胺基酸序列組成的膽固醇氧化酶；(f)包含SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的膽固醇氧化酶；(g)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入的胺基酸序列組成的膽固醇氧化酶；(h)由與SEQ ID NO5所示的胺基酸序列具有80％或更高同源性的胺基酸序列組成的膽固醇氧化酶。
在這方面，術語「至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入」是指一個到幾個胺基酸的缺失、取代、添加和/或插入，例如從1到20個，優選從1到10個，更優選從1到5個胺基酸的缺失、取代、添加和/或插入。此外，術語「具有80％或更高的同源性」沒有特定限制，只要它與由SEQ ID NO2或者5所示的胺基酸序列的同源性是80％或更高，同源性是例如80％或更高，優選90％或更高，並且最優選95％或更高。
作為編碼本發明新膽固醇氧化酶基因(以下簡稱「本發明的基因」)的膽固醇氧化酶基因可以進行引用編碼上述本發明(c)，(d)，(e)，(f)，(g)或(h)的氧化酶的基因與包含以下(a)，(b)，(c)，(d)，(e)或(f)的DNA，編碼本發明的氧化酶的基因
(a)包含SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA；(b)由嚴格條件下與SEQ ID NO4所示的核苷酸序列全長，與SEQID NO4所示的核苷酸序列中連續15個或更多鹼基，或者與其互補的核苷酸序列雜交的核苷酸序列組成的DNA；(c)由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的全長或與SEQ ID NO4所示的核苷酸序列中連續15個或更多鹼基有80％或更高同源性的核苷酸序列組成的DNA；(d)包含SEQ ID NO6所示的核苷酸序列的DNA；(e)由嚴格條件下與SEQ ID NO6所示的核苷酸序列的全長，在SEQID NO6所示的核苷酸序列中連續15個或更多鹼基，或者與其互補的核苷酸序列雜交的核苷酸序列組成的DNA；(f)由與SEQ ID NO6所示的核苷酸序列的全長或與SEQ ID NO6所示的核苷酸序列中連續15個或更多鹼基有80％或更高同源性的核苷酸序列組成的DNA在這方面，術語「嚴格條件下雜交的DNA」是指利用DNA作為探針通過使用集落雜交、噬斑雜交、Southern印跡雜交等獲得的DNA，並且可以具體列舉滿足如下條件的DNA通過利用其上固定有來源於集落或者噬菌斑或者DNA樣本片段的DNA樣本的濾膜在65℃進行雜交，然後在65℃衝洗濾膜進行鑑定的DNA。雜交可以根據在Current Protocolsin Molecular Biology(WILEY Interscience，1989)描述等方法進行。作為嚴格條件下雜交的DNA，可以具體列舉與用作探針的DNA的核苷酸序列具有某一水平同源性的DNA。「由與核苷酸序列的全長或者與在核苷酸序列中連續15個或更多鹼基具有80％或更高同源性的核苷酸序列組成的DNA」同源性根據本發明例如為80％或更高，優選90％或更高，最優選95％或更高。
接下來，描述獲得本發明的氧化酶與本發明的基因的方法。
本發明的氧化酶可以通過篩選來源於微生物、動物或者植物的酶從自然界獲得。此外，本發明的氧化酶也可以通過利用遺傳工程技術、突變處理等修飾具有不同於本發明的酶的物理化學特性的膽固醇氧化酶(以下簡稱「具有不同特性的氧化酶」)來獲得。根據本發明的具有不同特性的氧化酶，可以列舉上面描述的傳統已知的氧化酶，但是同樣可以是通過篩選新獲得的膽固醇氧化酶或者通過遺傳工程技術進行修飾獲得的膽固醇氧化酶。例如來源于洋蔥伯克霍爾德菌ST-200(描述在日本專利3,241,712(對應於US-A-2003/153051)中與JP-A-2002-65271中的)等可以作為傳統已知的氧化酶引用。上述膽固醇氧化酶本來是具有信號序列的分泌性蛋白質，但是也可通過阻斷信號序列來使用或者可以通過除去信號序列在細胞內生成。
修飾具有不同特性氧化酶的物理化學特性的方法的實例包括通過對能夠生產氧化酶的微生物施用紫外線、X-射線或者輻射，或者通過使諸如甲基磺酸乙酯、N-甲基-N』-硝基亞硝基胍或者亞硝酸的誘變劑與微生物接觸獲得能夠產生本發明修飾的氧化酶的微生物並由所獲得的微生物獲得本發明的氧化酶的方法。
然而，概括而言，本發明的氧化酶可以利用遺傳工程通過修飾編碼具有不同特性的氧化酶的基因來獲得。作為編碼具有不同特性用於本發明的氧化酶的基因，可以使用任一編碼膽固醇氧化酶的基因，條件是通過其的修飾可以獲得本發明的氧化酶的基因。
為了獲得編碼具有不同特性，用於本發明的氧化酶的基因，使用通常所用的基因克隆方法。例如，通過諸如在Current Protocols inMolecular Biology(WILEY Interscience，1989)描述的通常方法從能夠產生具有不同的特性的氧化酶的微生物細胞或者多種其他細胞中提取染色體DNA或者mRNA。此外利用mRNA作為模板可以合成cDNA。製備因此獲得的染色體DNA或者cDNA的文庫。然後，可以通過在根據上述具有不同的特性的氧化酶的胺基酸序列合成合適的探針DNA，並利用這個探針從染色體DNA或者cDNA文庫篩選的目的基因的方法或者通過根據上述胺基酸序列製備的合適的引物DNA，利用這些引物通過實施合適的聚合酶鏈式反應(PCR)諸如5』RACE，3』RACE擴增包含目的基因片段的DNA片段然後連接這些片段的方法獲得包含目的基因的全長DNA。作為以這種方式獲得的編碼具有不同特性的氧化酶的基因的優選實例，可以列舉來源于洋蔥伯克霍爾德菌ST-200的膽固醇氧化酶基因(JP-A-2002-65271中描述的)等。從處理的觀點看需要這些基因以常規方法與不同的載體連接，並且可以利用例如QIAGEN(由Qiagen生產)從包含編碼來源於分離的洋蔥伯克霍爾德菌ST-200具有不同的特性的氧化酶的基因的重組質粒pCox4DNA(在JP-A-2002-65271中描述)中提取和純化來獲得。在這方面，可用於本發明的載體DNA不限於上述的質粒載體DNA，也可以使用諸如質粒載體DNA、噬菌體載體DNA等的其它質粒載體DNA。具體而言，優選例如pBluescript II SK+(由STRATAGENE生產)等。
其次，本發明的氧化酶可以通過修飾由上述方法獲得的編碼具有不同特性的氧化酶的基因來獲得。也就是說，根據本發明，通過修飾編碼具有不同特性的氧化酶的基因，由該基因翻譯的具有不同特性的氧化酶的胺基酸序列得以修飾。結果，獲得了與修飾之前的具有不同特性的氧化酶不同，包括本發明的氧化酶在內具有不同特性的多種膽固醇氧化酶。
編碼具有不同特性的氧化酶的用於修飾的基因沒有特定限制，但是來源于洋蔥伯克霍爾德菌ST-200編碼具有不同特性的氧化酶的基因(JP-A-2002-65271，SEQ ID NO3)等可以作為本發明的實施方案的實例。此外，為了在宿主生物體中表達該基因，以胺基酸殘基未添加、缺失、取代和/或插入，或者添加、缺失、取代、和/或插入的方式修飾的核苷酸序列的基因同樣可以作為實例。
作為修飾上述基因的方法，可以使用任一傳統已知的方法，並且其實例包括使諸如羥胺或者亞硝酸的化學誘變劑與上述重組質粒pCox4 DNA(描述在JP-A-2002-65271中)接觸的方法，諸如利用PCR方法隨機轉化的點突變方法，通常已知的利用市售的試劑盒產生定位取代或者缺失突變的定位誘變方法，以及其中選擇性切割重組質粒DNA，從其中除去或者向其中田間所選擇的寡聚核苷酸，然後進行連接，即寡核苷酸誘變的方法。隨後，在上述處理之後利用脫鹽柱，QIAGEN(由Qiagen生產)等純化重組DNA來獲得不同的重組DNA樣品。在這種情況下，使用通過從pCox4 DNA除去編碼膽固醇氧化酶的氨基末端側信號序列並作為代替向其添加編碼起始甲硫氨酸的ATG製備的重組DNA或者通過用氨基末端側-編碼的核苷酸序列取代適於在諸如大腸桿菌的宿主生物中表達的序列製備的重組DNA是有效的。
例如，利用以這樣的方式獲得的多種重組體DNA，通過轉化或者轉導大腸桿菌K12，優選大腸桿菌JM109或者DH5α(兩者均由TOYOBO生產)、XL-Blue(由Funakoshi生產)等，可以獲得包含具有修飾的膽固醇氧化酶基因片段的不同種類的重組DNA的轉化或者轉導產物。而後，對轉化體而言，例如從所獲得的轉化體(其中包括含有不同種類的突變膽固醇氧化酶基因的重組質粒DNA分子)中選擇在表面活性劑存在下具有穩定性的本發明的目的轉化體(本發明的氧化酶生產菌株)。
下面，為了選擇本發明的氧化酶生產菌株，例如可以採用下列的方法。首先，將所獲得的上述轉化體的菌落接種到無菌LB液體培養基中並在加入-氨苄青黴素的無菌96-孔平板上傳代培養。當生長充分時，向其中加入諸如溶菌酶的裂解劑並在37℃靜置大約1小時用於細胞裂解。當細胞裂解時，將含有合適的表面活性劑與0.2％小牛血清白蛋白的0.1M MES緩衝液(pH 7.0)以50μl分配在96-孔平板的孔內，向每個孔內加入裂解的培養液，並在37℃處理5小時。而後，加入含有作為底物的膽固醇、Triton X-100、膽酸鈉、過氧化物酶、苯酚與4-aminoantipyrine的0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)直至100μl，並觀察紅紫色顏色顯色的程度。對在修飾之前的具有不同特性的氧化酶生產菌株通過相同的方法進行顯色試驗，並通過比較結果選擇目的轉化體。
所使用的表面活性劑可以是用於上述膽固醇測定系統的任一表面活性劑，優選的陰離子表面活性劑包括1-戊基磺酸鹽、己基磺酸鹽、1-庚基磺酸鹽、1-辛基磺酸鹽、聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽(商品名Emal20C、Emal NC-35(均由KAO生產)、十二烷基苯磺酸鈉、膽酸鹽(膽酸鈉)、膽酸、脫氫膽酸鹽、脫氧膽酸、脫氧膽酸鈉、牛磺脫氧膽酸鈉、N，N-雙(3-D-葡糖醯氨基丙基(gluconamidopropyl))膽醯胺、N，N-雙-3-D-葡糖醯氨基丙基膽醯胺、十二烷基苯磺酸鈉、月桂醯肌氨酸等。優選的陽離子表面活性劑包括正-氯化十二烷基三甲銨、hexadecylpyridiniumchloride及諸如此類。優選的非離子型表面活性劑包括聚氧乙烯烷基醚(商品名Emalgen 220、Emalgen 104P、Emalgen 108、Emalgen 408等(KAO生產))、聚氧乙烯烷基苯基醚(商品名Emalgen 903、Emalgen909、Emalgen 913等(KAO生產))、聚氧乙烯-聚氧丙烯縮合物(商品名Pluronic F88(由Asahi Denka生產)、醯基聚氧乙烯山梨聚糖酯(商品名Tween 21、Tween 81、Tween 20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Tween 85、Emasol 4130等)、烷基聚氧乙烯醚(商品名Atlas G2127、Brij36T、Briii 56等)、正-十二烷基-β-右旋麥芽糖苷、蔗糖單月桂酸酯、聚氧乙烯月桂基醚(商品名Emalgen 120等)、聚氧乙烯烷撐苯基醚(商品名Emalgen A60等)、聚氧乙烯烷撐三苄基苯基醚(商品名EmalgenB66等)、聚氧乙烯甘油p-t-辛基苯基醚(商品名Triton X100)、聚氧乙烯高級醇醚(商品名Emalgen 705、Emalgen 709等)、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、甘油脂肪酸酯、n-辛基-β-右旋葡糖苷、聚氧乙烯乙二醇單十二烷基醚、n-辛基-β-右旋硫葡糖苷、十六烷基醚(C16)、月桂基醚(C12)、油基醚、二十二烷基醚(C20)、聚氧乙烯單月桂酸酯等。優選的兩性表面活性劑包括甜菜鹼衍生物、烷基甜菜鹼衍生物、咪唑甜菜鹼衍生物、硫甜菜鹼衍生物、氨基羧酸衍生物、咪唑啉衍生物、胺oxanoide衍生物、膽汁酸衍生物等。其中，更優選非離子型表面活性劑。
用這樣的方式可以獲得具有生產本發明的氧化酶能力的轉化體。實例包括通過以上所述的修飾方法處理具有SEQ ID NO1所示的胺基酸序列的來源于洋蔥伯克霍爾德菌ST-200的膽固醇氧化酶所獲得的包含SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的本發明的氧化酶，等。此外，如有必要，通過利用這種具有生產本發明的氧化酶能力的轉化體通過以上所述修飾方法進一步重複本發明的基因修飾，同樣可以獲得具有對表面活性進一步提高的穩定性的本發明修飾的氧化酶以及具有生產該酶能力的轉化體。也就是說，根據本發明，在SEQ ID NO2或者5所示的胺基酸序列中至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入的胺基酸序列的膽固醇氧化酶、由與SEQ ID NO2或者5所示的胺基酸序列具有80％或更高同源性的胺基酸序列組成的膽固醇氧化酶等同樣包括在本發明的氧化酶之內。例如可以具體列舉在後面的實施例中顯示的本發明的氧化酶(R7)等。在R7中，SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中3個胺基酸殘基被取代，並且它具有90％或更高的同源性。另外，作為由此獲得的能夠生產本發明氧化酶的轉化體的實例，可以引用產生由SEQ IDNO2所示的胺基酸序列組成並且在表面活性劑共存下具有80％的殘留活性的本發明的氧化酶(R1)的大腸桿菌JM109(pNCP1)。
同樣，以上所述本發明的氧化酶(R1)的基因(SEQ ID NO6)可以作為本發明的基因的實例引用。包括含有編碼SEQ ID NO5的SEQ ID NO6的基因的質粒pNCP1作為已經以保藏號FERM BP-10343在2005年5月27日保藏在International Patent Organism Depositary、National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology(獨立行政法人產業技術綜合研究所，特許生物保藏中心，日本，千葉)。另外，編碼諸如由在SEQ IDNO2或者5所示的胺基酸序列至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入的胺基酸序列組成的膽固醇氧化酶以及由與SEQ ID NO2或者5所示的胺基酸序列具有80％或更高同源性的胺基酸序列組成的膽固醇氧化酶的本發明的膽固醇氧化酶的基因，以及諸如由嚴格條件下與SEQ IDNO4或者6所示的核苷酸序列全長，與SEQ ID NO4或者6所示的核苷酸序列中連續15個或更多鹼基，或者與由其互補核苷酸序列組成的DNA雜交的核苷酸序列組成的DNA，以及由與SEQ ID NO4或者6所示的核苷酸序列全長或者與SEQ ID NO4或者6所示的核苷酸序列中連續15個或更多鹼基具有80％或更高同源性的核苷酸序列組成的DNA的編碼本發明的膽固醇氧化酶的基因可作為本發明的基因的實例。「連續15個或更多鹼基」的具體實例包括作為SEQ ID NO6的部分序列的從4到186個鹼基的核苷酸序列等。另外，其中SEQ ID NO4從130到312位鹼基的核苷酸序列被替換成SEQ ID NO6從4到186位鹼基的核苷酸序列的序列同樣編碼SEQ ID NO2的胺基酸序列，因此其同樣可以引用為由具有80％或更高同源性的核苷酸序列組成的DNA的實例。
下面，通過利用培養基培養能夠產生本發明的氧化酶的微生物並從培養混合物收集膽固醇氧化酶來生成本發明的氧化酶。任一微生物都可用於生產本發明的氧化酶，條件是所述微生物能夠生成本發明的氧化酶。實例包括以上述方式獲得的能夠生成本發明的氧化酶的轉化體或者轉導產物。例如，可以通過利用能夠生成本發明氧化酶的轉化體並優選屬於埃希氏桿菌屬來產生本發明的氧化酶。在培養上述微生物中，可以通過固體培養方法培養，然而更優選通過採用液體培養法進行培養。另外，通過向酵母抽提物、蛋白腖、肉湯、玉米漿、大豆或者麥餅(wheat cake)汁等的一種或多種氮源中添加磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸鐵、硫酸錳等的一種或多種無機鹽，或任選添加糖、維生素等來製備用於培養上述微生物的培養基。在這方面，最好將培養基的初始pH值從6調節到9。需要通過充氣攪拌浸沒培養、振蕩培養、靜止培養等在從20℃到42℃的溫度下優選在約25℃培養10到40小時進行培養。培養完成後，可以利用常規的酶收集方式從培養混合物收集本發明的氧化酶。通過例如過濾或者離心的操作從培養基中分離細胞，然後衝洗。需要從這樣的細胞收集本發明的氧化酶。在這種情況下，可以就這樣使用細胞，但是優選通過利用諸如超聲粉碎器、弗氏壓碎器與Dynomill的多種破碎裝置破碎細胞的方法、利用諸如溶菌酶的細胞壁溶解酶溶解細胞壁的方法，或者利用諸如TritonX-100的表面活性劑從細胞提取酶的方法從細胞收集本發明的氧化酶。
為了從以這樣的方式獲得的粗酶液體中分離本發明的氧化酶，可以使用通常用於酶提純的方法。需要通過例如硫酸銨鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換色譜法、凝膠過濾色譜法，吸附色譜法與電泳的任選組合來完成這種操作。以這樣的方式，可以在直到通過SDS-PAGE幾乎顯示單一條帶的純化水平分離本發明的氧化酶。此外，可以通過任選組合上述的純化方法根據用途製備具有不同純化程度的酶製劑。
對於本發明氧化酶的酶活性測定方法，測定酶反應形成的過氧化氫的量的方法以及測定酶反應所消耗的氧的量的方法可以作為主要測定方法的實例。在下文中，除非另作說明，在本發明的酶活測定中膽固醇被用作底物。在這一點上，對於酶滴定度而言，當利用膽固醇作為底物進行測定時在1分鐘之內形成1摩爾過氧化氫的酶的量被定義為1U。
A.試劑的製備(1)試劑1膽固醇溶液首先，將500mg的膽固醇(由Wako Pure Chemical Industries生產)加入到5.0ml的Triton X-100中並通過在加熱器上攪動溶解於其中。接著，向其中加入90ml的離子交換水，煮沸溶液然後在冰上冷卻，向其中添加4.0g的膽酸鈉(由Nacalai Tesque生產)並溶解於其中，然後將總體積調至100ml。
(2)試劑26.0％的酚溶液在離子交換水中溶解6.0g的苯酚並將總體積調至100ml。
(3)試劑30.15％的過氧化物酶溶液在100ml的0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)中溶解150mg的過氧化物酶。
(4)試劑44-aminoantipyrine溶液在離子交換水中溶解1.76g的4-aminoantipyrine(由Wako PureChemical Industries生產)並將總體積調至100ml。
B.測定方法在將4.0ml試劑1與51ml的0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)混合之後，向其中順次添加2.0ml的試劑2、2.0ml的試劑3與1.0ml的試劑4，然後混合。將這些液體以3.0ml分裝到試管中並用冰冷卻保存。測定時，在37℃溫育5分鐘其中的3.0ml液體，向其中加入50μl的每種酶液體然後混合，然後通過分光光度計(U-3010，由Hitachi生產)在500nm測定吸光度。測定值(ΔODtest)是在500nm從2分鐘到4分鐘後，每分鐘吸光度的改變。在這一點上，對照液體(ΔODblank)以和上述相同的方法製備，除了加入50μl含有0.2％小牛血清白蛋白的20mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)代替酶液體。根據下列計算公式計算出的值用作酶活值(U/ml)。
13.78在上述測定條件毫摩爾摩爾吸光係數(cm2/微摩爾)1/2基於由酶反應形成的2分子H2O2形成的醌亞胺(Quinoneimine)色素是1分子事實的因子1.0光程長(cm)通過利用由本發明獲得的膽固醇氧化酶基因，可以低成本提供在低底物(膽固醇)濃度顯示高活性，在較寬的pH值範圍內起作用並具有優良熱穩定性的膽固醇氧化酶。因為膽固醇氧化酶對表面活性劑得以提高，使其尤其適於用來測定體液與食物中的膽固醇。同樣，因為其在有機溶劑覆蓋條件下可以被強烈激活，所以具有有效進行膽固醇的酶促轉化的特徵。除這些優點之外，這種酶還可用作口服攝取的殺蟲劑、以及用作衣服的去垢劑等用膽固醇染色的情況。
下面基於實施例對本發明進行詳細描述，然而本發明並不限定於此。
實施例1(A)重組質粒的製備分別製備含有具有不同特性的氧化酶基因(編碼由SEQ ID NO1所示的胺基酸序列的基因)的重組質粒DNA，以及用於提高這種基因在大腸桿菌中的表達量的另一個含有氧化酶基因的重組質粒DNA，其中編碼該基因氨基末端區域的核苷酸序列被修飾以適於大腸桿菌的密碼子的使用。在如下所述製備本發明氧化酶的過程中，這兩種重組質粒DNA都可以使用，然而為了大量生產本發明的氧化酶，使用含有修飾的氧化酶基因的重組質粒DNA是有效的。
(1)重組質粒pCox4 DNA的製備根據JP-A-2002-65271實施例中製備含有上述氧化酶基因(編碼SEQ ID NO1所示的胺基酸序列)的大腸桿菌DH5α(pCox4)，並將其接種到20ml的LB培養基(1％細菌用胰蛋白腖、0.5％酵母抽提物與0.25％的NaCl)並在37℃振蕩器上培養20小時以獲得培養液體。在7,000rpm對該培養液體離心5分鐘以回收細胞。利用QIAGEN tip-100(由Qiagen生產)從細胞提取並純化重組質粒pCox4DNA從而獲得100μg的重組質粒pCox4DNA。
(2)氨基末端側核苷酸序列被修飾的重組質粒pNCOP DNA的製備具有在SEQ ID NO7至14中描述的作為SEQ ID NO6的部分序列的核苷酸序列的寡聚核苷酸通過Sigma Genosis的委託合成服務獲得。利用T4多核苷酸激酶(由Takara Shuzo生產)對SEQ ID NO7至14中的每一個進行磷酸化。另一方面，通過利用具有SEQ ID NO1的pCox4 DNA作為模板，SEQ ID NO15與16作為引物並利用Ex Taq聚合酶(由TakaraShuzo生產)進行PCR來製備編碼C末端側的基因片段。此外，用NdeI(由Daiichi Pure Chemicals生產)與NspI(由Daiichi Pure Chemicals生產)來處理這個片段。另外，用NdeI處理pKF19k DNA然後通過BAP處理(使用由Takara Shuzo生產的一種試劑)進行脫磷酸化。在由此獲得的磷酸化寡聚核苷酸之中，將8個磷酸化寡聚核苷酸與pCox4DNA-衍生的基因片段以及合適量的pKF19k片段混合併使用連接試劑盒ver.2(由TakaraShuzo生產)進行連接，所獲得的質粒命名為pNCOP。接著，通過(1)中描述的方法製備100μg的pNCOP DNA。
(B)本發明的氧化酶與能夠生產本發明的氧化酶的轉化體的製備(1)修飾操作(突變的引入)利用上述重組質粒pNCOP DNA作為模板，SEQ ID NO17與25作為引物進行PCR。在這種情況下，通過添加10％DMSO誘導擴增差錯引入突變。用限制性酶NdeI處理用這樣的方式獲得的DNA片段，然後與同樣通過用NdeI處理質粒pKF19k並且通過BAP處理(使用由TakaraShuzo生產的一種試劑)進行脫磷酸化製備的片段混合，利用連接試劑盒ver，2(由Takara Shuzo生產)連接混合物，並利用連接產物根據D.M.Morrison(Methods in Enzymology，68，326-331(1979))轉化大腸桿菌E.coliJM109(由TOYOBO生產)從而獲得約2,500個攜帶修飾的質粒的轉化體。
(2)選取產生本發明的氧化酶的菌株首先，將所有上述獲得的轉化體接種到每個孔都包括含有1mM的IPTG和50μg/ml的卡那黴素的100μl無菌LB培養基的96-孔板中。將攜帶pNCOP的JM109接種到每一平板的1個孔內作為陰性對照。在25℃培養24小時。將含有因此獲得的培養液體的產物平板放入-80℃的冰箱中並保存1小時用於細胞裂解。此後，平板上的每個孔與含有0.2％小牛血清白蛋白，補充有100μl的10％Emalgen 913的100mM MES-NaOH緩衝液(pH 7.0)混合，並且使混合物在37℃保持5小時。此後，取出50μl的每一經處理的液體並與50μl下列組分的反應試劑混合來進行反應，並選擇與陰性對照相比顏色加深的液體對應的菌株。
膽固醇溶液，15m向5.0ml的Triton X-100中加入500mg的膽固醇(由Wako PureChemical Industries生產)，並通過在加熱器上攪拌溶解於其中。向其中加入90ml的離子交換水後，煮沸溶液然後在冰上冷卻，向其中加入4.04g的膽酸鈉(由Nacalai Tesque生產)並溶解於其中，然後將總體積調節至100ml；0.1M磷酸鉀緩衝液，pH 7.0，17.5ml；1.76％4-Aminoantipyrine溶液，3.5ml；6.0％苯酚溶液，7ml；0.15％過氧化物酶溶液，7ml在100ml的0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)中溶解150mg的過氧化物酶。
在此選擇的顯色的10個菌株中的每一種都在2ml的LB培養基(添加50μg的卡那黴素)進行液體-培養，並產生由質粒編碼的經修飾的膽固醇氧化酶。在培養之後，將由此獲得的培養液通過超聲波發生器進行破碎並在8,000rpm離心5分鐘，並且將由此獲得的0.5ml粗酶提取物與0.5ml的含有0.2％牛血清白蛋白，補充有10％Emalgen 913的100mMMES-NaOH緩衝液(pH 7.0)混合，並且使混合物在37℃過夜反應。通過測量這種反應液與2倍稀釋的未處理的粗酶提取物的活性，計算殘留的活性比率(反應液體的活性/未經處理粗酶提取物的活性)。以相同的方式培養、提取與熱處理具有不同特性的修飾之前的氧化酶，測定其活性，並比較殘留的活性比率從而獲得殘留的活性比率從40％提高到80％的經修飾的膽固醇氧化酶及產生其的3種大腸桿菌菌株。其中編碼1種(R1)基因的質粒pNCP1在2005年5月27日以保藏號FERM BP-10343保藏在International Patent Organism Depositary、National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology Science and TechnologyScience and Technology(獨立行政法人產業技術綜合研究所，特許生物保藏中心，日本，千葉)。
(3)突變發生區域的鑑定回收攜帶經修飾的膽固醇氧化酶基因的質粒，利用CEQ2000XLDNA分析系統(Beckman Coulter生產)來測定核苷酸序列，並且在此基礎上鑑定經修飾的胺基酸殘基。
結果發現，如SEQ ID NO2所示，在本發明的氧化酶(R1)的情況下，SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中175位的天冬氨酸被天門冬醯胺取代。其對應於SEQ ID NO5中的133位。以相同的方式，在本發明另一個氧化酶(R7)的情況下，發現SEQ ID NO1所示的胺基酸序列中173位的脯氨酸被亮氨酸取代，220位的天冬氨酸被穀氨酸取代。此外，這些突變區域對應於SEQ ID NO5中的131位和178位。
(4)突變點的分離與組合嘗試將這些突變點的每一個獨立地引入。也就是說，利用pNCOP DNA，SEQ ID NO17和18的序列(以這樣方式設計，用天門冬醯胺代替位於SEQ ID NO5中133位的天冬氨酸)作為引物以及KOD plus聚合酶(TOYOBO生產)進行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳證實對應於該質粒全長的DNA片段的擴增，用限制性內切酶(作用於甲基化DNA；由Daiichi Pure Chemicals生產)處理該片段。接著轉化入大腸桿菌JM109中，然後利用補充有卡那黴素的LB瓊脂培養基選擇轉化體。用含有卡那黴素的液體培養基培養生長的克隆以回收攜帶膽固醇氧化酶基因的質粒，並且測定其核苷酸序列來證實所需的突變已被引入。通過相同的方法利用在131位的SEQ ID NO19和20，和在178位的SEQ ID NO21和22還可以獲得SEQ ID NO5的131位(脯氨酸被亮氨酸代替)和178位(天冬氨酸被穀氨酸代替)的位點-特異性突變的膽固醇氧化酶基因。此外，利用攜帶如此獲得的位點-特異性突變的膽固醇氧化酶基因的質粒作為模板可以獲得雙突變的膽固醇氧化酶基因。在這種情況下，因為位於131位和133位的突變位點彼此鄰近，可以用SEQ ID NO23和24來進行操作。就可以進一步攜帶三突變的膽固醇氧化酶基因的質粒。
(5)突變點以及表面活性劑抗性將上述獲得的攜帶含有具有不同突變點的突變型膽固醇氧化酶基因的質粒的任一大腸桿菌JM109菌株培養在10ml補充有1.0mM IPTG的LB-卡那黴素培養基中，30℃培養24小時，然後將由此獲得的培養基在8,000rpm離心5分鐘以收集細胞，然後將所述細胞懸浮於1ml的20mM磷酸鉀緩衝液中(pH 7.0)。爾後，用超聲波發生器破碎這些細胞並在10,000rpm離心10分鐘回收上清液。將每一200μl的這些粗酶提取物與補充有2％Emalgen 913的含有0.2％小牛血清白蛋白的200μl 100mMMES-NaOH緩衝液(pH 7.0)混合，在30℃保存混合物7天，與沒有實施表面活性劑處理的粗酶提取物30℃保存7天的情況比較(表1)殘留的酶活性比率。
表1 突變型膽固醇氧化酶的突變點以及與Emalgen 913共存時的保存穩定性

*突變P131L在131位用亮氨酸取代脯氨酸 突變D133N在133位用天門冬醯胺取代天門冬氨酸 突變D178N在178位用穀氨酸取代天門冬氨酸此外，在對Emalgen 913觀察到穩定效應的突變型膽固醇氧化酶上檢驗對其他表面活性劑(Emalgen 120，Emal 20C和Emal 20CM)的保存穩定性。在與上述試驗相同的條件下通過將200μl的粗酶提取物與補充有2％的每種表面活性劑的含有0.2％小牛血清白蛋白的200μl的100mM MES-NaOH緩衝液(pH 7.0)混合，並且使混合物在30℃保存3天(表2)表2 對表面活性劑的保存穩定性

(C)本發明中氧化酶的產生及其理化特性將由此獲得的可以產生本發明氧化酶(R1)的轉化體大腸桿菌JM109(pNCP1)接種到含有1mM IPTG的10升LB-卡那黴素培養基中，以11/分的通風，600rpm攪拌，利用發酵罐30℃培養24小時。將由此獲得的10升培養基在7,000rpm離心10分鐘收集細胞，然後將所述細胞懸浮於1升的20mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)中。然後，用超聲波發生器破碎細胞並於10,000rpm離心10分鐘回收上清液作為粗酶液體。將該粗酶液體在60℃熱處理30分鐘，用20mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)稀釋10倍然後在10,000rpm離心10分鐘回收上清液。在含有5mM EDTA的20mMTris-HCl緩衝液(pH 8.8)中利用超濾膜AIP-2013(Asahi ChemicalIndustry生產)進行透析將上清液濃縮至500ml。然後，將混合物懸浮於用含有5mM EDTA的20mM Tris-HCl緩衝液(pH 8.8)平衡的200mM的QAE-Sephadex A-50中，並回收通過用含有5mM EDTA的20mMTris-HCl緩衝液(pH 8.8))洗滌殘渣所獲得的濾液和洗液作為活性級分。由此回收的本發明的氧化酶(R1)的比活性是4.0U/A280。
本發明獲得的氧化酶(R1)的物理化學特性如下。
(1)作用由上述酶活性測定方法證實了與作為酶底物的膽固醇的反應。
(2)最適pH值用100mM乙酸鹽緩衝液(pH 5.5到6.0)，100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.0到8.22)，100mM Tris-HCl緩衝液(pH7.58到9.5)以及100mMNaHCO3-NaOH緩衝液(pH 9.43到11.0)作為緩衝液，在37℃各pH值進行酶促反應發現了圖1所示的相對活性。從圖1發現本發明的氧化酶的最適pH值是6.5到8.0。
(3)最適反應溫度範圍利用由用於上述活性測定方法中的反應液體的相同組分組成的反應液體在不同溫度下測量這種酶的活性，結果如圖2所示。如圖2所示，最適反應溫度範圍是55到65℃。
(4)穩定的pH範圍用100mM乙酸鹽緩衝液(pH 3.5到6.0)、100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.0到8.22)、100mM Tris-HCl緩衝液(pH7.58到9.5)以及100mMNaHCO3-NaOH緩衝液(pH 9.43到11.0)作為緩衝液，在25℃，各pH值處理本發明的氧化酶20小時，然後測定殘留的活性，結果如圖3所示。如圖3所示，穩定的pH範圍是3.5到8.5。
(5)熱穩定性在各溫度在100mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.0)中處理所述酶15分鐘來測定其熱穩定性，結果如圖4所示。在高達約70℃的溫度，本發明的氧化酶仍然是穩定的。
(6)分子量按照通常的方法通過SDS-PAGE用Multigel 10/20(由Daiichi PureChemicals生產)來獲得分子量。分子量約為60,000。
(7)表面活性劑穩定性將這種酶對表面活性劑的穩定性與來自原始的洋蔥伯克霍爾德菌ST-200的膽固醇氧化酶(CHO(WT))進行比較。然後，將補充有2％的每種表面活性劑的含有0.2％牛血清白蛋白的100mM MES-NaOH緩衝液(pH 7.0)與等量的2U/ml的膽固醇氧化酶混合併且在37℃保藏24小時(表3)。
表3.純化的酶對表面活性劑的保藏穩定性的比較

本申請是基於2005年6月8日提交的日本專利申請2005-167779，其全部內容在此引入作為參考。雖然已經對本發明及其具體的實施方案進行了詳細描述，對於本領域技術人員顯而易見的是在不背離本發明的精神與範圍的條件下可以對本發明進行多種改變以及修改。此處引用的所有參考文獻都在此處全文引用。
序列表110龜甲萬株式會社(KIKKOMAN CORPORATION)120在表面活性劑存在下穩定的膽固醇氧化酶(CHOLESTEROL OXIDASE STABLE IN THE PRESENCE OF SURFACTANT)130SPI062505-66150P2005-1677791512005-06-0816025170PatentIn Ver.3.12101211582212PRT213Burkholderia cepacia ST-2004001Met Ser Gln Asp Phe Arg Asp Glu Pro Ala Ser Arg Arg Ala Phe Leu1 5 10 15Ala Asp Met Ala Lys Leu Ala Ala Ala Gly Val Val Thr Gly Trp Thr20 25 30Pro Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Asn Ala Arg Thr Ala Asp Ala Pro Pro35 40 45Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Lys Gln Ala Phe Gln Asn50 55 60Trp Ser Gly Glu Ile Ala Val Gln Asp Val Trp Thr Ala Ala Pro Arg65 70 75 80Ser Ala Asp Asp Val Val Ala Ala Val Asn Trp Ala Arg Ala Asn Gly85 90 95Tyr Arg Ile Arg Pro Arg Gly Tyr Met His Asn Trp Ser Pro Leu Thr100 105 110Leu Asp Pro Gly Ala Gly Ala Ala Asn Val Val Leu Leu Asp Thr Thr115 120 12524
Lys Ser Leu Thr Ala Val Ser Val Asp Thr Ser Ala Arg Pro Ala Arg130 135 140Val Thr Ala Gln Thr Gly Ile Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ala Thr Leu145 150 155 160Glu Gln Tyr Gly Leu Gly Val Ile Ala Ala Pro Ala Pro Gly Asp Ile165 170 175Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Asp Ala His Gly Thr Ala Val Pro180 185 190Ala Val Gly Glu Thr Leu Gln Pro Gly His Thr Tyr Gly Ser Leu Ser195 200 205Asn Leu Val Val Ala Leu Thr Ala Val Val Tyr Asp Pro Ala Arg Gln210 215 220Gln Tyr Val Leu Arg Arg Phe Glu Arg Ser Asp Pro Glu Ile Gly Ala225 230 235 240Phe Leu Ala His Ile Gly Arg Ala Phe Val Val Glu Val Thr Leu Thr245 250 255Ala Gly Pro Asn Gln Arg Leu Arg Cys Gln Ser Tyr Val Asp Ile Pro260 265 270Ala Ser Glu Leu Phe Ala Pro Ala Gly Thr Ser Gly Arg Thr Ile Thr275 280 285Ser Phe Leu Asp Arg Ala Gly Arg Val Glu Ala Ile Trp Phe Pro Phe290 295 300Thr Ser Ser Pro Trp Leu Lys Val Trp Thr Pro Thr Pro Ser Lys Pro305 310 315 320Phe Leu Ser Arg Ala Val Thr Gln Pro Tyr Asn Tyr Pro Phe Ser Asp325 330 335Ser Ile Ser Gln Ser Ile Ser Asp Leu Val Lys Arg Ile Val Ile Gly340 345 350Gly Glu Gly Ala Leu Thr Pro Leu Phe Gly Gln Thr Gln Leu Ala Ile355 360 365
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211582212PRT213Burkholderia cepacia ST-2004002Met Ser Gln Asp Phe Arg Asp Glu Pro Ala Ser Arg Arg Ala Phe Leu1 5 10 15Ala Asp Met Ala Lys Leu Ala Ala Ala Gly Val Val Thr Gly Trp Thr20 25 30Pro Leu Tyr Gln Ile Ala Ala Asn Ala Arg Thr Ala Asp Ala Pro Pro35 40 45Pro Gly Phe Pro Ala Asp Ile Pro Leu Tyr Lys Gln Ala Phe Gln Asn50 55 60Trp Ser Gly Glu Ile Ala Val Gln Asp Val Trp Thr Ala Ala Pro Arg65 70 75 80Ser Ala Asp Asp Val Val Ala Ala Val Asn Trp Ala Arg Ala Asn Gly85 90 95Tyr Arg Ile Arg Pro Arg Gly Tyr Met His Asn Trp Ser Pro Leu Thr100 105 110Leu Asp Pro Gly Ala Gly Ala Ala Asn Val Val Leu Leu Asp Thr Thr115 120 125Lys Ser Leu Thr Ala Val Ser Val Asp Thr Ser Ala Arg Pro Ala Arg130 135 140Val Thr Ala Gln Thr Gly Ile Ser Leu Glu Ser Leu Leu Ala Thr Leu145 150 155 160Glu Gln Tyr Gly Leu Gly Val Ile Ala Ala Pro Ala Pro Gly Asn Ile165 170 175Thr Leu Gly Gly Ala Leu Ala Ile Asp Ala His Gly Thr Ala Val Pro180 185 190Ala Val Gly Glu Thr Leu Gln Pro Gly His Thr Tyr Gly Ser Leu Ser195 200 205Asn Leu Val Val Ala Leu Thr Ala Val Val Tyr Asp Pro Ala Arg Gln
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223Artificially Synthesized Primer Sequence40025aggaggtttc atatggcaga tgcgcc2權利要求
1.一種新的具有以下物理化學特性的膽固醇氧化酶，其中的膽固醇氧化酶對表面活性劑具有提高的穩定性(a)作用與底物特異性其作用於膽固醇將其轉換成膽甾-5-烯-3-酮；其作用於膽甾-5-烯-3-酮並將其轉換成6β-全羥基膽甾-4-烯-3-酮；其作用於3β-甾醇而不作用於3α-羥基類固醇，以及(b)分子量約60,000(SDS-PAGE)。
2.一種具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質，所述蛋白質是選自以下(a)至(f)的蛋白質(a)包含SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的蛋白質，(b)由在SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入的胺基酸序列組成並且具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質，(c)由與SEQ ID NO2所示的胺基酸序列具有80％或更高同源性的胺基酸序列組成並具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質，(d)包含SEQ ID NO5所示的胺基酸序列的蛋白質，(e)由在SEQ ID NO5所示的胺基酸序列中至少一個胺基酸缺失、取代、添加和/或插入的胺基酸序列組成並且具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質，以及(f)由與SEQ ID NO5所示的胺基酸序列具有80％或更高同源性的胺基酸序列組成並具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質。
3.選自以下(a)至(f)的DNA的基因(a)包含SEQ ID NO4所示的核苷酸序列的DNA，(b)嚴格條件下與由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列組成的全長DNA，與由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列組成的DNA中連續15個或更多鹼基，或與由其互補核苷酸序列組成的DNA雜交並編碼具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質的DNA，(c)與由SEQ ID NO4所示的核苷酸序列組成的全長DNA，或與SEQ ID NO4所示的核苷酸序列中的連續15個或更多鹼基具有80％或更高同源性並且編碼具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質的DNA，(d)包含SEQ ID NO6所示的核苷酸序列的DNA，(e)嚴格條件下與由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列組成的全長DNA，與由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列組成的DNA中連續15個或更多鹼基，或與由其互補核苷酸序列組成的DNA雜交，並且編碼具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質的DNA，以及(f)與由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列組成的全長DNA，或與由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列組成的DNA中連續15個或更多鹼基具有80％或更高同源性並且編碼具有膽固醇氧化酶活性的蛋白質的DNA。
全文摘要
在表面活性劑存在下具有穩定性的新的膽固醇氧化酶與編碼該新膽固醇氧化酶的基因。
文檔編號C12N15/53GK1891820SQ200610091280
公開日2007年1月10日 申請日期2006年6月8日 優先權日2005年6月8日
發明者阪上了一, 梶山直樹 申請人:龜甲萬株式會社