一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養方法

2023-07-04 15:02:51

專利名稱：一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養方法
技術領域：
本發明涉及一種金錢松植物的組織培養方法，特別是涉及一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養方法。
背景技術：
金錢松是我國特有的古老孑遺松科樹種。根據世界保護聯盟(IUCN)新制定的物種受威脅的分類系統標準和中國植物紅皮書的標準，金錢松被定為漸危種，並被列為國家二級保護植物。金錢松既是重要的園林植物，同時更是一種重要的、應用前景廣闊的藥用植物。研究發現，金錢松最主要的藥用成分是從其樹皮和根皮中提取出來的二萜類化合物土槿酸， 它具有抗腫瘤、抗真菌、抗早孕和使膽囊自截等功效，尤其是抗腫瘤的功效使得金錢松的藥用價值更加凸顯。現代藥理研究發現，土槿酸及其衍生物能作用於多種癌細胞，如胃癌細胞、宮頸癌細胞、肺癌細胞、乳腺癌細胞、卵巢癌細胞等，並具有明顯的量效關係。土槿酸及其衍生物的抗癌機制是通過破壞腫瘤細胞凋亡來實現的，在細胞凋亡過程中土槿酸及其衍生物能夠誘導腫瘤細胞產生凋亡小體和細胞凋亡峰，上調凋亡基因的表達，促凋亡蛋白與線粒體電壓依賴性陰離子通道相互作用促進線粒體通透性轉變孔開放，線粒體通透性轉變孔高水平開放的直接效應是導致線粒體膜電位下降，最終導致腫瘤細胞凋亡。大量開展人工栽種金錢松是解決當前金錢松藥材短缺的重要途徑。目前金錢松人工種植主要採用有性繁殖和無性繁殖兩種方式。有性繁殖即種子繁殖，由於金錢松存在結實率低、結實間隔期較長(一般3 5年結實)、採種條件苛刻(採種母樹年齡以100年左右為最好)、種子成活率低(僅為60% -70% )、以及種子需低溫保存等因素的限制，因此目前還不可能通過有性繁殖大量種植金錢松。無性繁殖即扦插繁殖，金錢松為菌根性樹種，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土內有菌的林間育苗，植物生長周期長， 並易受金錢松小卷蛾的嚴重危害，這些因素限制了金錢松的大量無性繁殖。利用組織培養技術生產藥用植物具有生長周期短，繁殖率高、能有效避免災害性氣候對植物生長的不利影響等優點，可進行周年培養生產。目前還未見有關利用組織培養技術大規模地生產金錢松有效成分的研究報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養方法，該方法能實現對愈傷組織的有效誘導和快速增殖，以解決當前金錢松藥材資源短缺的問題。為達到上述目的，本發明採用的解決方法包括下列步驟(I)材料的選取和消毒選取落葉後生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝去芽上的芽鱗片後將芽放在超淨工作檯上，先用濃度為70%的酒精消毒10 50s，再用濃度為0. 1% 0. 15%的升萊消毒3 25min,最後用無菌水衝洗2 5次後用已滅菌的濾紙吸乾水分；(2)愈傷組織的誘導培養取已消毒的芽，切取芽上的葉原基作為外植體接入愈傷組織誘導培養基 MS+6-BA1. 0 2. Omg .!^+NAAO. I I. Omg *L_1+IAA 0. I 0. 5mg .171+ 蔗糖20 50g L—1+瓊脂5. 0 7. Og L—1中進行培養，pH值為5. 6 6. 5，培養溫度5 30°C、每天光照0 24小時、光照強度為1000 20001x ；(3)愈傷組織的增殖培養選取無褐變、顏色為翠綠色、質地較緊密的愈傷組織，將其切成大小為3 8mm3的團塊後轉接入愈傷組織增殖培養基MS+6-BA 0. 5
I.Omg L i+NAA 0. I I. Omg .L1+ 鹿糖 20 50g .L1+ 瓊脂 5. 0 7. Og L 1 或 MS+6-BA
0.5 I. Omg L i+IAA 0. I I. Omg .L1+ 鹿糖 20 50g .L1+ 瓊脂 5. 0 7. Og L 1 中進行培養，PH值為5. 6 6. 5，培養溫度5 30°C、每天光照0 24小時、光照強度為1000 20001xo本發明通過對金錢松愈傷組織的有效誘導和快速增殖，縮短了金錢松藥材的生長周期、降低了生產成本，且能實現大批量生產，從而可有效解決當前金錢松植物資源和藥材資源短缺的問題；並且所生產的金錢松藥材不變性，有效成分含量高。
具體實施例方式實施例I(I)材料的選取和消毒選取落葉後生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝去芽上的芽鱗片後將芽放在超淨工作檯上，先用濃度為70 %的酒精消毒30s，再用濃度為
0.I %的升汞消毒15min，最後用無菌水衝洗4次後用已滅菌的濾紙吸乾水分；(2)愈傷組織的誘導培養取已消毒的芽，切取芽上的葉原基作為外植體接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA I. Omg .171+NAA 0. 3mg L^+IAA 0. Img .171+蔗糖 30g .171+瓊脂
6.5g T1中進行培養，pH值為6. 0，培養溫度25°C、每天光照12小時、光照強度為15001x， 培養40d後愈傷組織誘導率為98% ；(3)愈傷組織的增殖培養選取無褐變、顏色為翠綠色、質地較緊密的愈傷組織，將其切成大小為5mm3的團塊後轉接入愈傷組織增殖培養基MS+6-BA I. Omg P+NAA
0.5mg L-1+蔗糖30g L-1+瓊脂6. 5g L-1中進行培養，pH值為6. 0，培養溫度25°C、每天光照12小時、光照強度為15001x，培養40天後愈傷組織增殖4倍。實施例2將實施例I步驟(2)中的愈傷組織誘導培養基改為MS+6-BA 2. Omg L^+NAA 0. 5mg L^+IAAO. 3mg L—1+蔗糖30g L—1+瓊脂6. 5g L_S其它步驟同實施例1，外植體培養40d後愈傷組織誘導率為85%。實施例3將實施例I步驟(3)中的愈傷組織增殖培養基改為MS+6-BA I. Omg L^+IAA
0.5mg L-1+蔗糖30g L-1+瓊脂6. 5g L-1，其它步驟同實施例1，培養40天後愈傷組織增殖I. 8倍。實施例4將實施例I步驟(3)中愈傷組織的增殖培養溫度改為5°C，其它步驟同實施例1， 培養40天後愈傷組織的增殖倍數不足I倍。
實施例5將實施例I步驟(3)中愈傷組織的增殖培養條件改為每天光照24小時，其它步驟同實施例1，培養40天後愈傷組織增殖3倍。實施例6將實施例I步驟(3)中愈傷組織的增殖培養條件改為每天無光照，其它步驟同實施例1，培養40天後愈傷組織增殖I. 5倍。比較實施例將實施例I步驟(2)中誘導愈傷組織的外植體改為芽，其它步驟同實施例1，芽外植體在培養40d後的愈傷組織誘導率僅為65%，說明外植體的選擇對愈傷組織的誘導率影響較大。
權利要求
1.一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養方法，其特徵在於包括如下步驟(1)材料的選取和消毒選取落葉後生長健康、無病蟲害的金錢松植株上的芽，剝去芽上的芽鱗片後將芽放在超淨工作檯上，先用濃度為70%的酒精消毒10 50s，再用濃度為 0. 1% 0. 15%的升萊消毒3 25min,最後用無菌水衝洗2 5次後用已滅菌的濾紙吸乾水分；(2)愈傷組織的誘導培養取已消毒的芽，切取芽上的葉原基作為外植體接入愈傷組織誘導培養基 MS+6-BA I. 0 2. Omg L :+NAA 0. I I. Omg L :+IAA 0. I 0. 5mg .L1+ 蔗糖20 50g L—1+瓊脂5. 0 7. Og L—1中進行培養，pH值為5. 6 6. 5，培養溫度5 30°C、每天光照0 24小時、光照強度為1000 20001x ；(3)愈傷組織的增殖培養選取無褐變、顏色為翠綠色、質地較緊密的愈傷組織，將其切成大小為3 8mm3的團塊後轉接入愈傷組織增殖培養基MS+6-BA 0. 5 I. Omg -L^+NAA0.I I. Omg L :+ 糖 20 50g L 丨+ 瓊脂 5. 0 7. Og L 1 或 MS+6-BA 0. 5 1.Omg L i+IAA 0. I I. Omg .L1+ 鹿糖 20 50g .L1+ 瓊脂 5. 0 7. Og L 1 中進行培養， pH值為5. 6 6. 5，培養溫度5 30°C、每天光照0 24小時、光照強度為1000 20001x。
全文摘要
本發明公開了一種以葉原基為外植體的金錢松愈傷組織培養方法，該方法是先將金錢松的芽進行消毒處理，再切取消毒後的芽上的葉原基作為外植體接入愈傷組織誘導培養基MS+6-BA 1.0～2.0mg·L-1+NAA 0.1～1.0mg·L-1+IAA 0.1～0.5mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+瓊脂5.0～7.0g·L-1和增殖培養基MS+6-BA 0.5～1.0mg·L-1+NAA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+瓊脂5.0～7.0g·L-1或MS+6-BA 0.5～1.0mg·L-1+IAA 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+瓊脂5.0～7.0g·L-1中進行培養，最終實現了對金錢松植物愈傷組織的有效誘導和快速增殖。本發明有效地解決了當前金錢松藥材資源短缺的問題。
文檔編號A01H4/00GK102599064SQ20121010486
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月11日 優先權日2012年4月11日
發明者劉洪明, 唐旭, 孫雁霞, 李紅梅, 楊小萍, 王丹, 王強, 王傑, 王躍華, 蔡銳, 袁暢, 黃興 申請人:成都大學