一種用於五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑑定方法
2023-07-03 18:51:16
一種用於五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑑定方法
【專利摘要】本發明提供了一種用於五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑑定方法，試劑盒包括三對SSR引物和標準圖譜，一種試劑盒用於五種鱖亞科魚類的分子的鑑定方法，其步驟：1）DNA提取：採集待測鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA並測定其純度和濃度；2）DNA片段擴增：採用聚合酶鏈式反應擴增待測樣品基因組DNA；3）PCR產物的電泳及銀染色鑑定：對PCR產物用非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，常規銀染法染色後，拍照記錄電泳結果；4）與標準圖譜進行對比。本發明可顯著提高鱖亞科重要經濟、稀有種類間鑑定的效率和準確性，有助於鱖亞科魚類遺傳資源的保護和鱖魚養殖業的持續健康發展。
【專利說明】—種用於五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑑定方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於水產養殖魚種及水產動物天然種質資源鑑定【技術領域】，具體涉及一種用於五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，同時還涉及一種試劑盒用於五種鱖亞科魚類分子的鑑定方法。
【背景技術】
[0002]鱖亞科隸屬鱸形目，自然僅分布於東亞(俄羅斯、日本、韓國、中國和越南(紅河))。績亞科中，翅嘴績(Siniperca chuatsi Basilewsky)、大眼績(Siniperca kneri Garman)和斑鱖(S iniperca scherzeri Steindachner)為我國主要養殖名貴魚類，它們生活習性基本相同，外形特徵相似。以上三種經濟鱖魚在育種過程中，育苗階段無法根據形態學鑑別，尤其翹嘴鱖與大眼鱖即使在魚種和成魚階段，形態學手段亦不易鑑別。中國少鱗鱖(Coreoperca whiteheadi Boulenger)和波紋績(Siniperca undulate Fang&Chong)為繼亞科中珍稀種類，肉質細嫩、味道鮮美，苗種階段均不易鑑別。
[0003]微衛星是由2-6個核苷酸組成的具有高度變異性的簡單重複DNA序列。它分布於真核生物的整個基因組中，具有等位基因數目多、重複性好、呈共顯性遺傳等特點，被廣泛應用於物種鑑定和基因定位等方面的研究。目前除翹嘴鱖與斑鱖外，尚缺乏採用微衛星分子鑑定法進行五種鱖亞科魚類鑑定的相關報導。
【發明內容】
[0004]本發明目的是在於提供了一種用於五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，可顯著提高鱖亞科重要經濟、稀有種類間鑑定的效率和準確性，有助於鱖亞科魚類遺傳資源的保護和鱖魚養殖業的持續健康發展。運用本試劑盒，可彌補形態學鑑定的不足，解決了水產養殖中三種常見養殖鱖類(翹嘴鱖、大眼鱖和斑鱖)苗種鑑定的難題，解決了鱖亞科珍稀種類(中國少鱗鱖和波紋鱖)種屬鑑別的問題，從而促進鱖亞科遺傳資源的合理保護和養殖業的健康發展。
[0005]本發明的另一個目的是在於提供了一種試劑盒用於五種鱖亞科魚類分子的鑑定方法，方法易行，操作簡便，鑑定效率高、準確性好。該方法運用微衛星分子標記鑑別鱖亞科主要養殖種類(翹嘴鱖、大眼鱖和斑鱖)及珍稀種類(中國少鱗鱖和波紋鱖)，以利於鱖亞科養殖群體的合理管理以及野生資源的保護。
[0006]為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施:
[0007]—種用於五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，它包括三對SSR引物和標準圖譜，其中用於聚合酶鏈式反應的三對引物序列分別為:
[0008]引物I 正向序列:5』 TACATGCACACCAGTACGG3』，
[0009]引物I 反向序列:5』 ACCCCGTTAAGTCCACGTC3』 ;
[0010]引物2 正向序列:5 』 TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3 』，
[0011]引物2 反向序列:5 』 ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3 』 ;
[0012]引物3 正向序列:5 』 ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3 』，
[0013]引物3 反向序列:5，GCATGGATGCCAGCGTGA3 』 ;
[0014]用於鑑別五種鱖亞科魚類的標準圖譜為:
[0015]一種引物I擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜示意圖(圖1);一種引物2擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜示意圖(圖2)種引物3擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜示意圖(圖3)。
[0016]一種試劑盒用於五種鱖亞科魚類的分子的鑑定方法，其步驟是:
[0017]I )DNA提取:採集待測鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA並測定其純度和濃度；本步驟中測得DNA的A26Q/A28Q比值為1.82-1.97。
[0018]2) DNA片段擴增:採用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增待測樣品基因組DNA，擴增引物序列為:
[0019]引物I 正向序列:5』 TACATGCACACCAGTACGG3』，
[0020]引物I 反向序列:5』 ACCCCGTTAAGTCCACGTC3』 ;
[0021 ]引物 2 正向序列:5，TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3，，
[0022]引物2 反向序列:5』 ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3』 ;
[0023]引物3 正向序列:5 』 ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3 』，
[0024]引物3 反向序列:5』 GCATGGATGCCAGCGTGA3』 ;
[0025]本步驟中測得DNA的濃度範圍為585.5-3210.4ng/y I。
[0026]本步驟中PCR反應程序為:94°C預變性4min，然後按以下條件進行35個循環:940C 30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，循環結束後72°C延伸1min結束，4°C中保存。
[0027]3) PCR產物的電泳及銀染色鑑定:對PCR產物用非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，常規銀染法染色後，拍照記錄電泳結果；
[0028]本步驟中PCR反應體系為:
【權利要求】
1.一種用於五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，它包括三對SSR引物和標準圖譜，其中用於聚合酶鏈式反應的三對引物序列分別為: 引物 I 正向序列:5』 TACATGCACACCAGTACGG3』， 引物 I 反向序列:5』 ACCCCGTTAAGTCCACGTC3』 ; 引物 2 正向序列:5』 TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3』， 引物 2 反向序列:5』 ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3』 ; 引物 3 正向序列:5』 ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3』， 引物 3 反向序列:5』 GCATGGATGCCAGCGTGA3』 ; 用於鑑別五種鱖亞科魚類的標準圖譜為: 一種引物I擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜；一種引物2擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜；一種引物3擴增的部分物種鱖亞科魚類的微衛星帶譜。
2.權利要求1所述的一種試劑盒用於五種鱖亞科魚類的分子的鑑定方法，其步驟是:1)DNA提取:採集待測鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA並測定其純度和濃度；測得DNA的A260A280比值為1.82-1.97 ； 2)DNA片段擴增:採用聚合酶鏈式反應擴增待測樣品基因組DNA，擴增引物序列為: 引物 I 正向序列:5』 TACATGCACACCAGTACGG3』， 引物 I 反向序列:5』 ACCCCGTTAAGTCCACGTC3』 ; 引物 2 正向序列:5』 TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3』， 引物 2 反向序列:5』 ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3』 ; 引物 3 正向序列:5』 ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3』， 引物 3 反向序列:5』 GCATGGATGCCAGCGTGA3』 ; 本步驟中測得DNA的濃度範圍為585.5-3210.4 ng/ μ I; PCR反應程序為:94°C預變性4min，然後按以下條件進行35個循環:94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，循環結束後72°C延伸1min結束，4°C中保存； 3)PCR產物的電泳及銀染色鑑定:對PCR產物用非變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分離，常規銀染法染色後，拍照記錄電泳結果；採用8%非變性聚丙烯醯胺凝膠； 4)與標準圖譜進行對比:使用引物1，樣品在靠近標準Marker的300bp位置擴增出I條DNA條帶，則鑑定為中國少鱗鱖；使用引物1，在靠近標準Marker的180bp位置擴增出I條特異性條帶，鑑定為斑鱖；使用引物2，樣品在靠近標準Marker的200bp位置擴增出I條或2條DNA條帶，鑑定為波紋鱖；使用引物3，樣品在靠近標準Marker的120bp位置擴增出I條DNA條帶，鑑定為翹嘴鱖；使用引物3，樣品在靠近標準Marker的120bp位置擴增出I條DNA條帶，鑑定為大眼鱖。
3.根據權利要求2所述的一種試劑盒用於五種鱖亞科魚類的分子的鑑定方法，其特徵在於:所述的步驟(3)中PCR反應體系為:
根據權利要求2所述的一種試劑盒用於五種鱖亞科魚類的分子的鑑定方法，其特徵在於:所述的步驟(4)中使用引物I和引物2，待測樣品為五種鱖亞科魚類:翹嘴鱖、大眼鱖、斑鱖、中國少鱗鱖及波紋鱖中的任意一種。
4.根據權利要求2所述的一種試劑盒用於五種鱖亞科魚類的分子的鑑定方法，其特徵在於:所述的步驟(4)中使用引物3時，待測樣品為翹嘴鱖或大眼鱖任意一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073547SQ201310096677
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月25日 優先權日:2013年3月25日
【發明者】梁旭方, 田昌緒, 楊敏, 鄭荷子, 趙程, 竇亞琪, 黃威 申請人:華中農業大學