牛體細胞病毒誘導方法
2023-07-03 21:29:51 1
專利名稱：牛體細胞病毒誘導方法
牛體細胞病毒誘導方法本發明涉及細胞誘變技術領域，尤其涉及一種牛體細胞病毒誘導方法。 [背景技術]在自然界中物競天擇適者生存是自然選擇的結果，生命機體在自然界生存過程中不斷地調整自己以便更好地適應自然環境。誘變在新品種培育的過程中發揮著重要的作用，在當今的世界廣大科技工作者積極投身到動植物的新品種培育，以期獲得優質、高產、 生產性能強的動植物品種。為了得到優秀的動植物新品種個體國家開展了太空育種，將動植物的種子或個體帶到太空，這些材料在太空高強度紫外線、電離輻射等的情況下遺傳生物信息發生改變，即突變，有利的遺傳信息的突變會產生優質、高產、生產性能強的動植物新品種，從而服務於人類的生產和生活。發生誘變的生物材料由於正常細胞的DNA或基因發生突變，遺傳性狀發生變化，並具有穩定的表型變化，變異性狀能夠穩定的遺傳給後代。 一般情況下，引發生物材料發生誘變的因素稱為誘變劑，常見的有高溫、電離輻射、化學藥物等。慢病毒載體作為一類重組逆轉錄病毒載體在轉基因生產中具有方便、快捷、高效和穩定轉染等優點，目前已成為一種重要的基因轉移工具被廣泛應用於基因導入細胞分子生物學研究領域。慢病毒是逆轉錄病毒家族的成員，病毒能夠利用自身組分將外源基因整合入宿主細胞基因組中，從而使外源基因隨著宿主細胞的分裂增殖和傳代而穩定表達。在試驗中發現慢病毒多次感染牛胎兒成纖維細胞後能夠引起細胞發生誘變，誘變的細胞在形態和生長性能等方面呈現特徵性變化，表現出一定幹細胞特徵，為探討細胞在生長、發育和重構等方面提供理想的材料和手段。本發明要解決的技術問題是提供一種牛體細胞病毒誘導方法。使用該方法可以簡單、高效、快速地引起牛體細胞發生誘變。為了解決上述技術問題，本發明採用的技術方案是，牛體細胞病毒誘導方法，包括如下步驟1)取懷孕2. 5月齡牛的胎兒，採用組織塊培養法建立牛的胎兒成纖維細胞系；2)磷酸鈣介導pLentil0X3. 7慢病毒表達載體及其包裝組分在細胞中包裝形成慢病毒顆粒，12-16h後更換新鮮高糖DMEM培養液，病毒包裝4 後收集含慢病毒的高糖 DMEM培養液，經超濾濃縮後添加到牛胎兒成纖維細胞培養板內；3)每天病毒感染一次，共計使用病毒液感染細胞4次，病毒感染2次後更換含 1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF 的高糖 DMEM 培養液；4)當細胞形態出現集落變化後，將細胞集落經Di s pa se消化後接種到經絲裂黴素處理的小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上培養箱中培養。本發明的有益效果是通過慢病毒多次感染牛胎兒成纖維細胞後能夠簡單、高效、快速地引起細胞發生誘變，誘變的細胞在形態和生長性能等方面呈現特徵性變化，表現出一定幹細胞特徵，牛體細胞病毒誘導方法誕生的誘變細胞將會作為一種新型的細胞材料在牛的轉基因克隆、新品種培育、育種改良及細胞基因表達調控等方面發揮重要的作用，同時，也為人類及其他物種的細胞提供借鑑和參考。下面結合附圖和具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明。
圖1是出現誘變的牛胎兒成纖維細胞的生長形態；圖2是誘變形成的細胞集落在飼養層上的生長形態一、細胞培養和慢病毒感染取懷孕2. 5月齡牛的胎兒，採用組織塊培養法建立牛的胎兒成纖維細胞系。磷酸鈣介導pLentil0X3. 7慢病毒表達載體及其包裝組分在細胞中包裝形成慢病毒顆粒， 12-16h後更換新鮮的高糖DMEM培養液，病毒包裝4 後收集病毒液，經超濾濃縮後添加到牛胎兒成纖維細胞培養板內，細胞密度為1. OX IOVcm2，每次病毒感染間隔Mh，共計病毒液感染細胞4次，病毒感染2次後更換含1000U/ml LIF、4ng/ml bFGF的高糖DMEM培養液， 細胞形態出現集落變化後，lmg/ml Dispase消化後接種到經絲裂黴素處理的12. 5d小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上培養箱中培養。二、免疫螢光分析細胞克隆經多聚甲醛室溫固定，Triton X_100溶液通透，BSA溶液封閉，一抗為兔抗0ct4、山羊抗Nanog，鼠抗SSEA-1、鼠抗SSEA-3、鼠抗SSEA-4、鼠抗TRA-1-60、 鼠抗 TRA-1-81、鼠抗 α -actinin (Sarcomeric),鼠抗 α -Fetoprotein (AFP),兔抗 Neurofilament 200，一抗按1 200稀釋後分別添加至細胞上孵育過夜。PBS洗滌，CT3紅色螢光標記的二抗按1 200稀釋後室溫避光孵育lh，PBS洗滌，1 μ g/ml的DAPI細胞核染色，螢光鏡下觀察。三、核型分析和鹼性磷酸酶染色取消化傳代後第2d的細胞集落，用含0. 1 μ g/ml秋水仙素的細胞培養液處理細胞，胰酶消化收集細胞，0.075mol/L KCl低滲處理細胞，甲醇和冰醋酸固定液固定，細胞離心後用甲醇和冰醋酸固定液重複固定3次。取固定後細胞進行滴片，Gimsa染色，空氣乾燥和封片，顯微鏡下觀察及分析。多聚甲醛固定細胞，添加鹼性磷酸酶染液進行染色，以胞漿著色為棕紅色或咖啡色顆粒為陽性。四、體外和體內分化lmg/ml Dispase消化細胞，離心後添加不含LIF和bFGF的DMEM培養液重懸，接種細胞於低貼附的培養皿中培養，懸浮培養一周後接種到明膠覆蓋的培養皿上進行分化培養。胰酶消化細胞，收集細胞後將其注射於6周免疫缺陷鼠腹部背側皮下，腫瘤組織形成後頸部脫白處死裸鼠，腫瘤組織經多聚甲醛固定後進行蘇木精伊紅染色。五、實驗結果(1)細胞集落的形成
牛胎兒成纖維細胞在自然狀態下為纖維狀，鋪滿培養皿的細胞相互接觸細胞纖維狀變得更為明顯，並且細胞停止生長，慢病毒感染1次後的牛胎兒成纖維細胞在螢光顯微鏡下大部分的細胞高水平表達綠色螢光蛋白，整個細胞的形態仍為纖維狀(圖1)。連續經過2-4輪的慢病毒感染，在生長的牛胎兒成纖維細胞中部分細胞改變原有的纖維狀形態， 細胞逐漸收縮變圓形成細胞團。Dispase消化收集的圓球形細胞團接種到飼養層細胞上， 邊界明顯的集落狀細胞克隆逐漸形成(圖幻。細胞克隆經過傳代培養後細胞集落邊界清晰，傳代後的細胞生長速度明顯變快，在1 4傳代的情況下細胞克隆大約每隔3-4d傳代一次，常規的細胞凍存復甦不影響細胞的生長狀態。高倍顯微鏡下細胞集落中單個細胞表現為細胞核較大，核質比例較高，伴隨著細胞傳代的增加，綠色螢光蛋白在細胞克隆中穩定和強表達，相同條件下未經慢病毒感染的牛胎兒成纖維細胞未出現細胞集落的形態變化。(2)鹼性磷酸酶陽性和核型正常鹼性磷酸酶在來自胚源性較強的細胞或分化程度較低的細胞中具有較高的表達水平。多聚甲醛固定的細胞集落經鹼性磷酸酶染液作用後，細胞集落鹼性磷酸酶染色呈強陽性，主要表現為細胞集落呈棕紅色或紫紅色，相同條件下未誘變的牛胎兒成纖維細胞鹼性磷酸酶檢測呈陰性。誘變的牛細胞集落核型分析檢測顯示細胞的染色體數為60，核型正
堂
巾ο(3)幹細胞基因的表達細胞集落的0ct4和Nanog等幹細胞標記的檢測顯示，細胞集落中誘變的細胞表達 0ct4和Nanog蛋白，相同條件下未誘變的牛胎兒成纖維細胞不表達相關蛋白。(4)三胚層分化消化後的細胞集落在低粘附力的培養皿中，形成擬胚體，粘附貼壁的擬胚體經過一周的體外分化培養後表達外胚層神經細胞的Neurofilament、中胚層肌肉細胞的 α -actinin (Sarcomeric)、內胚層肝臟細胞的α -Fetoprotein(AFP)。收集慢病毒感染形成的細胞集落，注射入裸鼠腹部背側皮下6周後能夠形成明顯的腫瘤團塊，對腫瘤組織進行 HE染色顯示，在腫瘤組織內分布有類似神經、消化管腔、軟骨、肌肉等來自外胚層、中胚層、 內胚層相關三個胚層來源的細胞或組織。
權利要求
1.牛體細胞病毒誘導方法，包括如下步驟1)取懷孕2.5月齡牛的胎兒，採用組織塊培養法建立牛的胎兒成纖維細胞系；2)磷酸鈣介導pLentilox3. 7慢病毒表達載體及其包裝組分在細胞中包裝形成慢病毒顆粒，1216h後更換新鮮高糖DMEM培養液，病毒包裝4 後收集含慢病毒的高糖 DMEM培養液，經超濾濃縮後添加到牛胎兒成纖維細胞培養板內；3)每天病毒感染一次，共計使用病毒液感染細胞4次，病毒感染2次後更換含1000U/ ml LIF、4ng/ml bFGF 的高糖 DMEM 培養液；4)當細胞形態出現集落變化後，將細胞集落經Dis pa s e消化後接種到經絲裂黴素處理的小鼠胎兒成纖維細胞飼養層上培養箱中培養。
全文摘要
本發明公開了牛體細胞病毒誘導方法。本發明通過慢病毒多次感染牛成纖維細胞後能夠簡單、高效、快速地引起細胞發生誘變，誘變的細胞在形態和生長性能等方面呈現特徵性變化，表現出一定的幹細胞特徵，誘變形成的細胞改變原有的纖維狀形態而呈現細胞集落團，細胞集落生長迅速、形態穩定，常規的凍存和傳代對細胞生長性能無明顯影響。牛體細胞病毒誘導方法誕生的誘變細胞將會作為一種新型的細胞材料在牛的轉基因克隆、新品種培育、育種改良及細胞基因表達調控等方面發揮重要的作用，同時，也為人類及其他物種的細胞提供借鑑和參考。
文檔編號C12N5/10GK102358891SQ20111028650
公開日2012年2月22日 申請日期2011年9月23日 優先權日2011年9月23日
發明者丁建平, 任春環, 劉亞, 劉洪瑜, 張子軍, 張運海, 方富貴, 曹鴻國, 李運生, 楊盼, 章孝榮, 蒲勇, 陶勇 申請人:安徽農業大學