一種包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的製備方法

2023-07-04 07:33:46

專利名稱：一種包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種配製藥品，尤其是涉及一種包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的
製備方法。
背景技術：
奧沙利鉑(Oxaliplatin， L-0HP)是用於結直腸癌、卵巢癌等多種腫瘤化療的主 要核心藥物，是繼順鉑和卡鉑之後的第三代鉑類化合物，國際通用名為草酸鉑，分子式為 C8H14N204Pt，分子量為397. 3. L-0HP抗癌活性高，抗癌譜廣，有獨特的細胞內靶分子作用 機制和更強的細胞毒作用。比順鉑、卡鉑抑制DNA作用更強，與5-Fu具有協同作用，與其他 鉑類無交叉耐藥，對5-Fu、順鉑、伊立替康等耐藥的腫瘤也有效，且毒副反應輕。大量的國際 多中心研究均證實其具有優良的抗癌效果，對於結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、食管癌、非小細 胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌等均有較好的療效。但是，傳統的奧沙利鉑製劑均為凍幹 粉劑型，將其配置為水溶液後用於化療仍然存在著明顯的缺點，在相關的藥物說明書敘述 道"給予奧沙利鉑130mg/m2，靜脈輸注2h結束後，15%的鉑存在於體循環中，剩餘的85% 迅速擴散到組織內或隨尿排出；2h結束後血漿超濾物中檢測不到完整的藥物"。因此，可見 藥物代謝快，作用時間有限，緩釋性差。快速代謝的特點與分子量較小的特點相結合，又可 導致其組織沉積和淋巴導向等性能較差，從而致使針對腫瘤、肝臟、淋巴系統等重要靶器官 的靶向性不夠；也引起對全身非靶器官組織的毒副作用相對增大。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術不足之處而提供一種不改變奧沙利鉑的分子結構、 能保護藥物緩釋、減慢分解代謝、並增加藥物體積和重量的包載奧沙利鉑的人血白蛋白納 米粒的製備方法。 本發明的目的是通過以下措施來實現一種包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的 製備方法，其特殊之處在於 包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒，由奧沙利鉑原料藥和人血白蛋白HSA組成； 在製備過程中用到注射用水、無水乙醇、戊二醛和氫氧化鈉；其中奧沙利鉑原料藥與白蛋 白的質量比為10-25%，白蛋白水溶液的濃度為1-2. 5% (g/ml)，沉澱劑無水乙醇與白蛋白 水溶液的體積比為2 : 1-3 : 1 ;交聯劑戊二醛與白蛋白的氨基摩爾比為75-200%，氫氧化 鈉適量； 其製備經過下列步驟
步驟一，直接載藥與去溶劑 常溫下，以質量比為5_12.5%稱取奧沙利鉑、人血白蛋白，用注射用水配製成 1-2. 5%白蛋白水溶液，以適量氫氧化鈉調節其pH至8. 8 9. 2，在300-2000轉/min攪拌 下採用滴加法加入與前述白蛋白水溶液體積比為1:2 1:3的無水乙醇，得到藍色乳 光膠體溶液，繼續攪拌；
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步驟二，吸附載藥與交聯 常溫下，另取與前述等量奧沙利鉑，以純水配製成10mg/mL溶液，並以適量氫氧化 鈉調節pH至8. 3 8. 7，在300-2000轉/min攪拌下加入到步驟一所得藍色乳光膠體溶液 中，攪拌30min後加入戊二醛，所述戊二醛與人血白蛋白的氨基摩爾比為75 200%，攪拌 一定時間； 步驟三，旋轉蒸發 利用旋轉蒸發儀，將步驟二得到的納米粒膠體溶液於4(TC旋轉蒸發除去乙醇；
步驟四，離心沉澱 利用高速離心機，將步驟三得到的除去乙醇的納米粒混懸液於14000轉/min速度
下，離心20min ; 步驟五，冷凍乾燥 沉澱的納米粒注入20mL的注射用水混懸後在低溫條件下冷凍乾燥，獲得包載奧
沙利鉑的人血白蛋白納米粒凍乾粉，完成製備。 所述適量氫氧化鈉為保持製備溶液pH值在給定範圍內。 所述步驟一滴點法為以lmL/min速率加入無水乙醇。 所述步驟二交聯劑戊二醛與白蛋白的氨基摩爾比較優比例為100%。 所述步驟二攪拌一定時間為6小時。 所述步驟五在低溫條件下其低溫為_70°C。 與現有技術相比，本發明具有如下優點1)保留奧沙利鉑的抗腫瘤效力，改變其 代謝快、分子量小的局限性；增加製劑的體積和質量，提高藥物緩釋性。2)以人血白蛋白為 骨架材料，人體相容性好，安全無毒，可生物降解，可增加淋巴循環藥物濃度。3)可有效防 止淋巴轉移和肝轉移淋巴轉移和肝轉移是惡性腫瘤最常見的轉移方式，納米粒具有肝臟 濃集和淋巴引流的特性，白蛋白易於經淋巴道吸收。4)納米粒可通過腫瘤組織的EPR效應 (Enhancedpermeability and retention effect,滲透瀦留效應)、微循環滯留、腫瘤細胞 吞噬等效應增加腫瘤靶向性。5)提高靶向性的同時，減少全身非靶器官的毒副作用。


圖1為奧沙利鉑HSA納米粒的電鏡照片 圖2為奧沙利鉑HSA納米粒的體外藥物釋放曲線 圖3奧沙利鉑HSA納米粒對LS174T細胞株的抑制率 一 給藥濃度曲線
具體實施例方式
本發明包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒由奧沙利鉑原料藥和人血白蛋白HSA 組成，製備過程用到注射用水、無水乙醇、戊二醛和氫氧化鈉。其中奧沙利鉑原料藥與白蛋 白的質量比為20%，白蛋白水溶液的濃度為2%，沉澱劑無水乙醇與白蛋白水溶液的體積 比為2. 5 : 1 ;交聯劑戊二醛與白蛋白的氨基摩爾比為100%，氫氧化鈉的濃度為1M。
其製備經過下列步驟製備
(1)直接載藥與沉澱 稱取HSA 200mg，奧沙利鉑20mg，以純水配製成2%白蛋白溶液，以1M氫氧化鈉調節pH至9. O，在2000轉/min攪拌下以ImL/min速度滴加法加入25mL無水乙醇，得到藍色
乳光膠體溶液，繼續攪拌； (2)吸附載藥與交聯 另取與前述等量的奧沙利鉑20mg，以純水配製成10mg/mL溶液，並以1M氫氧化鈉 調節pH至8. 5，在2000轉/min攪拌下加入到步驟一所得藍色乳光膠體溶液中，攪拌30min 後加入戊二醛，所述戊二醛與白蛋白氨基摩爾比為100% ，攪拌6h ; [OO32] (3)旋轉蒸發 利用旋轉蒸發儀，將步驟二得到的納米粒膠體溶液於4(TC旋轉蒸發除去乙醇；
(4)離心沉澱 利用高速離心機，將步驟三得到的除去乙醇的納米粒混懸液於14000轉/min速度
下，離心20min ; (5)冷凍乾燥 沉澱的納米粒注入10mL注射用水混懸後在低溫_701:條件下冷凍乾燥，獲得包載 奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒凍乾粉，完成製備。 上述奧沙利鉑HSA納米粒的製劑工藝參數是在經歷了大量的試驗數據整理後得 出的，現將影響因素分析如下 通過多個因素的單因素和多因素考察進行處方的優化。採用lM氫氧化鈉調節pH 分別為6. 0、7. 4、8. 0、9. 0、10. 0、12. 0，結果表明隨著pH的升高，粒徑逐漸減小，而得率下 降。乙醇的加入體積對納米粒得率和粒徑影響顯著，隨著乙醇體積比的增加，納米粒粒徑急 劇增大，當體積比達到4 : 1時，納米粒粒徑可達300-400nm。乙醇加入速度對粒徑有一定 影響，但速度小於ImL/min時粒徑變化不明顯；乙醇加入速度對得率無明顯影響。固定其 它因素，戊二醛交聯時間分別為6、12、16h時進行納米粒製備，結果提示隨著交聯時間的延 長，納米粒粒徑增大，得率降低。隨著白蛋白濃度的增加，粒徑有增大的趨勢。隨著投藥量 增大，粒徑也有增大的趨勢。隨著交聯劑用量的增加，得率起初變化不大，繼後出現下降趨 勢。吸附載藥儘管可以達到較高的載藥量，但釋放過快，而直接載藥和結合直接和吸附兩種 工藝的載藥方式的釋放速度相似，且後者更慢些，考慮到結合工藝的載藥量較高，因此載藥 方式選定為結合工藝。本發明給出的相關參數為最優化參數。
包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的檢測指標如下
1)粒徑和Zeta電位測定 樣品用生理鹽水配製成濃度為lmg/mL的膠體溶液。粒徑分布和Zeta電位採用動 態光散射及Zeta電位分析儀測定。測試條件溫度25t:，散射角度90度，以散射強度為權 重的平均粒徑作為粒徑指標；測試Zeta電位的場強IOV。
2)包封率和載藥量測定 取製備過程中離心沉澱納米粒後的上層溶液，置於lOmL容量瓶中加純水定容，採
用高效液相法測定溶液中的奧沙利鉑含量，按下式計算納米粒的包封率 包封率=(投藥量-溶液中藥物濃度X 10)/投藥量X 100% 稱取定量納米粒，置於10mL容量瓶中，加純水至刻度，大功率超聲30min，溶液過
0. 22ym濾膜，採用高效液相色譜法測定奧沙利鉑的含量，按下式計算納米粒的載藥量載
藥量=納米粒中藥物含量/納米粒質量X 100%
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3)電鏡檢測 利用透射電子顯微鏡檢測納米粒的形態將樣品分散液滴在銅網上，室溫乾燥，在
透射電子顯微鏡下觀察樣品並拍照。 4)體外釋放度考察 定量稱取納米粒，置於一定體積的等滲PBS pH 7.4中，渦旋2min分散均勻後，配 製成含奧沙利鉑為lmg/mL納米粒懸濁液，取500ii L置透析袋中。將透析袋置於25mL等 滲PBS pH 7. 4釋放介質中，37t:水浴振蕩，分別於0. 5、 1、2、4、6、8、 10、 12、 14、 16h取釋放液 0. 5mL，取後回補0. 5mL空白釋放介質，過0. 22 y m濾膜後，採用高效液相色譜法測定其中奧 沙利鉑含量。以時間為橫坐標，奧沙利鉑累積釋放度為縱坐標，繪製釋放曲線。
5)體外穩定性考察 將同一批製備的納米粒凍乾粉末於4t:放置6個月，然後測定其粒徑、zeta電位和 載藥量，對比測定值的差異。 依據本發明製成的包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒實測得如下數據 奧沙利鉑HSA納米粒平均粒徑為102±3. 5nm，主體位於50_200nm範圍內，Zeta電
位為-22. 6±2. 09mV ;載藥量達9. 06%，包封率達70. 57% ;達到了同類納米粒載藥的較高
水平，見下表l。奧沙利鉑HSA納米粒的凍乾粉為白色蓬鬆狀，水溶液為懸濁狀。透射電鏡
下進行觀察，納米粒呈圓球形，邊緣光滑，彼此之間分散良好，粒徑大體觀尚屬勻稱，如圖1。 表1奧沙利鉑HSA納米粒的部分表徵參數
平均粒徑粒徑範圍包封率(％)載藥量(％)Zeta電位緩釋時間突釋率(％)
102±3.5nm50-200nm70.579.06-22.6 ± 2.09mV10h25.87 奧沙利鉑白蛋白納米粒的體外釋放曲線如圖2所示在0. 5h內，奧沙利鉑有一個 突釋的過程，其後開始緩慢的持續釋放；在10h進入平臺期，達到96. 4%的累積釋放率，因 此認為其藥物緩釋時間為10h。 將同一批製備的納米粒凍乾粉於4t:放置6個月，然後測定其的粒徑、zeta電位和 載藥量。結果提示與6個月前的測定結果差別不大，說明奧沙利鉑HSA納米粒凍乾粉體外 放置具有較好的穩定性。 奧沙利鉑白蛋白納米粒在治療直腸癌疾病中的應用，其特殊給藥方式如下
腹腔留置化療導管6個月或以上，奧沙利鉑白蛋白納米粒由導管給藥2-3周/次 *6_8次，經腹腔腹膜及腫瘤灶等組織——區域淋巴結——遠處淋巴結，由中心向外周導向 化療。開腹手術前或者不準備採取手術治療的患者可以採用局麻下微創置管，採取手術治 療的患者可在關腹前留置藥物同時置管，腹水患者可以直接腹腔注射。奧沙利鉑白蛋白納 米粒可單用，也可與5-FU、 CF、伊立替康等藥物的凍乾粉水溶液或者納米製劑合用；同時可 以合用防粘連製劑等藥物。經腹腔淋巴導向化療可與靜脈化療、介入化療等傳統化療方法 配合。
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採用這樣的給藥方法的優越性和創新性如下 ①奧沙利鉑白蛋白納米粒是奧沙利鉑的新劑型，保留了奧沙利鉑的抗腫瘤活性，
改變了奧沙利鉑分子量小，易於進入血液循環，不易進入淋巴循環的特點，並且大大提高了 藥物緩釋性。②以白蛋白為骨架材料製作納米粒，生物相容性好，安全無毒，可生物降解；更
重要的是，組織內白蛋白主要經淋巴途徑而不是血液途徑參與循環。③腹腔置管實現了長 期化療，可以進行6-8次化療或者更多，操作實用性接近傳統的靜脈化療，而療效勝於傳統 化療。④腹腔內、腫瘤周圍存在著大量的淋巴管和淋巴結，淋巴管內皮細胞間連接鬆散，常 有許多開放的間隙存在；腹腔給藥後，小分子主要通過毛細血管進入門靜脈系統，而白蛋白 納米粒則通過淋巴管內皮細胞間隙和內皮細胞的胞飲及吞噬作用進入毛細淋巴管內，然後 通過淋巴引流到達區域淋巴結，進入淋巴循環。⑤結直腸癌術後患者腹腔內有較多創面，為 納米粒進入淋巴循環的一個特殊的有利途徑。⑥事實上同時進行了腹腔化療和靜脈化療， 納米粒早期釋放出來的奧沙利鉑分子可以殺滅腫瘤局部區域的殘存細胞，也可由毛細血管 吸收進入血循環。⑦可以有效防止肝轉移肝轉移是結直腸癌等腹腔腫瘤除淋巴轉移以外 的第二個重要轉移方式，奧沙利鉑白蛋白納米粒反覆腹腔給藥可以經血行方式和吞噬細胞 運載方式由門脈系統進入肝臟。⑧結直腸癌術後腹腔內腸吻合口少，特別是直腸癌miles 術後沒有腸吻合，經腹腔給藥淋巴導向化療的安全性比胰腺癌、胃癌等高。⑨白蛋白納米 粒同時可以通過可通過月中瘤組織EPR效應(俄Enhanced permeability and retention effect)、循環滯留、腫瘤細胞吞噬等效應增加腫瘤靶向性。⑩增加淋巴循環藥量，減少血循 環和其它臟器組織的藥物分布，提高了靶向性並減少了毒副作用。 下面進一步說明本發明製備的包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的體內外抗腫 瘤藥效實驗研究 1)奧沙利鉑HSA納米粒對大腸癌細胞株的體外抑制試驗 通過MTT法(四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法)，檢測奧沙利鉑HSA納米粒相 對於奧沙利鉑原料藥和空白納米粒對結直腸癌細胞的抑制效應是否具有差別，納米粒的制 備過程是否有藥效減損，納米粒在細胞水平的生物相容性如何。選擇ATCC人大腸癌癌細 胞株LS174T ;設置奧沙利鉑HSA納米粒、空白HSA納米粒、奧沙利鉑原料藥、培養液共4組； 0. 001、0. 01、0. l、l、10、100ii g/ml共6個濃度；48小時、96小時兩個時間點，6個復孔。
圖3給出了奧沙利鉑HSA納米粒對LS174T細胞株的抑制率 一 給藥濃度曲線。其 結果顯示奧沙利鉑納米粒對細胞增殖的抑制率超過原料藥，特別是給藥後96h有顯著的優 勢；而空白納米粒對細胞增殖沒有明顯的影響。提示載藥納米粒組具有更好的體外藥效，且 生物相容性良好。 2)奧沙利鉑HSA納米粒對大腸癌細胞株裸鼠腹腔種植瘤和淋巴轉移的抑制試驗
該部分通過初步的裸鼠大腸癌腹腔種植瘤模型體內試驗，檢測奧沙利鉑HSA納米 粒相對於奧沙利鉑純原料藥和空白HSA納米粒對裸鼠腹腔種植瘤的生長和淋巴轉移的抑 制是否更為有效， 4周齡雄性裸小鼠裸小鼠32隻，左下腹腹腔注射種植1 X 107ml的ATCC人大腸癌 癌LS174T細胞0. 2ml建立均勻穩定的胰腺癌種植瘤模型，接種後1周隨機分為4組奧沙 利鉑HSA納米粒、空白HSA納米粒、奧沙利鉑原料藥、生理鹽水，每組各8隻。接種後1周起， 通過左下腹腹腔注射給藥，每周注射藥物1次，連續4次。A組和B組含奧沙利鉑藥量相等，
7C組給予等量的空白納米粒，D組給予相同體積的生理鹽水。接種後第5周末處死動物，解 剖腹腔進行觀察。結果如表2所示，奧沙利鉑HSA納米粒對腫瘤、腹水、淋巴轉移和肝臟轉 移均有一定的抑制作用，並且對體重的影響較原料藥小。 表2奧沙利鉑HSA納米粒對大腸癌細胞株裸鼠腹腔種植瘤的抑制試驗
組別(n=8)formula see original document page 8 3)奧沙利鉑HSA納米粒治療結直腸癌新型淋巴導向化療方案設計
在經實驗室試驗、動物試驗之後，本發明已擬定了對奧沙利鉑HSA納米粒治療結 直腸癌新型淋巴導向化療方案設計，開腹結直腸癌根治術的患者於手術結束後，將1克奧 沙利鉑HSA納米粒其載藥量為10%左右溶於100毫升幾丁糖防粘連液，塗抹於手術區域 和腫瘤區域；並於腹壁留置化療導管，然後關腹。術後3周開始淋巴導向化療，方案採用 FOLFOX 4 :奧沙利鉬85mg/m2， h0_h2， dl ;LV甲醯四氫葉酸f丐200mg/m2， h0_h2， dl，2 ;5_FU 400mg/i^推注，然後5-FU 600mg/m2，h2-h22， dl， 2 ;每兩周重複一次，共6-8次。其中奧沙利 鉑改為奧沙利鉑HSA納米粒，其含奧沙利鉑量同，給藥途徑由靜脈改為經腹腔導管推注或 滴注，溶劑也可採用乳劑；除奧沙利鉑HSA納米粒以外，其它藥物也可仍由靜脈途徑給予； 可與靜脈化療間隔進行；可同時腹腔注入防粘連和保護腹膜的藥物或者溶液。
本發明在不改變奧沙利鉑的分子結構的情況下，製備一種全新的奧沙利鉑劑 型——包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒，來保護藥物緩釋，減慢分解代謝，並增加藥物的 體積和重量。納米粒是粒徑介於10-lOOOnm的微顆粒系統，作為靶向或緩釋給藥製劑的載 體是其在臨床上的重要應用之一。本發明所製備的載藥納米粒主要由藥物和骨架材料組 成。人血白蛋白(human serum albumin, HSA)是人血漿中的水性蛋白之一，同時也是臨床 應用的重要藥物。以HSA為骨架材料製備的納米粒不存在溶血性和免疫原性的問題，生物 相容性好、安全無毒、可生物降解，可保護藥物緩釋、增加靶向性、減少藥物副作用，對於提 高療效有顯著的作用。
權利要求
一種包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的製備方法，其特徵在於包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒，由奧沙利鉑原料藥和人血白蛋白HSA組成；在製備過程中用到注射用水、無水乙醇、戊二醛和氫氧化鈉；其中奧沙利鉑原料藥與白蛋白的質量比為10-25％，白蛋白水溶液的濃度為1-2.5％(g/ml)，沉澱劑無水乙醇與白蛋白水溶液的體積比為2∶1-3∶1；交聯劑戊二醛與白蛋白的氨基摩爾比為75-200％，氫氧化鈉適量；其製備經過下列步驟製備步驟一，直接載藥與去溶劑常溫下，以質量比為5-25％稱取奧沙利鉑、人血白蛋白HSA，用注射用水配製成1-2.5％白蛋白水溶液，以適量氫氧化鈉調節其pH至8.8～9.2，在300-2000轉/min攪拌下採用滴加法加入與前述白蛋白水溶液體積比為1∶2～1∶3的無水乙醇，得到藍色乳光膠體溶液，繼續攪拌；步驟二，吸附載藥與交聯常溫下，另取與前述等量奧沙利鉑，以純水配製成10mg/mL溶液，並以適量氫氧化鈉調節pH至8.3～8.7，在300-2000轉/min攪拌下加入到步驟一所得藍色乳光膠體溶液中，攪拌30min後加入戊二醛，所述戊二醛與白蛋白氨基摩爾比為75～100％，攪拌一定時間；步驟三，旋轉蒸發利用旋轉蒸發儀，將步驟二得到的納米粒膠體溶液於40℃旋轉蒸發器除去乙醇；步驟四，離心沉澱利用高速離心機，將步驟三得到的除去乙醇的納米粒混懸液置於14000轉/min速度下，離心20min；步驟五，冷凍乾燥沉澱的納米粒注入20mL的注射用水混懸後在低溫條件下冷凍乾燥，獲得包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒凍乾粉，完成製備。
2. 根據權利要求1所述的包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的製備方法，其特徵在於 所述適量氫氧化鈉為保持製備溶液PH值在給定範圍內。
3. 根據權利要求1所述的包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的製備方法，其特徵在於 所述步驟一滴加法為以lmL/min速率加入無水乙醇。
4. 據權利要求1所述的包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的製備方法，其特徵在於所 述交聯劑戊二醛與白蛋白的氨基摩爾比較優比例為100 % 。
5. 根據權利要求1所述的包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒的製備方法，其特徵在於 所述步驟五在低溫條件下其低溫為_7(TC。
全文摘要
本發明涉及一種包載奧沙利鉑的人血白蛋白納米粒及其製備方法。由奧沙利鉑原料藥和人血白蛋白HSA組成；在製備過程中用到注射用水、無水乙醇、戊二醛和氫氧化鈉；其中奧沙利鉑原料藥與白蛋白的質量比為10-25％，白蛋白水溶液的濃度為1-2.5％(g/ml)，沉澱劑無水乙醇與白蛋白水溶液的體積比為2∶1-3∶1；交聯劑戊二醛與白蛋白的氨基摩爾比為75-200％，氫氧化鈉適量。其製備包含下列步驟直接載藥與去溶劑、吸附載藥與交聯、旋轉蒸發、離心沉澱、冷凍乾燥五大步驟。本發明具有如下優點1)保留奧沙利鉑的抗腫瘤效力，改變其代謝快的局限性，並提高藥物緩釋性。2)以人血白蛋白為骨架材料，人體相容性好，安全無毒，可生物降解，可增加淋巴循環藥物濃度。
文檔編號A61K9/19GK101708337SQ20091005662
公開日2010年5月19日 申請日期2009年8月18日 優先權日2009年8月18日
發明者崔龍, 張紀偉, 李金明, 翁子毅, 陳衛 申請人:上海交通大學醫學院附屬新華醫院