一種以肝癌相關基因dlk1為靶點的核糖核酸及其用途的製作方法

2023-07-04 07:31:06 1

專利名稱：一種以肝癌相關基因dlk1為靶點的核糖核酸及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和基因工程領域，具體地，本發明涉及肝癌相關基因DLK1、 以其mRNA序列為靶點的一組siRNA、及其在製備診斷肝癌試劑、製備基因治療肝癌的藥物 中的應用。
背景技術：
目前我國有慢性肝炎患者約1200萬例，每年死於肝病約30萬，其50%為原發性肝 癌，約佔全世界肝癌死亡人數的45%左右。絕大多數與HBV、HCV感染有關。肝癌發病率在 我國居2-3位，主要在青壯年男性發病，在華東地區的發病率明顯高於其他地區，近年來， 有持續上升趨勢。在上海，肝癌的發病率居第三位，僅次於肺癌和胃癌。最新資料顯示這個 比例還有繼續上升的趨勢。現在，肝癌，特別是肝炎病毒引起的肝癌已經嚴重危害了我國人 民生命安全。因此，非常有必要對肝癌發生的分子機製作深入的研究。隨著人類基因組測序的完成，基因組學的研究重點已經轉移到以解析基因功能為 主的功能基因組學研究。功能基因組學的重點是以疾病為中心，全力解決人類疾病相關基 因研究中的重大科學問題。肝癌在我國素有「國病」之稱，經過半個世紀的探索，對於肝癌 的早期診斷和治療雖然有了一定的認識，但肝癌預後仍然很差，特別是對其發病機制的了 解及治療藥物的新靶點方面，更是知之甚少。因此，尋找與腫瘤相關的基因，特別是尋找新 的抑癌基因是近年來腫瘤研究的熱點。DLKl基因定位於染色體14q32上。DLKl是在胞外 區域包含6個EGF樣重複序列的糖基化Delta樣跨膜蛋白。DLKl首先是在脂肪前體細胞 中發發現，與脂肪細胞的分化緊密相關。DLKl基因具有抑制脂肪前體細胞向脂肪細胞分化 的功能。近年來，有研究發現DLKl在神經母細胞瘤細胞和小細胞肺癌細胞株等腫瘤細胞中 存在表達，表明DLKl基因可能與腫瘤發生相關；同時在老鼠的胎肝細胞和膽汁淤積引起的 肝纖維化細胞中均發現DLKl的表達。在我們的前期肝癌及癌旁表達譜分析的研究中，發現 DLKl基因在肝癌中的表達較癌旁組織中明顯增加，提示DLKl基因可能對肝癌的發生相關。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種肝癌相關基因DLKl的mRNA序列，蓋基因定 位在人染色體14q32上，可用於製備治療原發性肝癌的RNA幹擾藥物。為解決上述技術問題，本發明提供肝癌相關基因DLKl的mRNA序列。本發明還提供一種表達載體，含有所述以DLKl上mRNA為靶點的siRNA序列。本發明還提供一種含有所述表達載體的宿主細胞。在本發明的再一方面，還提供了一種用於治療肝癌的試劑盒，其含有所述的以 DLKl上mRNA為靶點的siRNA。
在本發明的又一方面，還提供了一種用於治療肝癌的生物晶片，其含有以DLKl上 mRNA為靶點的siRNA。在本發明的又一方面，還提供了肝癌相關基因DLKl在製備診斷肝癌及腫瘤的試 齊U，和製備基因治療肝癌及腫瘤的藥物中的應用。本發明由於對DLKl基因進行了體外動物細胞試驗，證實DLKl缺失能夠導致肝腫 瘤細胞顯著縮小，認為DLKl基因在進行製備治療肝癌的基因藥物中有巨大作用，可以成為 基因治療的靶點。


圖1是實施例1中pSUPER DLK874和pSUPER DLKlOl 1的RNA幹擾效率示意圖，其 中，pSUPER為空載對照，pSUPER Luc+為陰性對照；圖2是實施例2中三次克隆實驗中的一次的實驗照片；圖3是實施例2中從上到下為H印3B、!fepG2和Huh_7細胞在三次獨立實驗中的克 隆數目統計圖，其中，*表示與對照組比較時ρ值< 0. 05 ；圖4是實施例3中DLKl表達穩定下調的Huh_7細胞株的鑑定示意圖，其中， β -actin作為各樣品蛋白上樣量對照；圖5是實施例3中DLKl表達穩定下調Huh_7細胞株的生長曲線比較示意圖，其中， 細胞活力在450nm波長處測量，每點上下所標的黑色刻度線標誌為其標準差；圖6是實施例4中DLKl表達下調的Huh_7細胞在裸鼠體內的成瘤性降低示意圖； 上圖為4周後攜帶腫瘤的裸鼠照片，皮下的腫瘤呈圓塊狀；下圖為4周後取下的皮下腫瘤照 片，其中Huh-7pl011 A4細胞在六周後仍無腫瘤形成；圖7是實施例5中SMMC-7721瞬間轉染pcDNA3. 0和pcDNA3. O-DLKl後的生長曲 線示意圖；圖 8 是實施例 5 中 SMMC-7721 瞬間轉染 pcDNA3. 0 和 pcDNA3. O-DLKl 後的 Western Blotting分析鑑定圖，其中DLKl為轉染pcDNA3. O-DLKl質粒，3. 0為轉染pcDNA3. 0質粒， blank為沒有轉染的SMMC-7721細胞，β -actin作為各樣品蛋白上樣量對照。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明作進一步詳細的說明。本發明的實施例如下所示實施例1構建並鑑定DLKl的RNAi質粒在本實施例中，引入pSUPER質粒，以構建能夠對細胞進行比較穩定轉染的RNAi 的質粒。該質粒含有Hl-RNA多聚酶III基因啟動子，將能轉錄出含有短鏈髮夾結構 RNA (shRNA)的cDNA序列寡核苷酸插入pSUPER質粒的該啟動子之後，使此載體在轉染入細 胞後能在細胞內穩定合成發卡樣結構的shRNA，即達到比較穩定的沉默目的基因的作用。在本實施例中所用的寡核苷酸序列如下1、pSUPER Luc+正 向 引 物:gatccccctt acgctgagta cttcgattca agagatcgaagtactcagcg taagtttttg gaaa
反 向 引 物agcttttcca aaaacttacg ctgagtactt cgatctcttgaatcgaagta ctcagcgtaa gggg2、pSUPER DLK874 正 向 引 物:gatccccggt ctcacctgtg tcaagattca agagatcttgacacaggtga gacctttttg gaaa反 向 引 物agcttttcca aaaaggtctc acctgtgtca agatctcttgaatcttgaca caggtgagac cggg3、pSUPER DLK1011 正 向 引 物:gatccccggt gtccatgaaa gagctcttca agagagagctctttcatagg cacctttttg gaaa反 向 引 物agcttttcca aaaaggtgtc catgaaagag ctctctcttgaagagctctt tcataggcac cggg其中pSUPER Luc+質粒，其RNAi所針對的片段為改良過的北美螢火蟲 (Photinuspyralis)螢光素酶基因的19個鹼基片段。該基因Luc+是具有種屬特異性的報 告基因，在哺乳動物細胞中不存在該基因也不表達。因此，本實施例中pSUPER Luc+質粒為 RNAi幹擾體系的參照，以排除pSUPER Luc+質粒在RNAi過程中可能出現的非特異的實驗 結果。而pSUPERDLK874和pSUPER DLK1011質粒幹擾的靶序列分別針對DLKl基因序列第 874和第1011個鹼基開始的連續19個鹼基片段。將靶序列對應的cDNA序列分別插入到正向引物(Forward primer)和反向引物 (Reverse primer)的前段空缺內，同時將該cDNA的互補cDNA序列插入後段空缺，形成完整 的正向引物，共64個鹼基。在得到人工合成DNA序列後，對正向引物和反向引物進行退火 和磷酸化，隨後連接入pSUPER載體，再經過轉化進行陽性克隆的篩選。利用pSUPER質粒內部固定的限制性內切酶位點Ecor I和Hind III JipSUPER Luc+質粒進行酶切鑑定。陽性克隆酶切後的條帶大小約為360bp，而陰性克隆酶切後為300bp。所挑選的8 個pSUPER Luc+克隆中左起第2和3號克隆酶切後的條帶略高於其它條帶，大小符合陽性 克隆的特徵。選擇該兩個克隆經測序鑑定發現3號克隆的序列完全符合目的序列片段。而 4個pSUPER DLK1011克隆中，左起1、3、4號均為陽性，測序鑑定發現1號克隆的序列完全 符合目的序列片段。另外，pSUPER DLK874質粒的鑑定篩選過程同上。最終得到該三個以 pSUPER為載體的RNAi質粒。將構建好的pSUPER DLK874和pSUPER DLK1011瞬間轉染入內源性表達DLKl的HCC 細胞Huh-7、H印3B 和!fepG2 中，並以 pSUPER Luc+為對照質粒，用 Real-time Quantitative PCR鑑定其沉默DLKl基因表達的效果(見圖1)。圖1中的數據是以各樣品的管家基因β肌動蛋白(β -actin)表達量為參考經標 準化後的相對平均值。本實施例中，DLKl的Real-timeQuantitative PCR引物如下正向弓I物5，-gtactcggga aaggactgcc-3，反向弓I物5，-ctcgcagaaa ttgcctgaga-3，^M^fff"^ 5' -FAM-aggcacccgt ggatgatgag-TAMRA-3'以上Real-time Quantitative PCR的實驗每個都至少重複進行3次。由圖1可見，由pSUPER載體介導的RNA幹擾能使目的基因DLKl的表達在上述三種細胞內下調50-60%。實施例2瞬間克隆形成試驗(證明HCC細胞的DLKl表達抑制後其克隆形成能力 降低)在鑑定pSUPER載體介導的RNAi有效的基礎上，對實施例1中的 三種內源性表達 DLKl的細胞進行瞬間克隆形成試驗(見圖2、圖3)，並以無內源性DLKl表達的HCC細胞株 Bel-7402細胞作為對照細胞。將pSUPER 空載質粒和 pSUPER DLK874、pSUPER DLKlOl 1 質粒與 pcDNA3. 0 質粒以 10比1的比例分別共轉染入H印3B、H印G2、Huh-7和Bel-7402細胞，此處pcDNA3. 0質粒 為轉染後的細胞提供G418抗性。在轉染後，各對照組的分別取等量細胞分入IOOmm細胞 培養皿中培養，並用含適當濃度的G418的MEM或者DMEM完全培養液進行篩選並等待耐藥 克隆的形成。其中IfepG2和G418篩選濃度為ΙΟΟΟμ g/ml，H印3B、Huh_7和Bel-7402均為 600μ g/ml。待3-4周，克隆形成較為完全後染色並拍照保存。可以看到，在內源性DLKl被下調後，H印3B、HepG2和Huh_7細胞形克隆形成的數 目都有明顯下降，即其克隆形成能力被顯著削弱。而沒有內源性表達的Bel-7402細胞在同 樣的實驗中其形克隆形成的數目卻沒有明顯改變。實施例3Western Blotting分析(證明Huh_7細胞的DLKl表達被抑制後其生長 增殖能力降低)以 Huh-7 細胞為對象，將 pSUPER 空載質粒和 pSUPER DLK874、pSUPERDLK1011 質粒 與pcDNA3. 0質粒以10比1的比例分別共轉染入Huh_7細胞，構建DLKl表達抑制的Huh_7 穩定細胞株，並用Western BlottingAnalysis對於其中的4株穩定細胞株在蛋白水平上對 DLKl的表達進行鑑定(見圖4)。圖4中，pSUPER C5為pSUPER空載質粒穩定細胞株；ρ 1011B3和ρ 1011A4為穩定轉 染pSUPER DLK1011後形成的亞克隆；p874 C2為穩定轉染pSUPER DLK874後形成的亞克隆。 得到兩株DLKl穩定下調的細胞株Huh-7p874C2和Huh-7 pl011A4，而穩定株Huh_7 plOll B3中DLKl的表達並沒有下調。在建立了 DLKl穩定下調細胞株的基礎上，研究了這兩株穩定株的生長屬性是否 受DLKl下調的影響而改變，為此，比較這些細胞及對照的生長曲線。如圖5所示，當DLKl 的表達被下調後，其穩定株的生長增殖能力明顯減弱。與之比較的空載穩定細胞株PSUPER C5和內源性DLKl表達沒有被下調的對照穩定細胞株plOll B3，它們兩者的生長狀態良好。 雖然它們之間也略有差異，即pSUPER C5要比plOll B3生長增殖能力稍微更強一些，但是 這兩者總的要比P874 C2和plOll A4的生長增殖能力都要顯著得多。該實驗經重複三次 後，得到相似的結果。實施例4無胸腺的BLAB/cA裸鼠體內實驗(證明Huh_7細胞的DLKl表達被抑制 後其在動物體內成瘤能力降低)本實施例共取32隻裸鼠，分成四組，每組八隻，分別於皮下注射相同量(2X106) 的Huh-7pSUPER C5、pl011B3、p874C2和pl011A4細胞。注射後四周觀察裸鼠的生存狀態及 所成腫瘤的形態指標(見圖6)。經觀察發現，DLKl被穩定下調的Huh_7p874C2細胞在裸鼠皮下所成的腫瘤要比 對照組Huh-7pSUPER C5和pl011B3細胞在裸鼠下所成的腫瘤在體積上顯著減小，而且Huh-7pl011A4在觀察注射腫瘤細胞後六周仍然未見肉眼可見腫瘤形成，解剖證實該注射 Huh-7pl011A4細胞的8隻裸鼠確實沒有腫瘤形成。注射Huh_7pSUPER C5、pl011B3、p874C2 細胞後的所有裸鼠在四周後都形成了腫瘤，而且注射了 Huh-7pSUPER C5和pl011B3細胞所 形成的腫瘤經解剖分離後顯示其所成腫瘤實體的體積比Huh-7p874C2的更大(見圖6)，並 且該兩組腫瘤實體本身沒有顯著性差異。但注射了 Huh-7pSUPER C5和pl011B3細胞的裸 鼠與注射了 Huh-7p874C2和pl011A4細胞的裸數的體重淨重、進食能力和精神狀態在4周 後沒有顯著差異，所有裸鼠在實驗中止即解剖前全部存活。本實施例結果顯示對於內源性表達DLKl的肝癌細胞株在模型動物皮下進行的成 瘤實驗中，DLKl對於腫瘤細胞的成瘤能力起了重要的增強作用。由於DLKl被穩定下調的 細胞成瘤作用大幅度降低，甚至其中一例了 Huh-7pl011A4細胞的8隻裸鼠都沒有長出肉眼 可見的腫瘤，因此本實施例證明了 Huh-7細胞的DLKl表達被抑制後其在動物體內成瘤能力降低。實施例5DLK1促進SMMC-7721細胞的生長以上實施例均採用了 RNAi的手段使DLKl的表達受到抑制，觀察到DLKl的表達抑 制後，肝癌細胞生長增殖能力、克隆形成和成瘤能力都有顯著的降低，這提示DLKl對於肝 癌細胞的生長增殖及成瘤性起著某種維持或限制的作用。本實施例用以驗證DLKl是否可 以直接起到癌基因的作用來促進腫瘤細胞的增殖。在無內源性DLKl表達的SMMC-7721細胞中，瞬間轉入之前所構建的過表達DLKl 全長蛋白的pcDNA3. O-DLKl質粒，並以pcDNA3. 0空載質粒為對照，觀察細胞的生長增殖 曲線(見圖7)。Western Blotting Analysis中的樣品為生長曲線所用同一批轉染了 pcDNA3. 0和pcDNA3. O-DLKl質粒的SMMC-7721細胞，各樣品上樣量均為20 μ g，以鑑定轉染 質粒後DLKl在SMMC-7721細胞中表達的效率(見圖8)。在本實施例中，在SMMC-7721細胞中進行了該兩個質粒的瞬間轉染，轉染試劑為 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)，在轉染4-5小時後將含有轉染試劑的培養液撤去，更 換成新鮮的DMEM完全培養液，以儘量減少轉染試劑的毒性對於細胞的損傷。繼續培養至次 日，計數後分入96孔板內生長，每孔均勻分入1000個細胞。經過8天的觀察，發現轉染了 DLKl的SMMC-7721細胞比轉染了空載質粒的細胞生長顯著增快。本實施例結果表明DLKl能顯著增強無內源性DLKl表達的HCC細胞株SMMC-7721 的生長增殖能力。
權利要求
一種以肝癌相關基因DLK1為靶點的核糖核酸，其特徵在於它的寡核苷酸序列如下siRNASCAGCCGGCUUCAUCGACAAGAdTdT(SEQID NO8)；ASUCUUGUCGAUGAAGCCGGCUGdTdT(SEQ ID NO9)。
2.一種如權利要求1所述的以肝癌相關基因DLKl為靶點的核糖核酸在製備治療原發 性肝癌的RNA幹擾藥物中的用途。
全文摘要
本發明公開了一種以肝癌相關基因DLK1為靶點的核糖核酸，它的寡核苷酸序列如下siRNASCAGCCGGCUUCAUCGACAAGAdTdT(SEQID NO8)；ASUCUUG UCGAUGAAGCCGGCUGdTdT(SEQ ID NO9)。此外，本發明還公開了上述以肝癌相關基因DLK1為靶點的核糖核酸在製備治療原發性肝癌的RNA幹擾藥物中的用途。
文檔編號A61P1/16GK101812455SQ20101017009
公開日2010年8月25日 申請日期2006年12月11日 優先權日2006年12月11日
發明者韓澤廣, 黃健 申請人:上海人類基因組研究中心