一種新型IL-15超級激動劑融合蛋白的製作方法

2023-07-04 08:19:58

一種新型il-15超級激動劑融合蛋白
技術領域
1.本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種新型il-15超級激動劑融合蛋白。


背景技術：

2.在過去的幾十年中，癌症一般是通過化學療法、放射療法、靶向療法和手術進行治療，但免疫療法一直是基礎和臨床研究中一個快速發展的領域。通過阻斷t淋巴細胞上的pd-1和ctla-4等共抑制受體的抗體對淋巴細胞的去抑制可有效治療晚期癌症。新出現的證據表明，基於細胞因子的治療也有望用於治療癌症和病毒性疾病。白細胞介素(il)-15已成為免疫療法中極具前景的候選藥物之一，目前正在進行臨床試驗，以測試其治療晚期癌症患者的療效。il-15對於自然殺傷(nk)、nkt和記憶(m)cd8
+
t細胞的發育和功能至關重要，目前正在研究作為治療癌症的免疫治療劑。
3.然而，游離il-15具有半衰期短和體內生物活性有限等缺點，這需要進行頻繁的團注。另外，異源三聚體il-15受體複合物由獨特的il-15rα亞基、il-2/il-15rβ和常見的γ鏈/il-2rγ亞基組成。與il-2不同，il-15以高親和力結合il-15rα，il-15rα內含一個sushi結構域，能與il-15結合，並且是使結合後的il-15發揮生物學功能所必需的。然後與由il-2/il-15rβ和常見γ鏈/il-2rγ亞基組成的複合物結合，在同一細胞(順式呈遞)或不同細胞(反式呈遞)上表達。最近，受il-15的自然反式呈遞的啟發，通過在溶液中複合il-15及其高親和力受體α(il-15rα)來產生il-15超激動劑，提高了基於il-15的潛力腫瘤免疫治療。與單體il-15相比，il-15超激動劑顯示出令人鼓舞的優勢，例如由於延長半衰期而維持高循環濃度和更有效地刺激nk和cd8
+
t效應淋巴細胞。到目前為止，基於構型修飾的重組il-15超激動劑融合蛋白有三種不同形式。第一種，rli(il-15-linker-il-15rαsushi domain)，是由人il-15與人il-15rα的高親和力il-15結合域(sushi domain)通過接頭組成的重組il-15超激動劑；第二種，il-15/il-15rα-igg1-fc複合物，是通過高親和力非共價結合在溶液中偶聯il-15和il-15rα-igg1-fc嵌合體來產生。第三種，alt-803(il-15n72d/il-15rα-igg1-fc嵌合體)，是非共價結合了人il-15突變體(il-15n72d)和融合了igg1 fc結構域的人il-15rα的sushi結構域的組成的。
4.迄今為止，il-15超級激動劑，主要是alt-803，正在進行10多項臨床試驗，以測試其在晚期實體或血液惡性腫瘤患者中的安全性和潛在療效。2022年5月份immunitybio公司將il-15超激動劑alt-803(n-803)的生物製品許可申請(bla)，用於對卡介苗芽孢桿菌(bcg)無反應的高危非肌肉浸潤型的膀胱癌(cis、乳頭狀病灶)患者治療。
5.另外，已有不同的國內外研究團隊基於上述三種超激動劑，創新改進了不同融合蛋白，激活記憶樣nk(ciml-nk)的融合蛋白hcw9201(結合了il12、il15/il15 rasu和il18)、hcw9207(在hcw9201基礎上添加了抗cd16抗體)和18/12/txm(結合了il12、il15/il15rasu和il18)；目前正在i期臨床研究中產品是由il-15/il-15rα異二聚體fc融合組成。靶向纖連蛋白剪接異構體的單克隆抗體f8與il15或il15/il15 rasu形成f8-f8-il15和f8-f8-sd-il15。甚至有學者研發了一種通過使用模塊化羊駝單域抗體vhh配體來發現細
胞因子替代激動劑的策略，將vhh和scfv用於人白介素2/15、i型幹擾素和白介素10受體，生成了單鏈雙特異性配體的組合矩陣，這些配體表現出多種功能活性，包括通過替代幹擾素產生對sars-cov-2的有效抑制。
6.多項研究表明，與血清中的游離il-15相比，il-15sa的半衰期延長(約20h vs約1h)，並促進il-15對nk的反應增強約5-50倍和記憶cd8
+
t細胞增殖、細胞因子分泌和細胞毒功能，而單獨的il-15則沒有。很多情況下，藥物的分子量越大，其半衰期越長，延長藥物半衰期方法主要有偶聯人血清白蛋白(hsa)，結合內源hsa，peg化，偶聯fc和大分子蛋白質工程等。上述的多種超激動劑則利用了增大融合蛋白分子量或是添加igg1 fc結構域達到體內的半衰期延長，igg的長循環半衰期(≈2-3周)和緩慢清除部分歸因於它們與fcrn的獨特相互作用。特別是利用偶聯hsa和fc結構域，其實fc抗體工程或hsa都是通過與fcrn結合才使藥物的半衰期延長。當igg或hsa被極化上皮細胞或內皮細胞吸收時，它們被包裝成內體，在穿過細胞時酸化。在弱酸性條件(ph6.0-6.5)下環境中，hsa和igg fc結構域上的組氨酸被質子化並與fcrn結合，其同源輕鏈β2微球蛋白(β2m)被激活。β2m與fcrn的締合是與igg和hsa結合所必需的。然後將這些hsa或igg-fcrn-β2m複合物從溶酶體中運輸出去，並被循環回到它們進入的膜或轉運到相反的膜上，在那裡它們在遇到細胞外環境的生理條件(ph7.4)時被釋放。靶蛋白重新釋放至血液循環中，達到延長半衰期的目的。同時，通過人fcrn、hsa和igg fc的結合晶體結構(pdb 4n0u)進一步明確了三者的結合位點。
7.目前商業化的治療性抗體藥物和臨床階段的抗體藥物基本上含有fc結構域。另外，普通重組il-2體內半衰期僅為6.9min，而重組il-2/fc融合蛋白體內循環半衰期則延長了近700倍。全長單克隆抗體(mab)的大尺寸(≈150kda)也引起了一些擔憂。專利cn113321740a介紹了一種il15/il15 ra sushi融合了人igg4fc的融合蛋白，顯示出高效的細胞因子活性，通過人igg4fc延長了il-15的半衰期，但該融合蛋白在非還原或還原條件下分子量分別在150kda與250kd，80kda與100kda之間。最近的報告表明，全長mab的結構可能使它們在結合具有空間位阻的表位方面的效率降低，以及在有效滲透到組織中並在血管化不良的區域獲得靶點。較小的尺寸(≈50kda)和抗her2 fab顯示出增強的對正常組織和實體瘤的滲透。此外，有證據表明，較小的部分可以與隱蔽的表位結合。然而，構建功能蛋白(如細胞因子)融合蛋白時要考慮融合子的分子量，其中hsa的分子量約為66kda，fc結構域分子量大約為25-26kda。當與fc結構域或hsa融合，會引起分子量過大、效應功能降低、形成多聚體、抗原介導的特異性清除等不足。
8.為此，我們提出一種新型il-15超級激動劑融合蛋白。


技術實現要素：

9.本發明為了解決如何在取代傳統的fc結構域時保持延長融合蛋白體內循環半衰期；且顯著降低融合蛋白的分子量，製備生產簡單、成本低；更容易通過血管壁，穿透實體瘤，有利於腫瘤的治療的問題，在於提供一種新型il-15超級激動劑融合蛋白。
10.本發明採用的技術方案如下：
11.本發明第一方面提供一種新型il-15超級激動劑融合蛋白，包括通過連接子多肽組合連接的第一結構單元、第二結構單元和第三結構單元；
12.所述第一結構單元包含il-15；
13.所述第二結構單元包含可溶性il-15受體αsushi-結合結構域；
14.所述第三結構單元包含連接子。
15.進一步地，所述il-15是包括n72d突變的變體il-15蛋白。
16.進一步地，所述連接子的序列如seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3所示。
17.進一步地，所述連接子的序列插入有短fcrn結合肽或人白蛋白源多肽。
18.進一步地，所述融合蛋白的羧基端引入短fcrn結合肽或人白蛋白源多肽，所述短fcrn結合肽通過人fcrn蛋白、hsa蛋白和igg fc蛋白的結合晶體結構確定三者的結合位點。
19.進一步地，所述短fcrn結合肽的序列如seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7所示。
20.進一步地，所述人白蛋白源多肽的序列如seq id no:8序列。
21.本發明第二方面提供一種核酸，編碼如上述本發明第一方面任一項所述的一種新型il-15超級激動劑融合蛋白。
22.本發明第三方面提供一種表達載體，包括本發明第二方面所述的一種核酸。
23.本發明第四方面提供一種宿主細胞，其特徵在於，包本發明第二方面所述的一種核酸或本發明第三方面所述的一種表達載體。
24.本發明第五方面提供一種製造上述本發明第一方面任一項所述的一種新型il-15超級激動劑融合蛋白的方法，包括以下步驟：
25.步驟s1：在適合表達所述新型il-15超級激動劑融合蛋白的條件下培養權利要求10所述的宿主細胞；
26.步驟s2：收集並純化所述新型il-15超級激動劑融合蛋白。
27.本發明第六方面提供根據上述本發明第一方面任一項所述的一種新型il-15超級激動劑融合蛋白、根據本發明第二方面所述的一種核酸、根據本發明第三方面所述的一種表達載體、根據本發明第四方面所述的一種宿主細胞、根據本發明第五方面所述的製造一種新型il-15超級激動劑融合蛋白的方法在治療癌症或自身免疫疾病的用途。
28.本發明的有益效果是：
29.1、本發明通過優化il-15蛋白(il-15n72d)與il-15受體αsushi-結合結構域(il-15rαsu)的連接肽序列，引入fcrn結合多肽，取代傳統的fc結構域，卻保持了延長融合蛋白體內循環半衰期；且顯著降低融合蛋白的分子量，製備生產簡單、成本低；更容易通過血管壁，穿透實體瘤，有利於腫瘤的治療等優點。
30.2、本發明的il-15超級激動劑能高效保進淋巴細胞增殖，誘發產生細胞毒，具有生物學活性。
31.3、本發明的il-15超級激動劑能誘導形成記憶樣nk細胞(ciml-nk)，這種ciml-nk細胞的活性顯著抑制了腫瘤細胞的生長，減輕腫瘤負荷。
附圖說明
32.圖1為實施例1和實施例4中的il-15超級激動劑蛋白結構示意圖；
33.圖2為實施例1中的fcrn結合肽對應iggfc蛋白和人血清白蛋白(hsa)的fc受體蛋白結合區域；
34.圖3為實施例1中的不同il-15超級激動劑結構示意圖；
35.圖4為實施例2中的不同il-15超級激動劑蛋白sds-page圖；
36.圖5為實施例3中的小鼠淋巴母細胞系ctll-2在不同濃度il-15超級激動劑的增殖情況；
37.圖6為實施例4中的bsa和fcrn-β2m融合蛋白sds-page圖，其中m為蛋白maker，泳道1：bsa蛋白，泳道2：fcrn-β2m融合蛋白；
38.圖7為實施例4中的elisa分析不同il-15超級激動劑在ph6和7.4下對fcrn的結合能力；
39.圖8為實施例4中的不同il-15超級激動劑濃度對a-375的細胞毒性；
40.圖9為實施例4中的不同e:t比率的il-15超級激動介導的細胞毒性；
41.圖10為實施例5中的不同il-15超級激動劑聯合il12、il18對nk細胞的增殖；
42.圖11為實施例5中的中的il-15超級激動劑(alb)聯合il12、il18增強nk細胞分泌ifn-γ
43.圖12為實施例6中的小鼠肺癌模型實驗設計；
44.圖13為實施例6中的m-nsg小鼠腫瘤進展及體內生物發光成像；
45.圖14為實施例6中的m-nsg小鼠腫瘤負荷。
具體實施方式
46.以下對至少一個示例性實施例的描述實際上僅僅是說明性的，決不作為對本發明及其應用或使用的任何限制。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
47.實施例1：核苷酸序列的獲得與優化
48.根據已有資料庫中蛋白胺基酸序列的信息，查閱il-15(登錄號：np_000576)及il-15突變體(il-15n72d)、il-15ra(登錄號：np_002180)的序列信息，其中il-15ra的sushi結構域(il-15ra sushi，aa 1-66)。根據需要，插入所述兩個蛋白之間的連接子，參見圖1，連接子為常規柔性連接子參見表1中如連接子seq id no:1、seq id no:2或seq id no:3；或是在上述三種連接中再插入短fcrn結合肽序列參見表1中seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7，或alb人白蛋白源多肽參見表1中的seq id no:8。進一步在各上述融合子中設計所需羧基端引入短fcrn結合肽序列參見表1中seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:7或alb人白蛋白源多肽參見表1中的seq id no:8，其中上述結合肽序列是通過人fcrn、hsa和igg fc的結合晶體結構(pdb 4n0u)進一步明確了三者的結合位點，參見圖2。作為對照，參考專利wo2008143794的方法創建il-15n72d:il-15rαsu/fc融合複合物(alt-803)，具體的融合蛋白結構示意圖參見圖3。為了實現融合蛋白的分泌表達，在結構蛋白前面加入高分泌的信號肽序列(tpa6 signal，id no:4)，同時在融合蛋白羧基端加入(his)6純化標籤，方便後續對融合蛋白的純化。
49.將上述各目標胺基酸序列轉化為核苷酸序列，並針對可能影響抗體在哺乳動物細胞中表達的一系列參數：密碼子偏好性、gc含量(即dna的4種鹼基中鳥嘌呤g和胞嘧啶c所佔的比率)、cpg島(即cpg雙核苷酸在基因組中密度較高的區域)、mrna的二級結構、拼接位點、前成熟polya位點、內部chi位點(基因組中一段短的dna片段，在該位點附近發生同源重組的機率增加)或者核糖體結合位點、rna不穩定序列、反向重複序列及可能干擾克隆的限制
性酶切位點等進行優化；同時增加了可能會提高翻譯效率的相關序列，例如kozak序列、sd序列，以及終止密碼子。在融合蛋白的5』端分別設計上根據胺基酸序列優化而得的編碼信號肽的核苷酸序列；此外，還對融合蛋白核苷酸序列的3』端分別加上終止密碼子。
50.對所有基因進行密碼子優化合成這些基因並亞克隆到哺乳動物表達載體pcdna3.1(+)(genscript)中。
51.表1序列信息
[0052][0053]
實施例2：包含il-15/il-15rαsushi和結構域連接子的構建、表達和純化
[0054]
採用pcdna3.1(+)載體作為表達所述融合蛋白專用載體。pcdna3.1(+)載體含有融合蛋白所使用的啟動子cmv promoter、真核篩選標記g418標籤和原核篩選標籤氨苄西林(ampicilline)。基因合成得到各種融合蛋白的核苷酸序列，用hind iii和xho i對載體和目的片段進行雙酶切，回收後通過dna連接酶進行酶連，並轉化大腸桿菌感受態細胞dh5α，挑選出陽性克隆並進行質粒提取和酶切驗證，並抽提質粒並進行轉染；在轉染前一天，用無血清free style 293表達培養基(gibco)培養可懸浮培養的hek-293f細胞；在轉染當天，將細胞以每毫升1
×
106個細胞的濃度接種到新鮮培養基中，500μg l-1
的質粒dna與2mg l-1
pei(polysciences)混合併在opti prosfm培養基(4％終體積)；培養4-5d後，收集上清液並如前所述進行純化。其中純化是以利用akta fplc的親和純化柱ni-nta進行，並通過鱟試劑盒對純化的蛋白質進行內毒素檢測，確認內毒素水平低於0.01eu ml-1
。如前所述，通過sds-page評估蛋白質純度，使用nanodrop(thermo scientific)通過280nm處的吸光度測定蛋白質濃度，其中alt-803購於altor bioscience(lot#01062016)。
[0055]
經sds-page檢測如圖4所示，所得到的融合蛋白分子量正確，且純度較高，出現兩條分子量比較近的蛋白，可能是由於糖基化水平不同引起的。
[0056]
實施例3：il-15超級激動劑對體外細胞增殖的影響
[0057]
各il15融合蛋白功能評估，是通過添加細胞因子後對細胞增殖的影響。
[0058]
小鼠淋巴母細胞系ctll-2購自atcc，在96孔板中使用補充有10％fbs的prmi-1640接種的小鼠淋巴母細胞ctll-2細胞(15,000個細胞/孔)在37℃下與指定濃度的il15融合蛋
白一起孵育72h。按照產品的說明，使用cell counting試劑盒8(wst-8/cck8)(ab228554)測定細胞增殖，以重組alt-803做對照。如圖5所示，能夠促進ctll-2細胞的細胞增殖，從而證明il-15活性。與alt-803的活性相比，各il-15超級激動劑的活性有所變化，其中lin-cycy12h活性與alt-803相近，而alb、cyc-cycy12h和alb-cycy12活性略高於alt-803，可能由於多肽結構影響穩定性。
[0059]
實施例4：各il-15超級激動劑與fc功能評估
[0060]
(1)與fcrn的結合活性
[0061]
根據已有資料庫中蛋白胺基酸序列的信息，查閱igg receptor fcrn large subunit p51(登錄號6wna_a)、beta-2-microglobulin(登錄號：1a1m_b)的序列信息，根據需要，插入見圖1所述兩個蛋白之間的連接子，連接子可以是常規柔性連接子如連接子seq id no:1，在結構蛋白前面加入大腸桿菌細胞周質的信號肽序列(ompa signal，登錄號：aaa82946)，同時在融合蛋白羧基端加入(his)6純化標籤，方便後續對融合蛋白的純化，上述元件組合成：ompa signal-linker-fcrn-6*his結構。同時根據大腸密碼子偏好性、gc含量(即dna的4種鹼基中鳥嘌呤g和胞嘧啶c所佔的比率)、mrna的二級結構等進行優化合成，並克隆到pet30a+載體中，挑選出陽性克隆並進行質粒提取和酶切驗證，並轉化到大腸桿菌表達宿主菌bl21(de3)。用lb培養基37℃培養至大約od600約0.6時加入終濃度0.1mm的iptg至誘導蛋白質表達。低溫22℃誘導14h後將細胞沉澱並在1xpbs/1％(v/v)triton x100中超聲裂解。其中純化是以利用akta fplc的親和純化柱ni-nta進行。所有純化的蛋白質都儲存在無菌的1xpbs中，並補加終濃度為0.1mm苯甲基磺醯氟(pmsf)蛋白酶抑制劑，在4℃下短期儲存(《2周)，或在-20℃下用25％(v/v)甘油長期儲存。
[0062]
將上述純化好的fcrn-β2m蛋白用50mm的碳酸鹽包被緩衝液(ph9.6)溶解抗原，使抗原濃度為2μg/ml，加100μl/孔到96孔板。第二天棄去包被液後，用pbst洗滌3次，每孔加入150μl 1％bsa 37℃封閉1h。然後將全長抗體或各il-15融合蛋白加入ph7.4或ph6封閉溶液中，平板室溫育1-2h。用pbst洗滌3次，通過與1:5000稀釋的蛋白質l-hpr溫育1h，然後用鄰苯二胺(opd)顯色作為檢測結合的il-15融合蛋白。對於競爭性elisa，根據產品的說明書將il-15融合蛋白與nhs-生物素生物素化，然後用含有人血清白蛋白(sigma-aldrich)或10倍過量的未標記人血清(sigma)的pbst+3％(w/v)bsa稀釋，生物素化的il-15融合蛋白用1:10000鏈黴親和素-hrp(abcam)和opd法檢測。在分光光度儀450nm(a450)處測量吸光度，所有實驗三個重複，並用graphpad prism進行統計學分析。
[0063]
結果：純化了含有fcrn大亞基p51和beta-2-microglobulin組成的完整fcrn-β2m融合蛋白，其蛋白分子量約為43kda，參見圖6。通過elisa在ph6.0和7.4下評估不同il-15超級激動劑結合。
[0064]
fcrn-β2m，以alt-803、hsa作為對照，參見圖7，看出環狀fcrnbp-fc、線性fcrnbp-fc或fcrnbp-alb表現類似於全長igg(alt-803)或白蛋白(hsa)的結合能力，其kd值在ph值6.0時約為0.3μm-1.3μm，參見表2，其中alb、l-cyc和cyc-cycy12h的kd值接近白蛋白(hsa)的結合能力；而在ph7.4時結合親和力很低，無法檢測到(如lin)。同時，未添加fc受體(fcrn)結合多肽的il-15超級激動劑(l)均無法與fcrn結合，表明這邊功能化的il-15超級激動劑確實是由於結合多肽介導的相互作用。
[0065]
表2不同il-15超級激動劑在ph6.0結合fcrn的kd值
[0066]
蛋白kd(μm)alt-8030.9
±
0.1lndcyc1.3
±
0.1alb0.3
±
0.1lin0.06
±
0.05cyc-cycy12h0.4
±
0.03l-cyc0.4
±
0.04hsa0.3
±
0.04
[0067]
(2)細胞毒性試驗(51鉻釋放試驗)
[0068]
pbmc製備及擴增：取3位健康志願者的血液，用ficoll(購自ge)分離pbmc，細胞計數後將細胞密度用x vivo 15(購自lonza公司)培養基調整到1.5
×
105/ml，接種到6孔板中(終體積2ml)，然後加入不同濃度的上述融合蛋白，進行體外培養72h後，收穫pbmc，重新調整數量測試對人惡性黑色素瘤細胞系a-375的細胞毒性。
[0069]
人惡性黑色素瘤細胞系a-375，購自atcc。準備10％fbs的dulbecco's modified eagle'smedium(dme h-21 4.5g/liter glucose)的完全培養基培養a-375細胞至對數生長狀態，取一定細胞數量沉澱後計數，靶細胞(1.0
×
106)用
51
cr放射性標記37℃下標記2h。細胞洗滌兩次後，將5000個靶細胞/孔與50,000個效應細胞(e:t＝10:1)混合，並添加到96-v底板的每個孔中，終體積為250μl/孔，在5％co2的培養箱中在37℃下孵育4h。在4h孵育結束時，將板在234
×
g下旋轉2min，然後使用多通道移液器將50μl從每個孔中的上清液轉移到lumaplate-96。使用topcount nxt讀數器將每個上清液中存在的
51
cr發射的輻射量確定為每分鐘計數(cpm)。
[0070]
結果：參見圖8所示，最高濃度(1nm)下，所有11種形式(游離il15或10種不同fcrn結合肽il15/il15rα複合物)在激活淋巴細胞以介導a-375腫瘤溶解方面同樣有效；然而，在較低濃度下，與l和alt-803融合蛋白相比，alb、alb-cycy12h和cyc-cycy12h融合蛋白的淋巴細胞活化顯著增強。可能由於環狀或alb的結合肽相互作用導致更強的信號傳導，從而使pbmc衍生的t細胞和nk細胞更具溶細胞性，因此可以預期此類結果。可溶性il15與l或lin融合蛋白之間沒有顯著差異可以解釋為在pbmc群體中將il15呈遞給t和nk的輔助細胞(如dc細胞)上存在天然il15rα細胞。
[0071]
另外，在保持1nm的融合蛋白恆定下，測定不同有e：t比率下，其殺傷效果的細胞毒性，與剛才的數據類似，alb、alb-cycy12h和cyc-cycy12h在pbmc中比alt-803更能刺激細胞毒性，參見圖9。
[0072]
實施例5：il-15超級激動劑對細胞因子誘導的記憶樣nk細胞的誘導，nk細胞分離和擴增
[0073]
取3位健康志願者的血液，用ficoll(購自ge)分離pbmc，細胞計數後將細胞密度用x vivo15(購自lonza公司)培養基調整到2.0
×
106/ml，接種到6孔板中(終體積2ml)，使用cloudz human nk cell expansion kit(cld004，rd systems)進行體外擴增nk，並在第14d收穫細胞，並調整細胞濃度至2.0
×
106/ml，並使用rhil-12(10ng/ml)+rhil-18(50ng/ml)+rhil-15(50ng/ml)預活化16h，或用不同融合蛋白替換rhil-15，並以低劑量rhil-15
(1ng/ml)作為對照。離心收集細胞，和pbs洗2遍，製備成不同融合蛋白組合的記憶樣nk細胞，並進行預處理或是流式標記。其中細胞因子刺激16h後，加入20ul cell activation cocktail(brefeldin a和莫能菌素)處理5h，進行cd3、cd56、cd16染色。對細胞內的ifn-γ染色之前，將細胞固定和破膜。
[0074]
其中預處理和清洗後的nk細胞，用低劑量rhil-15(1ng/ml)完全培養基x vivo 15維持培養7d，並採用cfse標記nk細胞進行流式檢測，以評估不同il-15超級激動劑對nk細胞增殖的影響。在bd facsariaiii流式細胞儀上採集細胞，並使用flowjo 9.3.2版(tree star)軟體進行分析。
[0075]
結果顯示：採用不同il-15超級激動劑與il12、il18誘導形成的記性樣nk細胞(ciml-nk)，其結果與上述對小鼠淋巴母細胞系ctll-2的增殖情況類似，相對於純il15激活，用il12/18/il15超級激動劑激活誘導強烈的增殖；另外，alb和cyc-cycy12h誘導nk細胞增殖高於alt-803，參見圖10。
[0076]
另外，通過流式分析了nk(cd3-cd56
+
)的不同表面標記物的表達情況，如nkg2c、nkg2d、cd45ro和cd107a
+
等，不同的il-15超級激動劑誘導所形成的nk表型差異不大。但有一個共同的表徵，就是上調ifn-γ的表達量，大概提高50倍左右，參見圖11。
[0077]
實施例6：il-15超級激動劑在體內誘導記憶樣nk細胞抗腫瘤活性
[0078]
人肺腺癌螢光素酶標記細胞a549-luc，購自atcc。準備10％fbs的rpmi 1640的完全培養基培養a549-luc細胞至對數生長狀態，取一定細胞數量沉澱後計數，並調整細胞濃度至2.0
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106/ml。
[0079]
8-12周雄性和雌性nod-prkdc
scid il2rg
em1
/smoc m-nsg小鼠購買於上海南方模式生物科技股份有限公司，並且在室內適應7d，然後進行研究。在第-1d，小鼠通過尾靜脈注射a549-luc總細胞量約為4.0
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105，在第0、2和4d每天經尾靜脈輸注不同來源nk細胞，組別包括了溶媒、10.0
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106對照(1ng/ml il-15中的nk細胞)或用il-12/15/18激活的nk細胞(10ng/ml il-12、50ng/ml il-15和50ng/ml il-18)或18/12/il15融合蛋白(38nm)經尾靜脈注射給予小鼠(來自2個獨立實驗，每組總共2隻小鼠)，試驗設計及給藥方式如圖12所示。在注射a549-luc細胞後，通過給腹腔注射d-螢光素鉀鹽(d-luciferin pbs中150mg/kg，翌聖生物科技(上海)股份有限公司)，3min後將小鼠放入麻醉室進行麻醉，成像前以低流量(1.0l/min)o2作載氣行4％異氟醚誘導小鼠麻醉，並進行體內成鏡以確認a549-luc細胞植入。在第0、3、13和19d通過體內成像監測腫瘤負荷，通過採集總光子通量(photons/s)評估效果，並在第20d用co2對小鼠實施安樂死，並收穫組織並製備病理切片。
[0080]
結果顯示：通過測量腫瘤生物發光隨時間的變化來監測腫瘤生長，參見圖13，與用溶媒或對照il15 nk細胞治療相比，輸註記憶樣nk細胞改善了腫瘤控制；用il12/18/il-15超級激動劑誘導的ciml-nk在第19d表現出增強的腫瘤控制，參見圖14，其中cyc-cycy12h、alb組達顯著好於il12/18/15組。同時，alb-cych12h抑制效果最為明顯。這些數據表明用il-12/18/il-15超級激動劑激活nk細胞可以誘導ciml-nk細胞表型，類似於由il12/18/15組合，其在體內發揮增強的腫瘤靶標的控制。
[0081]
以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。