一種從茶葉新鮮或幹葉中提取純化egcg的方法
2023-06-01 03:13:41 1
專利名稱：：一種從茶葉新鮮或幹葉中提取純化egcg的方法
技術領域：
：本發明涉及從植物中分離純化功能性成分的一種方法，具體是從茶葉的新鮮或乾燥葉中提取純化(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯。
背景技術：
：茶葉的基源為山茶科山茶屬植物茶[Camdliasinensis(L.)O.Ktze]的葉。茶葉含有多種化學成分，類型涉及茶多酚類、生物鹼類、茶胺基酸類、脂肪類、酶類、核苷酸類、糖類、礦物質元素、揮發性物質(《中華本草》，1999)。茶多酚約佔茶葉乾重的25%,主要由兒茶素、黃酮(黃酮醇)、花色素和酚酸(縮酚酸)四大類化合物組成。其中兒茶素類是茶多酚的主體組分，約佔茶多酚總量的80%左右(茶葉生物化學(第二版)，1998)。茶多酚具有較強的抗氧化作用(趙保路，2002)和廣泛的藥理功效(劉學銘，1998),特別是其中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG，結構見圖l)以其獨特的分子結構而在抗氧化、抗突變、抗腫瘤等方面佔有重要的地位(陳宗懋，2003)，但由於茶葉中多酚主要由水溶性的縮合鞣質組成，它們化學性質不穩定，分子結構之間差別往往僅是碳構型的差別，分離工作十分困難(史國放，2001)。目前，在分離茶多酚單體-(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的過程中,用葡聚糖凝膠柱層析，常需結合其他方法如重結晶法、逆流分配法、高壓液相製備法等才可得到單體(李秉正，1992;周宏志等，2000)。因為在回收水時需較高溫度，為使茶多酚不被氧化,通常需要採用凍幹回收,所以用該法製備大量單體不經濟,而且周期長,生產效率低。採用高壓液相法也常因需結合其他方法，成本高,回收困難,不適合工業化生產。高速逆流色譜法可很好地將兒茶素單體分開,但目前只能得到少量兒茶素單體,如果進行工業化生產，還要進一步改進分離技術,而且其設備投資也十分大(戴軍，1999;杜琪珍等，1997)。綜上所述，在利用植物資源分離純化(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的過程中，主要的影響因素在於分離過程中普遍存在(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的分離效率低下、回收過程漫長，使得成本升高。因此，有必要尋找一種簡便安全經濟高效地提取純化(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的方法。本發明旨在建立一種通過多種現代分離純化技術相結合的方法，實現簡單快速、損失少的分離純化(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯。
發明內容本發明的目的在於提供一種以茶葉新鮮或者乾燥葉為原料，通過採用索氏提取器萃取技術、重結晶技術、矽膠正相分配層析技術以及低溫重結晶技術相結合，從而大量、快速獲得高純度(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的工藝方法。本發明的目的是通過以下方案來達到的以茶葉乾燥葉為原料，採用索氏提取器萃取技術、重結晶技術、矽膠正相分配層析技術以及低溫重結晶技術相結合，得到純度均達到99%以上的(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯。上述的(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯提取純化方法，其特徵在於，取一定量的乾燥茶葉，索氏提取器萃取去雜所用的溶劑為氯仿，體積為固體質量的l倍，連續萃取48h。索氏提取器萃取所用的溶劑為乙酸乙酯，體積為固體質量的l倍，連續萃取48h。濃縮索氏提取器回流萃取的乙酸乙酯到原體積的一半，加3-5倍量氯仿，有(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯粗品析出。所用矽膠為100-150目大孔矽膠，該方法中矽膠正相分配層析步驟採用上含水乙醚矽膠分配柱，保留液面，將索氏提取器回流萃取(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的粗品溶含水乙醚，上樣量矽膠質量的1/10-1/20，以流速為每小時68BV，每份1/41/2BV。用高壓液相檢測洗脫液成分，合併相同部分餾份，HPLC法分析條件色譜柱,ODS柱(4.0x150mm,5um);檢測波長280nm;柱溫箱40°C;流動相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。餾份再經少量無水硫酸鈉乾燥過夜，45'C以下回收，得(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯粗品。重結晶所用的溶劑除乙醚外，還包括二氯甲垸、氯仿、石油醚，低溫析晶溫度為-10。C4。C。提取率為1.0%，純度為99.0%。實施例2稱取新鮮茶葉10kg(乾重為2kg)，乾燥後用1倍體積氯仿在索氏提取器中連續萃取48h，再用200mL乙酸乙酯回流48h，過濾乙酸乙酯溶液，用無水硫酸鈉乾燥過夜，濃縮乙酸乙酯到原體積的一半，'加3-5倍量乾燥氯仿有白色沉澱析出,用濾紙過濾，用少量千燥氯仿衝洗，乾燥得EGCG粗品(約150g)。100g(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯粗品溶於2000mL含水乙醚，上2000g含水乙醚矽膠分配柱(內徑20cm，高150cm)，流速每小時IOL，500mL—個餾份，合併前2.5L餾份。餾份經少量無水硫酸鈉乾燥過夜，45"以下回收得樣品再溶於含水乙醚，上2000g含水乙醚矽膠分配柱(內徑20cm,高150cm)，流速每小時IOL，500mL—個餾份，合併前2.5L餾份。餾份再經少量無水硫酸鈉乾燥過夜，45'C以下回收，得若干瓶白色粉末狀物質，共約10g。每個餾份用高壓液相檢測，合併相同部分。HPLC法分析條件取其1mg溶於1mL蒸餾水，過微孔濾膜(0.45Pm)，超聲溶解，進樣量20uL;日本島津色譜柱,ODS柱(4.0x150mm,5ym);檢測波長280nm;柱溫箱40。C;流動相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。白色粉末狀物質在乙醚中在4'C結晶，獲得(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯單體析出。提取率為0.985%，純度為98.5%。本試驗中所用到的標準品購自Sigma公司。結果定量檢測分析採用下表條件tableseeoriginaldocumentpage6圖1是(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯分子式圖。權利要求1.一種從茶葉中提取純化(-)表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(EGCG)的方法，其主要特徵在於茶葉經採用索氏提取器萃取技術、重結晶技術、矽膠正相分配層析技術以及低溫重結晶技術相結合，得(-)表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸純度大於99％的純品。2.按照權利要求1所述的茶葉，其特徵在於茶葉主要來源於各品種茶葉植株的新鮮或者乾燥葉。3.按照權利要求l所述的索氏提取器萃取技術，其特徵在於索氏提取器萃取去雜所用的溶劑為氯仿，體積為固體質量的l倍，連續萃取48h。採用索氏提取器氯仿回流萃取時，可以高效去除葉綠素等脂溶性雜質，同時節省溶劑。索氏提取器萃取所用的溶劑為乙酸乙酯，體積為固體質量的1倍，連續回流萃取48h。採用索氏提取器乙酸乙酯回流萃取時，可以高效萃取(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯等茶多酚，同時節省溶劑。4.按照權利要求l所述的重結晶技術，其特徵在於濃縮索氏提取器回流萃取的乙酸乙酯到原體積的一半，加3-5倍量氯仿，有(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯粗品析出。5.按照權利要求1所述的矽膠正相分配層析技術，其特徵在於所用矽膠為100-150目大孔矽膠，該方法中矽膠正相分配層析步驟採用上含水乙醚矽膠正相分配柱，保留液面，將索氏提取器回流萃取(-)表沒食子兒茶素-3-0-沒食子酸酯的粗品溶含水乙醚，上樣量為矽膠質量的1/10-1/20，以流速為每小時68BV，每份1/41/2BV。用高壓液相檢測洗脫液成分，合併相同部分餾份，HPLC法分析條件色譜柱，ODS柱(4.0x150mm，5um);檢測波長280nm;柱溫箱40°C;流動相,乙晴乙酸乙酯0.05磷酸(12:2:86);流速,lmL/min。餾份再經少量無水硫酸鈉乾燥過夜，45。C以下回收，得(-)表沒食子兒條素-3-0-沒食子酸酯粗品。6.按照權利要求1所述的低溫析晶和重結晶技術，其特徵在於重結晶所用的溶劑除乙醚外，還包括二氯甲垸、四氯甲烷、氯仿、石油醚，低溫析晶溫度為-10"C4'C。全文摘要本發明涉及一種中草藥功能性成分的提取純化方法，目的是要提供一種簡便安全經濟高效地從茶葉中提取純化得到單體化合物(-)表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯(EGCG)的方法，所採取的技術方案是以茶葉乾燥葉為原料，採用索氏提取器萃取技術、重結晶技術、矽膠正相分配層析技術以及低溫重結晶技術相結合，得到純度均達到99％以上的(-)表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯，其提取率為1％以上。本發明所用原料為在農業生產中大都被廢棄的新鮮或者乾燥茶葉，既不破壞植物生態平衡、不影響農業生產，又能得到高純度的茶葉功能性成分。而且該方法經提取、初步除雜及再純化，簡單易行，目標化合物損失少。適用於工業應用，對產業化生產具有重要意義。文檔編號A61K36/185GK101391990SQ20081013707公開日2009年3月25日申請日期2008年9月9日優先權日2008年9月9日發明者付玉傑,姜守剛,宇張,張寶友,李慶勇,琢汪,祖元剛,馬瑞萍申請人:東北林業大學;祖元剛