焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的引物和方法
2023-05-31 11:09:26 1
焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的引物和方法
【專利摘要】本發明公開了一種焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的引物和方法，正向引物序列為SEQIDNO1；反向引物序列為SEQIDNO2；測序引物序列為SEQIDNO3；方法包括下列步驟：首先依據花生Arah6基因設計特異性PCR引物和焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的DNA，然後分別以Arah6基因的特異性引物進行PCR擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為239bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最後根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有過敏原成分。本發明所建立的花生過敏原基因Arah6焦磷酸測序方法能夠快速對目的基因進行測序，具有較高的特異性；該方法具有準確、快速、穩定性好、靈敏、特異性高的特點。
【專利說明】焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的引物和方法
[0001]【技術領域】:
本發明屬於食源性過敏原的檢測【技術領域】，涉及一種採用焦磷酸測序(.Pyrosequencing)技術檢測花生過敏原成分的引物和方法。
[0002]【背景技術】:
過敏性疾病被世界衛生組織列為21世紀重點防治的3大疾病之一，是當前世界性的重大衛生學問題，世界各國過敏反應性疾病的總發病率高達10%~30%，此類型疾病包括食物過敏、過敏性哮喘和過敏性鼻炎等，是臨床上的常見病、多發病。世界糧農組織(FAO) 1995年報告，90%以上的食物過敏是由牛奶、雞蛋、魚、貝殼海產品、花生、大豆、堅果類和小麥引起。食物中能使機體產生過敏反應抗原分子稱為食物過敏原，它們大多為蛋白質。據報導，花生是一種營養豐富、深受人們喜愛的常見食物，花生過敏佔食物過敏的10%~47%，因此花生蛋白是重要的食物過敏原。花生食物過敏可引起過敏性腸炎、過敏性皮炎等過敏性疾病，嚴重的甚至會發生過敏休克和過敏性死亡。國內外均有報導食用花生食物引起過敏性死亡的病例。鑑於目前尚無根治這類疾病的方法，為此，美國及歐盟等國家要求在食品標籤上加注花生等主要過敏原成分標籤以防止過敏患者誤食。同時，美國及歐盟等國家開始對部分進口食品進行花生過敏原抽檢，而我國食品出口企業常因食品過敏原標註不正確而遭遇退貨。因此，有必要開發一種實用、靈敏、特異的花生過敏原成分檢測方法。
[0003]花生是「90年代中國食物結構改革與發展綱要」中提出的重點開發利用植物蛋白之一。隨著國民飲食結構的變化，花生消費將不斷增加，花生過敏發病率可能會呈上升的趨勢。重組過敏原是當今乃至未來變態反應學的重要研究方向。目前國內未見利用焦磷酸測序技術進行花生過敏原成分鑑定的研究報導，本發明首次建立了基於花生Ara h 6基因的過敏原成分的焦磷酸測序快速檢測方法，將為我國進出口花生及其製品的過敏原快速檢測提供很好的技術支撐和食品安全保障。
[0004]
【發明內容】
:
本發明所要解決的技術問題是提供一種花生過敏原成分的焦磷酸測序技術檢測確證方法，以克服現有檢測技術的不足。
[0005]為解決上述技術問題，本發明的主要原理是利用焦磷酸測序技術，通過測序引物和聚合酶鏈式反應擴增單鏈脫氧核糖核酸模板雜交，與脫氧核糖核酸聚合酶、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶、螢光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶和底物(APS)、螢光素孵育，逐一加入四種三磷酸鹼基脫氧核苷酸(dNTPs):三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸dCTP、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸dGTP，如與模板配對，此三磷酸鹼基脫氧核苷酸與引物的末端形成共價鍵，釋放焦磷酸基團(PPi);腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)硫酸化酶在底物(APS)存在的情況下催化焦磷酸形成腺嘌呤核苷三磷酸，腺嘌呤核苷三磷酸驅動螢光素酶介導的螢光素向氧化螢光素轉化，氧化螢光素髮出與腺嘌呤核苷三磷酸量成正比的可見光信號；光信號由電荷耦合器件(CCD)收集並由軟體轉化為峰；每個光信號的峰高與反應中摻入的核苷酸數目成正比，腺嘌呤核苷三磷酸和未摻入的三磷酸鹼基脫氧核苷酸由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號，並再生反應體系，利用光信號轉化得到的峰圖，對樣品中的目標基因進行準確的檢測。
[0006]一種焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的方法，包括下列步驟:
首先依據花生Ara h 6基因設計特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的脫氧核糖核酸(DNA)，然後分別以Ara h 6基因的特異性引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為239 bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最後根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有花生過敏原。
[0007]設計的焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的引物:
正向引物序列為 SEQ ID NO 1:5』 - AAGCTGCGAGAGGCAGGTAGA -3』。
[0008]反向引物序列為SEQ ID NO 2:5』 -TTTGCCTGTCCTGCAACCTAT-3』 ； 5』 進行生物素
[0009]測序引物序列為SEQ ID NO 3:5』 - GCTCATCGCAGCACC -3，。
[0010]花生過敏原基因Ara h 6的目標序列為SEQ ID NO 4:TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT ;擴增片段長度為239 bp ；
具體包括下列步驟:
(一)DNA模板的製備
樣品處理:取花生等試驗材料，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勾備用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用；
(二)PCR擴增
PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94°C預變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序；
(三)焦磷酸測序
將PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose beads 3 μ L和Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
[0011]本發明所建立的花生過敏原基因Ara h 6的焦磷酸檢測方法能夠快速對目的基因進行測序，尚未出現假陽性和假陰性結果。具有較高的特異性；該方法具有快速、穩定性好、靈敏、特異高的特點。焦磷酸測序技術作為一種短片段測序方法，操作簡單方便，可程序化，能夠很好地保證測序結果的穩定性和準確性，另外該方法檢測速度快，40 min內即可準確、實時的測定出96個樣品目的片段的基因序列，可滿足快速檢測的需求，具有不可替代的作用。
[0012]【專利附圖】
【附圖說明】:
圖1為本發明實施例1 PCR擴增引物特異性實驗結果電泳圖，圖中，M:DL 500 DNAMarker ;1_10分別為花生樣品；11_17分別為綠豆、赤豆、豌豆、蠶豆、芸豆、扁豆、大豆。
[0013]圖2為本發明實施例1特異性實驗中部分焦磷酸測序結果圖。
[0014]圖3為本發明實施例2實驗結果電泳圖，圖中，M:DL 500 DNA Marker ；1為利群超市購買的花生醬樣品。
[0015]圖4為本發明實施例2實驗結果焦磷酸測序結果圖。
[0016]圖5為本發明實施例3實驗結果電泳圖，圖中，M:DL 500 DNA Marker ；1為利群超市購買的餅乾樣品。
[0017]圖6為本發明實施例3實驗結果焦磷酸測序結果圖。
[0018]【具體實施方式】:
下面通過具體實施例並結合附圖進一步闡述本發明。
[0019]實施例1:PCR擴增引物特異性實驗
(I)樣品材料:花生樣品為實驗室檢測用樣品；從青島市撫順路批發市場購買綠豆、赤豆、豌豆、蠶豆、芸豆、扁豆、大豆樣品。
[0020](2) DNA模板的製備
樣品處理:取100g花生等試驗材料，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勻備用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用；
(3)PCR擴增
PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94°C預變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序；
擴增結果見圖1，結果表明只有花生樣品能夠有效擴增出目的片斷，其餘樣品無特異性片斷出現。
[0021](4)焦磷酸測序 將花生等的PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入S印harose beads 3 yL和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
[0022]焦磷酸測序結果見圖2。
[0023]測序結果為TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT，與預期一致能夠有效測出目標序列，並鑑定出含有花生過敏原成分。
[0024]實施例2:檢測某一花生樣品中是否含有花生過敏原成分
(I)樣品材料:如海利群超市購買的花生醫樣品。
[0025](2) DNA模板的製備
樣品處理:取100 g花生醬樣品，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分液氮研磨混勻備用；
DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 UL蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用；
(3) PCR擴增
PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94°C預變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序。
[0026]擴增結果見圖3，結果表明該方法能夠有效擴增出花生醬樣品的特異性片斷。[0027](4)焦磷酸測序
將花生醬樣品的PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose beads3 μ L 和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~IOs,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
[0028]焦磷酸測序結果見圖4。
[0029]測序結果為TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT，能準確鑑定出此樣品含有花生過敏原成分。
[0030]實施例3:超市購買樣品檢驗是否含有花生過敏原成分
(I)樣品材料:從前海利群超市購買的餅乾。
[0031](2) DNA模板的製備
樣品處理:取50 g樣品，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分液氮研磨混勻備用; DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min。轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用；
(3)PCR擴增
PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94 °C預變性5 min, 94°C變性20 S，58 °C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 UL上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序。
[0032]擴增結果見圖5，結果表明餅乾樣品中能夠有效擴增出特異性片斷。
[0033](4)焦磷酸測序
將餅乾樣品的PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose beads 3μ L 和 Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ；
打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;
將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
[0034]焦磷酸測序結果見圖6。
[0035]測序結果為TCTGTTGCTGGTCGGAGGAT，表明該餅乾樣品中含有花生過敏原成分。
【權利要求】
1.一種焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的引物，其特徵在於: 正向引物序列為SEQ ID NO I ； 反向引物序列為SEQ ID NO 2 ； 測序引物序列為SEQ ID NO 3。
2.一種焦磷酸測序技術檢測花生過敏原成分的方法，其特徵在於，包括下列步驟: 首先依據花生Ara h 6基因設計特異性引物及焦磷酸測序引物；再提取待測樣品的脫氧核糖核酸(DNA)，然後分別以花生Ara h 6基因的特異性引物進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增；用瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測，若引物擴增片段長度為239 bp，則製備焦磷酸測序單鏈模板，再進行焦磷酸測序反應，最後根據PCR擴增結果和焦磷酸測序結果來判定樣品中是否含有花生過敏原成分；花生Ara h 6基因PCR及測序引物為: 正向引物序列為SEQ ID NO I ； 反向引物序列為SEQ ID NO 2 ;5』進行生物素標記； 測序引物序列為SEQ ID NO 3 ； 花生Ara h 6基因的目標序列為SEQ ID NO 4 ;擴增片段長度為239 bp ； 具體包括下列步驟: (一)DNA模板的製備 樣品處理:取花生等試驗材料，用滅菌潔淨研缽或合適的粉碎裝置將樣品充分研磨混勾備用； DNA模板的提取:取200 mg樣品於50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩衝液和20 μ L蛋白酶K溶液，充分混勻；65 °C振蕩過夜後，13 000 g離心20 min，轉移上清液700 μ L至新的離心管中；加入700 μ L三氯甲燒後用力振蕩，13 000 g離心5 min,將上清轉移到新的2 mL印pendorf離心管中；加入2倍體積的CTAB沉澱液，室溫靜置.60 min, 13 000 g離心5 min,棄去上清；加入350 μ L NaCl溶液將沉澱進行懸浮,再加入350 UL三氯甲烷，渦旋振蕩進行混勻，13 000 g離心10 min，轉移上清到新的2 mL印pendorf離心管中後加入0.8倍體積的異丙醇，室溫放置60 min, 13 000 g離心10min，棄去上清；加入500 μ L 70%乙醇溶液洗滌沉澱，溶解於100 μ L TE溶液中，立即使用或-20 1:保存備用； (二)PCR擴增 PCR反應體系:2 XGoTaq Master Mix 25 μ L，生物素標記上遊引物和下遊引物各10pmoL, DNA模板2 μ L，加無菌去離子水至50 μ L ;擴增反應參數:94°C預變性5 min，94°C變性20 s，58°C退火30 s，72°C延伸20 S，50個循環，72 °C延伸5 min, 4 °C保溫；取反應產物5 μ L上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果，其餘擴增產物用於焦磷酸測序； (三)焦磷酸測序 將PCR產物轉移至96孔PCR板中，在產物中分別加入Sepharose beads 3 μ L和Binding Buffer 47 μ L,常溫混勻 10 min ； 打開真空泵，將磁珠抓取臂(Vacuum Prep T001)在超純水中清洗30s後移到96孔PCR板中，抓取磁珠,分別在70%乙醇中清洗5~10s、Denaturation Buffer中變性5 S、Washing Buffer中清洗5~10s,關閉真空泵,將磁珠釋放入96孔測序板中，該板中預先加入測序引物 0.3 μ mol/L 和 Annealing Buffer 共 45 μ L ;將96孔測序板置80 °C溫箱2 min,冷卻至室溫後進行焦磷酸測序反應，設定程序，鹼基的加入為ATCG 6-10個重複，根據程序給定劑量(該劑量根據樣本數的多少而定，由儀器程序自動給出)，在試劑艙中加入酶混 合物、底物混合物以及四種dNTP，將試劑艙和96孔測序板放入機箱中進行反應。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540671SQ201310508383
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】房保海, 金瑩, 於仕超, 孫濤, 賈俊濤, 姜英輝, 譚樂義 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心