HDL亞組分中的膽固醇的測定方法、測定用試劑以及測定用試劑盒與流程
2023-05-31 20:00:31 2
本發明涉及樣品中的HDL亞組分中的膽固醇的測定方法、測定用試劑以及測定用試劑盒。
背景技術：
高密度脂蛋白(HDL)為脂蛋白之一，具有1.063～1.210的比重。已知HDL中的膽固醇(HDL-C)是冠狀動脈疾病(CHD)的負面危險因子。近年來，對於作為HDL的亞組分的HDL2和HDL3的臨床意義的關注提高。HDL2為比重1.063～1.125的脂蛋白，HDL3為比重1.125～1.210的脂蛋白。從肝臟或腸道分泌出的新生HDL粘著在末梢的細胞膜上，並由此處攝取游離型膽固醇，所攝取的游離型膽固醇由於HDL表面上存在的LCAT(卵磷脂膽固醇醯基轉移酶)的作用而轉化成酯型膽固醇，得到以該酯型膽固醇為核心的球狀的HDL3。HDL3進一步由於LCAT的作用而酯型膽固醇增加，成為HDL2。HDL2中的膽固醇通過兩個途徑代謝。一個是連同HDL2一起直接被攝入肝臟並以膽汁酸的形式排出的途徑，另一個是HDL2中的酯型膽固醇由於CETP(膽固醇酯轉移蛋白)的作用與極低密度脂蛋白(VLDL)、中密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)等中性脂肪豐富的脂蛋白內的中性脂肪交換而轉運至該中性脂肪豐富的脂蛋白中的途徑(膽固醇逆向轉運)。關於HDL亞組分中的膽固醇的測定方法，至今，已知有伴有HDL3與HDL2的分離步驟的沉澱法、沒有伴有HDL3與HDL2的分離步驟的勻相法。作為沉澱法，已知：使用肝素、2價金屬離子以及硫酸葡聚糖的、利用一個階段的分離操作的、樣品中的HDL3中的膽固醇的測定方法(例如，專利文獻1、非專利文獻1)；利用兩個階段的分離操作的、樣品中的HDL3中的膽固醇的測定方法(例如，非專利文獻2～4)等。利用一個階段的分離操作的、樣品中的HDL3中的膽固醇的測定方法是使樣品中的HDL3以外的脂蛋白凝聚並分離除去而測定所得到的HDL3中的膽固醇的方法。利用兩個階段的分離操作的、樣品中的HDL3中的膽固醇的測定方法為如下方法：首先，使樣品中的HDL以外的脂蛋白凝聚，通過離心分離除去HDL以外的脂蛋白，接著，使所得到的含有HDL的上清液中的HDL2凝聚，通過離心分離除去HDL2，回收上清液中包含的HDL3，測定所得到的HDL3中的膽固醇。作為勻相法，已知使用對HDL顯示出高特異性的酶以及HLB值為17以上的非離子性表面活性劑的方法(例如，專利文獻2)。正在尋求沒有伴有離心分離等煩雜的操作的、簡便並且準確的樣品中的HDL亞組分中的膽固醇的測定方法。現有技術文獻專利文獻專利文獻1：日本特開2009-207463號公報專利文獻2：日本特開2001-346598號公報非專利文獻非專利文獻1：ジャーナルオブリピッドリサーチ(JournalofLipidResearch)、49卷、5號、1130-1136頁(2008年)非專利文獻2：クリニカルケミストリ(ClinicalChemistry)、34卷、11號、2322-2327頁(1998年)非專利文獻3：クリニカルケミストリ(ClinicalChemistry)、36卷、2號、265-270頁(1999年)非專利文獻4：ジャーナルオブリピッドリサーチ(JournalofLipidResearch)、23卷、8號、1206-1223頁(1982年)
技術實現要素：
發明要解決的問題本發明的目的在於提供簡便並且準確地測定樣品中的HDL亞組分中的膽固醇的方法、試劑以及試劑盒。用於解決問題的方法本發明人為了解決上述問題，反覆進行了深入的研究，結果發現如下見解：通過使用膽固醇測定用酶、2價金屬鹽、特定的鹼金屬鹽以及硫酸葡聚糖或其鹽，能夠在沒有分離除去HDL3以外的脂蛋白的情況下測定HDL3中的膽固醇，從而完成了本發明。即，本發明涉及以下的[1]～[19]。[1]一種樣品中的HDL3中的膽固醇的測定方法，其特徵在於，使樣品與(1)膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的組合或(2)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶的組合在水性介質中反應，在沒有分離除去HDL3以外的脂蛋白的情況下測定生成的物質或消耗的物質，上述水性介質含有(a)2價金屬鹽、(b)選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽和滷化物組成的組中的鹼金屬鹽以及(c)硫酸葡聚糖或其鹽。[2]如上述[1]所述的方法，其中，2價金屬鹽為鎂鹽或鈣鹽。[3]如上述[1]或[2]所述的方法，其中，硫酸葡聚糖或其鹽在反應液中的濃度為0.75～2.6g/L。[4]如上述[1]～[3]中任一項所述的方法，其中，反應液中的來自2價金屬鹽的2價金屬離子的濃度為12～20毫摩爾/L，反應液中的來自鹼金屬鹽的鹼金屬離子的濃度為5～21毫摩爾/L。[5]一種樣品中的HDL2中的膽固醇的測定方法，其特徵在於，包括以下的步驟：(1)測定樣品中的高密度脂蛋白(HDL)中的膽固醇的步驟；(2)通過上述[1]～[4]中任一項所述的測定方法測定樣品中的HDL3中的膽固醇的步驟；和(3)從上述(1)步驟中測定的測定值中減去(2)步驟中測定的測定值的步驟。[6]一種樣品中的HDL3中的膽固醇的測定用試劑，用於通過上述[1]～[4]中任一項所述的測定方法在沒有分離除去HDL3以外的脂蛋白的情況下測定樣品中的HDL3中的膽固醇，其特徵在於，含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、過氧化氫測定用試劑、(a)2價金屬鹽、(b)選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽和滷化物組成的組中的鹼金屬鹽以及(c)硫酸葡聚糖或其鹽。[7]一種樣品中的HDL3中的膽固醇的測定用試劑，用於通過上述[1]～[4]中任一項所述的測定方法在沒有分離除去HDL3以外的脂蛋白的情況下測定樣品中的HDL3中的膽固醇，其特徵在於，含有膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶、膽固醇脫氫酶、(a)2價金屬鹽、(b)選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽和滷化物組成的組中的鹼金屬鹽以及(c)硫酸葡聚糖或其鹽。[8]如上述[7]所述的試劑，其中，還含有還原型輔酶測定用試劑。[9]如上述[6]～[8]中任一項所述的試劑，其中，2價金屬鹽為鎂鹽或鈣鹽。[10]如上述[6]～[9]中任一項所述的試劑，其中，硫酸葡聚糖或其鹽以在反應液中的濃度達到0.75～2.6g/L的含量含有。[11]如上述[6]～[10]中任一項所述的試劑，其中，2價金屬鹽以在反應液中的來自2價金屬鹽的2價金屬離子的濃度達到12～20毫摩爾/L的含量含有，鹼金屬鹽以在反應液中的來自鹼金屬鹽的鹼金屬離子的濃度達到5～21毫摩爾/L的含量含有。[12]一種試劑盒，含有第一試劑和第二試劑，用於通過上述[1]～[4]中任一項所述的測定方法在沒有分離除去HDL3以外的脂蛋白的情況下測定樣品中的HDL3中的膽固醇，其特徵在於，在第一試劑中含有(a)2價金屬鹽、(b)選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽和滷化物組成的組中的鹼金屬鹽以及(c)硫酸葡聚糖或其鹽，在第二試劑中含有膽固醇氧化酶，在第一試劑和第二試劑中的任意一者或兩者中含有過氧化氫測定用試劑，在第一試劑和第二試劑中的任意一者或兩者中含有膽固醇酯水解酶。[13]一種試劑盒，含有第一試劑和第二試劑，用於通過上述[1]～[4]中任一項所述的測定方法在沒有分離除去HDL3以外的脂蛋白的情況下測定樣品中的HDL3中的膽固醇，其特徵在於，在第一試劑中含有(a)2價金屬鹽、(b)選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽和滷化物組成的組中的鹼金屬鹽以及(c)硫酸葡聚糖或其鹽，在第二試劑中含有膽固醇脫氫酶，在第一試劑和第二試劑中的任意一者或兩者中含有氧化型輔酶，在第一試劑和第二試劑中的任意一者或兩者中含有膽固醇酯水解酶。[14]如上述[13]所述的試劑盒，其中，在第一試劑和第二試劑中的任意一者或兩者中還含有還原型輔酶測定用試劑。[15]如上述[12]～[14]中任一項所述的試劑盒，其中，2價金屬鹽為鎂鹽或鈣鹽。[16]如上述[12]～[15]中任一項所述的試劑盒，其中，硫酸葡聚糖或其鹽以在反應液中的濃度達到0.75～2.6g/L的含量含有。[17]如上述[12]～[16]中任一項所述的試劑盒，其中，2價金屬鹽以在反應液中的來自2價金屬鹽的2價金屬離子的濃度達到12～20毫摩爾/L的含量含有，鹼金屬鹽以在反應液中的來自鹼金屬鹽的鹼金屬離子的濃度達到5～21毫摩爾/L的含量含有。[18]一種樣品中的HDL2中的膽固醇的測定用試劑盒，其特徵在於，含有上述[6]～[11]中任一項所述的HDL3中的膽固醇測定用試劑和HDL膽固醇測定用試劑。[19]一種樣品中的HDL2中的膽固醇的測定用試劑盒，其特徵在於，含有上述[12]～[17]中任一項所述的HDL3中的膽固醇測定用試劑盒的第一試劑和第二試劑以及HDL膽固醇測定用試劑。發明效果通過本發明，能夠提供簡便並且準確地測定樣品中的HDL亞組分中的膽固醇的方法、試劑以及試劑盒。具體實施方式本發明的樣品中的HDL3中的膽固醇(以下記為HDL3-C)的測定方法，是無需利用離心分離等物理方法進行脂蛋白的分離除去的方法，而且是在HDL3-C的測定之前沒有除去樣品中的HDL3以外的脂蛋白中的膽固醇的情況下測定樣品中的HDL3-C的方法。本發明的HDL3-C測定方法的特徵在於，使樣品與膽固醇測定用酶在含有(a)鎂鹽或鈣鹽、(b)選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽和滷化物組成的組中的鹼金屬鹽以及(c)硫酸葡聚糖或其鹽的水性介質中反應，在沒有分離除去HDL3以外的脂蛋白的情況下測定生成的物質或消耗的物質。作為膽固醇測定用酶，可以列舉例如：膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的組合、以及膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶的組合等。本發明的測定方法包括：(1)使樣品與膽固醇測定用酶在含有(a)2價金屬鹽、(b)選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽和滷化物組成的組中的鹼金屬鹽以及(c)硫酸葡聚糖或其鹽的水性介質中反應的步驟；(2)在沒有分離除去HDL3以外的脂蛋白的情況下測定通過步驟(1)的反應生成的物質或消耗的物質的步驟；(3)使預先使用已知濃度的HDL3-C製作的標準曲線與上述(2)中的測定值相關的步驟，其中，所述標準曲線表示HDL3-C濃度與來自該生成的物質或該消耗的物質的信息量的關係；以及(4)確定樣品中的HDL3-C濃度的步驟。在此，作為步驟(1)中的膽固醇測定用酶，可以列舉上述膽固醇測定用酶等。作為步驟(2)中的、通過步驟(1)的反應生成的物質，在使用膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的組合作為膽固醇測定用酶的情況下，可以列舉過氧化氫等，在使用膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶的組合作為膽固醇測定用酶的情況下，可以列舉還原型輔酶等。作為步驟(2)中的、通過步驟(1)的反應消耗的物質，在使用膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的組合作為膽固醇測定用酶的情況下，可以列舉氧氣分子等。本發明的測定方法中，通過樣品與膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶的反應生成的過氧化氫，可以使用例如過氧化氫電極或後述的過氧化氫測定用試劑來測定。本發明的測定方法中，通過樣品與膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶的反應生成的還原型輔酶，可以使用例如吸光度法或後述的還原型輔酶測定用試劑來測定。作為吸光度法，只要是能夠使用吸光度測定還原型輔酶的方法，則沒有特別限定，可以列舉例如：在還原型輔酶的最大吸收波長(λmax＝340nm)附近的波長處測定還原型輔酶的吸光度的方法等。消耗的氧氣分子可以使用例如氧電極來測定。作為本發明的測定方法中使用的樣品，可以列舉例如全血、血漿、血清等，優選血漿以及血清。作為本發明中的膽固醇酯水解酶，只要是具有水解膽固醇酯的能力的酶，則沒有特別限定，除了例如來自動物、植物或微生物的膽固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶之外，也可以使用通過基因工程的方法製造的膽固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等。作為膽固醇酯水解酶，除了無修飾的膽固醇酯水解酶之外，也可以使用經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。另外，作為膽固醇酯水解酶，也可以使用市售品。作為市售的膽固醇酯水解酶，可以列舉：膽固醇酯酶(COE-311；東洋紡織公司制)、脂蛋白脂肪酶(LPL-311；東洋紡織公司制)、膽固醇酯酶(CHE「Amano」3；天野酶株式會社制)、膽固醇酯酶(EST「Amano」2；天野酶株式會社制)等。另外，本發明中，也可以組合使用兩種以上的膽固醇酯水解酶。作為在膽固醇酯水解酶的化學修飾中修飾該酶的基團(化學修飾基團)，可以列舉例如：以聚乙二醇作為主要成分的基團、以聚丙二醇作為主要成分的基團、具有聚丙二醇與聚乙二醇的共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合功能的基團等，優選為以聚乙二醇作為主要成分的基團。作為水溶性多糖類，可以列舉例如葡聚糖、普魯蘭多糖、可溶性澱粉等。作為用於對膽固醇酯水解酶進行化學修飾的試劑(化學修飾劑)，可以列舉同時具有上述化學修飾基團和能與酶的氨基、羧基、巰基等反應的官能團或結構的化合物等。作為能與酶中的氨基反應的官能團或結構，可以列舉例如羧基、活性酯基(N-羥基琥珀醯亞胺基等)、酸酐、醯氯、醛、環氧化物基團、1,3-丙烷磺內酯、1,4-丁烷磺內酯等。作為能與酶中的羧基反應的官能團或結構，可以列舉例如氨基等。作為與酶中的巰基具有反應性的基團或結構，可以列舉例如馬來醯亞胺基、二硫化物、α-滷代酯(α-碘酯等)等。作為化學修飾劑，也可以使用市售品。作為市售的化學修飾劑，可以列舉：具有以聚乙二醇作為主要成分的基團和N-羥基琥珀醯亞胺基的サンブライトVFM-4101、サンブライトME-050AS、サンブライトDE-030AS(均為日油公司制)、具有以聚亞烷基二醇作為主要成分的基團和酸酐結構的サンブライトAKM系列(例如，サンブライトAKM-1510等)、サンブライトADM系列、サンブライトACM系列(均為日油公司制)、具有以聚乙二醇作為主要成分的基團和環氧化物基團的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均為SheawaterPolymers公司制)、具備具有螯合功能的基團和酸酐結構的二亞乙基三胺-N,N,N』,N」,N」-五乙酸二酐(DTPAanhydride；同仁化學研究所公司制)等。膽固醇酯水解酶的化學修飾，例如可以通過以下的方法進行，但不限於此方法。首先，將膽固醇酯水解酶溶解在pH8.0以上的緩衝液(例如HEPES緩衝液)中，在0～55℃下添加0.01～500倍摩爾量的化學修飾劑，攪拌5分鐘～5小時。酶反應中，作為經過化學修飾的膽固醇酯水解酶，不僅可以使用該反應液本身，也可以使用根據需要利用超濾膜等除去未反應的化學修飾劑等後而得到的物質。作為本發明的測定方法中的膽固醇酯水解酶的濃度，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的濃度，則沒有特別限定，在反應液中的濃度通常為0.001～800kU/L，優選為0.01～300kU/L。作為本發明中的膽固醇氧化酶，只要是具有將膽固醇氧化而生成過氧化氫的能力的酶，則沒有特別限定，例如，除了來自動物、植物或微生物的膽固醇氧化酶之外，也可以使用通過基因工程的方法製造的膽固醇氧化酶等，還可以使用膽固醇氧化酶(CHODI；協和發酵工業公司制)、膽固醇氧化酶(CHODI；キッコーマン公司制)、膽固醇氧化酶(CHO-CE；キッコーマン公司制)、膽固醇氧化酶(COO321；東洋紡織公司制)、膽固醇氧化酶(COO322；東洋紡織公司制)等市售品。另外，本發明中，也可以組合使用兩種以上的膽固醇氧化酶。膽固醇氧化酶可以為無修飾的酶，也可以為經過化學修飾的酶。經過化學修飾的膽固醇氧化酶，例如可以使用上述的化學修飾劑通過上述的化學修飾方法來製備。作為本發明的測定方法中的膽固醇氧化酶的濃度，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的濃度，則沒有特別限定，在反應液中的濃度通常為0.001～800kU/L，優選為0.01～300kU/L。作為本發明中的膽固醇脫氫酶，只要是具有在氧化型輔酶存在下將膽固醇氧化而生成還原型輔酶的能力的酶，則沒有特別限定，例如，除了來自動物、植物或微生物的膽固醇脫氫酶之外，也可以使用通過基因工程的方法製造的膽固醇脫氫酶等。還可以使用膽固醇脫氫酶(CHDH「Amano」5；天野酶公司制)等市售品。另外，本發明中，也可以組合使用兩種以上的膽固醇脫氫酶。膽固醇脫氫酶可以為無修飾的酶，也可以為經過化學修飾的酶。經過化學修飾的膽固醇脫氫酶，例如可以使用上述的化學修飾劑通過上述的化學修飾方法來製作。作為本發明的測定方法中的膽固醇脫氫酶的濃度，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的濃度，則沒有特別限定，在反應液中的濃度通常為0.001～800kU/L，優選為0.01～300kU/L。在本發明的使用膽固醇脫氫酶的測定方法中，使用氧化型輔酶。作為氧化型輔酶，可以列舉例如NAD、NADP、硫代-NAD、硫代-NADP等。作為本發明的測定方法中的氧化型輔酶的濃度，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的濃度，則沒有特別限定，在反應液中的濃度通常為0.01～400毫摩爾/L，優選為0.1～100毫摩爾/L。作為本發明中的還原型輔酶，可以列舉例如NADH、NADPH、硫代-NADH、硫代-NADPH等。作為本發明中使用的2價金屬鹽，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的2價金屬鹽，則沒有特別限定，可以列舉例如鎂鹽、鈣鹽、錳鹽等，優選鎂鹽或鈣鹽。另外，本發明中，也可以使用2價金屬鹽的水合物等。作為鎂鹽，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的鎂鹽，則沒有特別限定，可以列舉例如氯化鎂、硝酸鎂、硫酸鎂等。作為鈣鹽，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的鈣鹽，則沒有特別限定，可以列舉例如氯化鈣、硝酸鈣、硫酸鈣等。作為本發明的測定方法中的2價金屬鹽在反應液中的濃度，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的濃度，則沒有特別限定，通常為12～20毫摩爾/L，優選為13～19毫摩爾/L。本發明的測定方法中的鹼金屬鹽，為選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽以及滷化物組成的組中的鹼金屬鹽，可以列舉例如：硫酸鋰、硝酸鋰、碳酸鋰、乙酸鋰、氟化鋰、氯化鋰、溴化鋰、碘化鋰、硫酸鈉、硝酸鈉、碳酸鈉、乙酸鈉、氟化鈉、氯化鈉、溴化鈉、碘化鈉、硫酸鉀、硝酸鉀、碳酸鉀、乙酸鉀、氟化鉀、氯化鉀、溴化鉀、碘化鉀等。作為本發明的測定方法中的選自由硫酸鹽、硝酸鹽、碳酸鹽、乙酸鹽以及滷化物組成的組中的鹼金屬鹽在反應液中的濃度，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的濃度，則沒有特別限定，通常為5～21毫摩爾/L，優選為6～18毫摩爾/L。本發明的測定方法中的硫酸葡聚糖或其鹽，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的硫酸葡聚糖或其鹽，則沒有特別限定，優選分子量為4萬～50萬的硫酸葡聚糖或其鹽。作為鹽，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的鹽，則沒有特別限定，可以列舉例如鈉鹽等。作為本發明的測定方法中的硫酸葡聚糖或其鹽在反應液中的濃度，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定的濃度，則沒有特別限定，通常為0.75～2.6g/L，優選為1.0～2.3g/L。本發明中使用的水性介質，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定方法的水性介質，則沒有特別限定，可以列舉例如去離子水、蒸餾水、緩衝液等，優選緩衝液。本發明的HDL3-C測定方法中的pH，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定方法的pH即可，可以列舉例如pH4～10。在使用緩衝液作為水性介質的情況下，優選使用與設定的pH對應的緩衝劑。作為緩衝液中使用的緩衝劑，可以列舉例如三(羥甲基)氨基甲烷緩衝劑、磷酸緩衝劑、硼酸緩衝劑、Good's緩衝劑等。作為Good's緩衝劑，可以列舉例如：2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、雙(2-羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙醯胺基)亞氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N,N』-雙(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙醯胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-(N-嗎啉基)-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、N,N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)、N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N,N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羥甲基)甲基]-2-羥基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N,N』-雙(2-羥基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-2-羥基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、N,N-雙(2-羥乙基)甘氨酸(Bicine)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-環己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-環己基-3-氨基-2-羥基丙磺酸(CAPSO)、N-環己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。緩衝液的濃度只要是適於測定的濃度，則沒有特別限定，優選為0.001～2.0摩爾/L，更優選為0.005～1.0摩爾/L。本發明的HDL3-C測定方法中的反應溫度，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定方法的溫度，則沒有特別限定，優選為10～50℃，更優選為30～40℃。通過廣泛使用的自動分析裝置設定的反應溫度通常為37℃。本發明的HDL3-C測定方法中的反應時間，只要是能夠進行本發明的HDL3-C測定方法的反應時間，則沒有特別限定，優選為1～60分鐘，更優選為2～30分鐘。本發明的HDL3-C測定方法中，在使用膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的組合作為膽固醇測定用酶的情況下，HDL3-C的測定可以通過測定由反應生成的過氧化氫的量來進行。生成的過氧化氫的量，可以使用例如過氧化氫電極或過氧化氫測定用試劑來測定。過氧化氫測定用試劑是用於將生成的過氧化氫轉化為能夠檢測的物質的試劑。作為能夠檢測的物質，可以列舉例如色素、發光等，優選色素。在能夠檢測的物質為色素的情況下，過氧化氫測定用試劑含有氧化發色型色原體以及過氧化物酶等過氧化活性物質。作為氧化發色型色原體，可以列舉例如後述的氧化發色型色原體。在能夠檢測的物質為發光的情況下，過氧化氫測定用試劑含有化學發光物質。作為化學發光物質，可以列舉例如魯米諾、異魯米諾、光澤精、吖啶酯等。在使用含有氧化發色型色原體以及過氧化物酶等過氧化活性物質的試劑作為過氧化氫測定用試劑的情況下，過氧化氫可以通過在過氧化活性物質存在下與氧化發色型色原體反應生成色素並測定生成的色素來進行測定。另外，在使用含有化學發光物質的過氧化氫測定用試劑的情況下，過氧化氫可以通過與化學發光物質反應產生光子並測定產生的光子來進行測定。作為氧化發色型色原體，可以列舉例如無色型色原體、氧化偶聯發色型色原體等。無色型色原體是能夠在過氧化氫以及過氧化物酶等過氧化活性物質存在下單獨轉變成色素的物質。具體而言，可以列舉四甲基聯苯胺、鄰苯二胺、10-N-羧甲基氨基甲醯基-3,7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲醯基-3,7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4,4』-雙(二甲基氨基)二苯胺鈉鹽(DA-64)、10-N-(羧甲基氨基羰基)-3,7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪鈉鹽(DA-67)、4,4』-雙(二甲基氨基)二苯胺、雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。氧化偶聯發色型色原體是在過氧化氫以及過氧化物酶等過氧化活性物質存在下由兩種化合物氧化偶聯而生成色素的物質。作為兩種化合物的組合，可以列舉偶聯劑與苯胺類的組合、偶聯劑與酚類的組合等。作為偶聯劑，可以列舉例如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯並噻唑啉酮腙等。作為苯胺類，可以列舉N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3,5-...