一種檢測黃牛mgat2基因單核苷酸多態性的方法

2023-05-31 21:49:01 1

專利名稱：一種檢測黃牛mgat2基因單核苷酸多態性的方法
技術領域：
本發明屬於分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及 一種檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態性的方法。
背景技術：
基因多態性是指不同物種或者同一物種內的不同個體間基因組序列的差異，這些 差異是由於染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括鹼基的替換、插入、缺失 以及重複序列拷貝數的變化。單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學 院的人類基因組研究中心的學者Lander(1996)提出的一類遺傳標記系統，就是指基因組 DNA序列中由於單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。它的變異形式有顛換、轉 換、插入和缺失等，主要由單個鹼基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型的鹼基變異的SNPs 約佔2/3。根據基因組中單核苷酸多態性產生的位置，可分為以下3類基因編碼區單核苷 酸多態性(Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態性(Perigenic SNPs, pSNPs)以及基因間單核苷酸多態性(Intergenic SNPs，iSNPs)。研究表明，位於編碼區內的cSNP比較少，由於它在遺傳性疾病研究中卻具有重要 意義，因此，編碼區內的cSNP的研究更受關注。基因編碼區內的cSNP又可分為2種一 種是編碼區內的同義cSNP (Synonymous cSNP)，即SNP所致編碼序列的改變並不會影響其 所翻譯的蛋白質中胺基酸序列的改變；另一種是編碼區內的非同義cSNP (Non-Synonymous cSNP)，即鹼基序列的改變將導致編碼胺基酸的改變，從而導致蛋白質中胺基酸序列的改 變，可能最終影響到蛋白質的功能。分子育種，即分子標記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection, MAS)，該技術是藉助DNA分子標記對遺傳資源或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進 行品種改良，它是利用現代分子生物學和傳統遺傳育種相結合的方法，進行新品種選育。在 肉牛育種中，人們期望，通過對生長性狀密切相關，並且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記的 選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進展。分子遺傳標記輔助選擇就是將現代生物技術與常規選擇方法相結合，通過對遺傳 標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信 息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進展。 標記輔助選擇主要經歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋 白質(酶)標記對數量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記 技術日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現 分子標記輔助選擇的目標。單核苷酸多態性(single nucleotidepolymorphism, SNP)作為 新的遺傳標記已廣泛應用於基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。MGAT2基因是脂肪沉積過程中合成二醯甘油(DAG)的重要基因。食物中的脂肪要
3進入體內，必須在胰脂肪酶的作用下發生水解，水解的代謝產物脂肪酸、2-單醯甘油在單醯 甘油轉移酶(MGAT)的催化作用下再合成DAG，進而被二醯甘油轉移酶(DGAT)催化合成三 醯甘油(TAG)而儲存在體內。MGAT催化合成DAG，是合成TAG的第一步，因而在一定程度上 MGAT決定了食物中的脂肪能否被機體所吸收，此外，MGAT催化合成的DAG是合成磷脂的前 體，同時，DAG還是細胞內重要的信號分子。總之，MGAT2基因與脂肪代謝、脂類在組織中的 沉積以及細胞內的信號轉導密切相關，因此，研究中國地方黃牛MGAT2基因的遺傳變異和 分子遺傳特徵具有重要的理論和實踐意義。目前，對於MGAT2基因的研究多在小鼠和人類上，並主要對其功能進行了大量研 究。中國地方黃牛MGAT2基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳 變異與經濟性狀(如體重、日增重等性狀)關聯的研究仍是空白。

發明內容
本發明解決的問題在於提供一種檢測的黃牛MGAT2基因單核苷酸多態性的方法， 尋找與經濟性狀關聯的SNP作為分子標記，加快具有優質經濟性狀黃牛種群的建立。本發明是通過以下技術方案來實現一種檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態性的方法，以包含MGAT2基因的待測黃牛 全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛MGAT2基因；用限制性內切酶HaeIII 消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電 泳結果鑑定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態性；所述的引物對P為上遊弓丨物:cttgaaacgg caacccaccc act 23bp ；下遊弓丨物agcccagcct gccttacgta aggc 24bp0所述的PCR擴增反應程序為94°C預變性 4min ；94°C變性 30s，69°C退火 30s，72°C延伸 15s，30 35 個循環； 72°C延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為3%瓊脂糖凝膠電泳。所述根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態性 為TT基因型表現為237bp條帶；TG基因型表現為237bp和213bp條帶；GG基因型表現 為213bp條帶。與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果本發明根據MGAT2基因的序列設計引物，分別以3種黃牛品種的基因組DNA為模 板，進行PCR擴增，並對PCR產物進行測序，將測序後得到的黃牛MGAT2基因的部分序列與 NCBI公布的序列進行比較，發現在MGAT2基因的第495位存在SNP多態性。當MGAT2基因 第495位的T突變為G時，導致編碼第28位的密碼子由ATT突變為ATG，從而形成錯義密碼 子突變，即由28Ile突變為28Met，這樣使得翻譯過程中所編碼的胺基酸發生了改變。針對上述第495位的SNP多態性，本發明還公開了其篩查和檢測方法，通過設計特 定的引物P進行PCR擴增後，用特定的限制性內切酶酶切鑑定，能夠簡單、快速、成本低、精 確的檢測其單核苷酸的多態性當495bp由T突變為G時，PCR擴增MGAT2基因產物的第494bp 498bp序列為GGCC，形成了限制性內切酶HaeIII的酶切位點，當在495位點不突變時，PCR擴增MGAT2基 因產物的第494bp 498bp序列為TGCC，限制性內切酶HaeIII不能識別；這樣就可以對該 位點SNP多態性進行檢測。由於MGAT2基因功能涉及初生重、體重、日增重、體高、體重、體 斜長、坐骨端寬等生長性狀，本發明提供的檢測方法為MGAT2基因的SNP與黃牛部分生長性 狀(初生重、體重和日增重)進行關聯分析，結果表明該位點能夠作為提高黃牛早期體重的 分子標記。以便用於中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良 的黃牛種群。


圖1為黃牛MGAT2基因PCR產物電泳結果；圖2為黃牛MGAT2基因包含第495位的多態位點的237bp PCR產物的HaeIII酶 切電泳結果；圖3a、圖3b和圖3c為黃牛MGAT2基因SNP的不同基因型測序圖。
具體實施例方式本發明通過對黃牛MGAT2基因第495位點錯義突變可能產生編碼蛋白構象發生 變化的單核苷酸多態性進行檢測，以便用於中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇，快速 建立遺傳資源優良的黃牛種群。下面結合具體樣本的檢測和性狀關聯對本發明做進一步的 詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。a、黃牛MGAT2基因含第一外顯子區域PCR引物的設計以 NCBI 所公布的牛(NC_007313. 4，Region :54835024_54847263)序列為參考，利 用Primer 5. 0設計能夠擴增包含黃牛MGAT2基因第一外顯子區域的PCR引物，其引物序列 如下上遊弓丨物:cttgaaacgg caacccaccc act 23 ；下遊弓丨物agcccagcct gccttacgta aggc 24 ；以上述引物對黃牛基因組擴增，能夠擴增包含黃牛MGAT2基因(NC_007313. 4序 列)5' UTR及第一外顯子區域第283bp 519bp的237bp的基因片段，擴增後片段的電泳 檢測如圖1所示，其中，泳道1 6為檢測片段，泳道M為Marker ；對擴增的片段進行測序 鑑定後，其中，第471bp 519bp的序列為如下所示CCTGTACTGG ATCTTCTGCT TC !^ΤΤ| GCCTT ACGTAAGGCAGGCTGGGCT ；經過分析，發現MGAT2基因第一外顯子區域第495位(即MGAT2基因⑶S區第84 位)存在SNP多態性當MGAT2基因第495位的T突變為G時，導致編碼第28位的密碼子由 ATT(如框線所示序列)突變為ATG，從而形成錯義密碼子突變，即由28Ile突變為28Met。當495bp由T突變為G時，PCR擴增MGAT2基因產物的第494bp 498bp序列為 GGCC，形成了限制性內切酶HaeIII的酶切位點，當在495位點不突變時，PCR擴增MGAT2基 因產物的第494bp 498bp序列為TGCC，限制性內切酶HaeIII不能識別；這樣就可以對該 位點SNP多態性進行檢測。b、以引物P進行PCR擴增待測黃牛的MGAT2基因片段1、黃牛樣本的採集本發明具體以3個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體採集樣本見表1 陝西秦川牛(265)，河南平頂山市郟縣紅牛(428)，河南南陽牛(250)。表1黃牛樣本的採集及其來源
品種樣品 數樣品名 稱樣品來源採樣方式秦川牛 (QC cattle)265血樣採自陝西省秦川牛場、陝西省秦川牛良 種繁育中心和陝 西省大荔縣靜脈採血 16號針 頭郟縣紅牛 (JX cattle)428血樣採自河南省平頂山市郟縣紅牛育種中 心及各村鎮靜脈採血 16號針 頭南陽牛 (NY cattle)250血樣採自河南省南陽市黃牛良種繁育場(國 家級黃牛保種 場)靜脈採血 16號針 頭2、血樣基因組DNA的分離、提取、純化1)冷凍血樣(主要為血細胞)室溫解凍，轉移500 μ L至1. 5mL Eppendorf離心 管，加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C )，棄去上清液，重複上述步驟 至上清液透明、沉澱呈淡黃色；2)在離心管中加入DNA抽提緩衝液500 μ L，搖動，使血細胞沉澱脫離離心管管壁， 37°C 水浴 Ih ；3)加蛋白酶K至3yL(20mg/mL)並混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加 ι μ L蛋白酶κ混勻繼續消化直至澄清；4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另一 1. 5mL離心管中，重複一次；5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另 一 1. 5mL離心管中；6)加氯仿、異戊醇混合液(24 1) 500 μ L，充分混勻20min, 4°C，12000r/min離心 lOmin，將上清液轉入另一 1. 5mL離心管中；7)加0. 1倍體積的NaAc緩衝液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉動離心管， 直至白色的絮狀沉澱析出，_20°C保存30 60min ；8) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉澱2次；9) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發乾淨；10)乾燥後的DNA溶於80 IOOyL的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解，0.8%瓊 脂糖凝膠電泳檢測其質量，-80°C保存。11) 500 μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1 %，加入蛋白酶K至終濃 度達到50 μ g/mL ；12) 5 °C 保溫 IOh 左右；13)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 1)和氯仿分別抽提一次；14) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；15)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉澱DNA ；16)倒掉液體，70%乙醇洗滌後晾乾，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待檢測。3、PCR 擴增PCR反應體系採用混合加樣法，即根據每一個反應體系所需的各種組分的數量和 1次反應所需的PCR反應的個數，算出各種反應組分的總量，加入到1個1. 5mL離心管中，充
6分混勻後瞬時離心，再分裝到每個0. 2mLEppendorf PCR管中，然後加入模板DNA，再瞬時離 心後進行PCR擴增；15 μ L PCR反應體系為包括0. 375U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)， 2 X Buffer 7. 50 μ L (內含 Mg2+、dNTPs 等)(北京天根科技有限公司 Mix)，50ng/ μ L 含 MGAT2 基因的黃牛基因組DNA 0. 50 μ L, IOpmol/μ L上、下遊引物各0. 30 μ L ；具體為滅菌超純水(H2O)，6·25 μ L ;2 XBuffer(內含 Mg2+、dNTPs 等)，7. 50 μ L ； 引物 P 上遊引物(10pmol/L) yL，0. 30 ；引物 P 下遊引物(10pmol/L)，0. 30 μ L ;Taq DNA 聚 合酶(2. 5U/ μ L) ,0. 15 μ L ；DNA 模板(50ng/ μ L) ,0. 50 μ L ；總體積 15. 00 μ L。PCR反應程序95°C 預變性 5min;
94°C 變性 30 s，
69.0°〇退火30 3，I 30 35個循環；
72 0C 延伸 15 s，-72°C延伸 IOmin ；4°C保存。對3個黃牛品種的943個樣本的基因組DNA進行PCR擴增，獲得943個個體的黃 牛MGAT2基因中包含該SNP位點的237bp的DNA片段。c、HaeIII酶切消化PCR擴增的MGAT2基因片段1、HaeIII酶切反應消化體系(25 30 μ L) 10 ~ 15μ L PCR產物，IOX緩衝液 (含 BSA)2.5 3.0yL，HaeIII(10U/yL)1.0 1. 5 μ L，滅菌純水(H2O) 11. 5 ~ 16. 5 μ L02、酶切消化條件37°C恆溫培養箱中消化5 10h。d、HaeIII消化PCR產物後瓊脂糖凝膠電泳分析1)製作3%的瓊脂糖凝膠，點樣後120V電壓電泳60min，電泳結束後EB染色；2)待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統 成像；3)根據瓊脂糖凝膠電泳結果分析SNP多態性用BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統照相分析，判斷SNP的多態性MGAT2基因的第495bp由T突變為G時，PCR擴增的MGAT2基因產物的第494bp 498bp序列為GGCC，限制性內切酶HaeIII識別後在GG/CC對擴增片段酶切，將擴增片段切 為2段；而MGAT2基因的第495bp沒有發生突變，限制性內切酶HaeIII不能識別，擴增片段 不能被切割；由於黃牛為2倍體，所以黃牛基因組的MGAT2基因的第495位的SNP的多態性的 瓊脂糖凝膠電泳結果為TT基因型表現為237bp條帶；TG基因型表現為237bp和213bp條帶；GG基因型表 現為213bp條帶；由於25bp較小，在瓊脂糖電泳分析中不太清楚，但通過237bp和213bp這 兩條條帶還是能夠準確的鑑別TT基因型、TG基因型和GG基因型不包含213bp條帶的為 TT基因型個體；不包含237bp條帶為GG基因型個體；同時包含237bp和213bp條帶為TG 基因型個體。
如圖2所示的酶切後的凝膠電泳檢測結果，其中，泳道4包含237bp和213bp條 帶，其為TG基因型個體，泳道1、泳道3、泳道5、泳道6和泳道7不包含213bp條帶，為TT基 因型個體，泳道2不包含237bp條帶，為GG基因型個體，泳道M為Marker I (600bp, 500bp, 400bp,300bp,200bp,IOObp)。4)不同基因型個體PCR產物的測序驗證對不同基因型個體PCR產物分別進行正反雙向測序；同時，進行SNP位置分析，結 果表明包含237bp和213bp條帶的雜合子TG基因型個體其495位的測序圖的確表示為T 或G，如圖3a所示，自左向右第8個峰為兩個峰，而GG基因型、TT基因型分別為G、T，如圖 3b、3c所示。 e、黃牛MGAT2基因SNP位點的頻率統計分析1)基因和基因型頻率基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數佔總個體數的比率。 Ptt = Νττ/Ν，其中Ptt代表某一位點的TT基因型頻率；Ntt表示群體中具有TT基因型的個體 數；N為檢測群體的總數量。基因頻率是指一個群體中某一基因數對其等位基因總數的相對比率。計算的公式
可以寫成PT = (2NTT+NTal+NTa2+NTa3+NTa4+……+NtJ/2N式中，Pt表示等位基因T頻率，Ntt表示群體中具有TT基因型的個體數量，Nlai表 示群體中具有Tai基因型個體數量，al-an為等位基因T的η個互不相同的復等位基因。本研究所涉及的等位基因為T和G，所以具體的基因頻率計算公式為Pg = (2Ngg+Ntg) /2NPt = (2Ntt+Ntg) /2N式中，PT，Pg分別表示等位基因T和G等位基因的頻率，Ntt、Ntc和Nee分別表示TT、 TG和GG基因型的個體數量，N表示總群體數目。如表2所示的基因頻率分布表，在不同黃牛品種MGAT2基因SNP中的T等位基因 頻率變化幅度在69. 0% 87. 4%，G等位基因頻率變化幅度在12. 6% 31. 0%之間。表2黃牛MGAT2基因第495位SNP基因頻率分布表
黃牛品種基因型的觀測數目總計等位基因頻率TTTGGG943TG秦川牛2035752650.8740.126郟縣紅牛246171114280.7750.225南陽牛118109232500.6900.310
f、黃牛MGAT2基因SNP位點基因效應的關聯分析基因型數據=HaeIII識別的基因型(TT、TG和GG)生產數據南陽牛初生重，以及6月齡、12月齡、18月齡和24月齡的體重和日增重 數據。關聯分析模型先對數據進行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數據校正； 根據數據特徵，應用SAS(9. 1)軟體的GLM過程分析基因型和瓶中對各性狀效應。在對基因
型效應進行分析時採用了固定模型Yijkl = μ +BFi+Monthj+Gk+e^其中Yukl為性狀觀察值，μ為總體均值，BFi為第i個品種和農場的固定效， Monthj為第j個月觀測的固定效應，Gk為第k個單SNP標記基因型的固定效應，eiJkl為隨機 誤差。結果表明(見表3)在6月齡TT基因型的個體體重和日增重均高於GG和TG基 因型個體且TT基因型與GG基因型間差異到達了顯著(P 0.05)。說明TT基因型可 以作做為一個提高黃牛早期體重和日增重的候選分子遺傳標記。表3MGAT2基因第495位多態位點與南陽牛各月齡體重和日增重之間的方差分析
年齡生長性狀第495位SNP基因型GG (Mean士 SE)TG (Mean 士 SE)TT (Mean士SE)出生體重(kg)29. 85 ±0. 70829. 463 + . 35430. 2806月齡體重Ckg)143. 300±6· 013β155. 550±3. 007ab160. 313±2. 377a曰增重(kg)0. 630 ±0. 0324b0. 700±0. 0162ab0. 724±0. 0128a12月齡體重Ckg)215. 000±6· 794218. 275±3. 397225. 281 ±2. 686日增重(kg)0. 398±0. 03840. 348±0. 01920. 361±0. 015218月齡體重(kg)299. 900 + 9. 498292. 525±4. 749299. 953 士 3. 754曰增重(kg)0. 472±0· 05080. 413±0. 02540. 415±0. 020124月齡體重Ckg)359. 000±12. 657356. 975±6. 329369. 375 ±5. 003日增重(kg)0. 328±0. 03820. 358±0. 01910. 386±0. 0151 注具有相同字母表示差異不顯著(P >0.05)，字母不同表示差異顯著(P < 0. 05)。
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權利要求
一種檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，以包含MGAT2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛MGAT2基因；用限制性內切酶HaeIII消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態性；所述的引物對P為上遊引物cttgaaacgg caacccaccc act 23bp；下遊引物agcccagcct gccttacgta aggc24bp。
2.如權利要求1所述的檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述 的PCR擴增反應程序為94°C預變性4min ；94°C變性30s，69°C退火30s，72°C延伸15s，30 35個循環；72°C延 伸 IOmin0
3.如權利要求1所述的檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述 的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度為3 %瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權利要求1所述的檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，根據 瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態性為TT基因型表現為 237bp條帶；TG基因型表現為237bp和213bp條帶；GG基因型表現為213bp條帶。
全文摘要
本發明公開了一種檢測的黃牛MGAT2基因單核苷酸多態性的方法，以包含MGAT2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增黃牛MGAT2基因；用限制性內切酶HaeIII消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態性。由於MGAT2基因功能涉及體重、日增重生長等性狀，本發明提供的檢測方法為MGAT2基因的SNP與生長性狀關係的建立奠定了基礎，以便用於中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK101921848SQ20101023690
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月26日 優先權日2010年7月26日
發明者劉俊霞, 屈煉, 楊明娟, 藍賢勇, 陳宏 , 雷初朝 申請人:西北農林科技大學