從羅漢果中製備高純度羅漢果苷v的方法
2023-06-01 02:25:46
專利名稱:從羅漢果中製備高純度羅漢果苷v的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域：
的提取方法，具體說是一種從羅漢果中製備高
純度羅漢果苷v的方法。
技術背景
羅漢果，為葫蘆科植物羅漢果屬多年生草質藤本植物羅漢果 Momordicagrosvenori Swingle的乾燥成熟果實，為一常用中藥，具有清熱解暑、潤肺止渴 作用，臨床上可用於治療高血壓、肺結核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性支氣管炎和急慢性扁 桃體炎等多種疾病。同時羅漢果也是常用飲料乾果，提取物是常用甜味劑，大量出口，遠銷 東南亞、加拿大、美國等地。
羅漢果及羅漢果提取物中的主要成分為葫蘆烷型三萜皂苷，包括羅漢果苷 IV(mogroside IV)、羅漢果苷V(mogroside V)、賽門苷I (siamenoside 1)、11_氧_羅漢果 苷V(ll-oxo-mogroside V)、羅漢果苷IIE(mogroside IIE)、羅漢果苷IIlE(mogroside IIIF) 等多種皂苷，其中羅漢果苷V為主要皂苷類成分。羅漢果苷V也是羅漢果的主要活性成分 成分，具有抗腫瘤、降血糖等多種藥理作用。羅漢果苷V也是羅漢果的主要甜味成分，其甜 度高，為蔗糖的四百多倍。由於製藥工業及食品工業的發展，目前國內外對高純度的羅漢果 V的需求量非常大，但目前尚未見有高純度的羅漢果苷V生產、銷售。雖有多項專利申請涉 及羅漢果甜苷的提取，方法簡單，但所得產物為羅漢果總苷，提取物中羅漢果苷V的純度均 較低，不超過80X，限制了其應用範圍。雖然，但得到的產品中羅漢果苷V的純度並不高，不 適用於製備95%以上高純度的羅漢果苷V。
經對現有技術文獻的檢索發現，公開號為CN1706861A的中國發明專利，於 2005. 12. 14公開的"高純度羅漢果苷V的製備方法和用途"，其製備過程中醇浸膏用D101 型大孔樹脂分離後採用正相矽膠柱層析，然後進一步採用C18柱層析，洗脫液經HPLC檢查。 該方法採用大孔樹脂除雜，操作較繁瑣；反相層析時採用丙酮-水洗脫，有一定毒性；純度 和收率都有一定的局限性。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種從羅漢果中製備高純度羅漢
果苷V的方法，簡化了工藝，具有純度高、收率高、生產成本低等優點。
本發明通過以下技術方案實現，具體包括如下步驟
(1)先將羅漢果粉碎成粗粉，加入5_10倍的71% _95%的乙醇回流提取211-611，濾 過，回收乙醇得醇浸膏。上述操作可重複1次_2次。
(2)將醇浸膏懸浮於水(水用量為醇浸膏重量5-10倍)，用水飽和的乙酸乙酯萃 取1次-3次，每次乙酸乙酯體積為水溶液體積的0. 5-1. 0倍，回收乙酸乙酯母液，乙酸乙酯
浸膏棄去。
(3)繼用水飽和的正丁醇萃取1次_3次上步驟母液，每次正丁醇體積為水溶液體積的0. 5-1. 0倍，回收正丁醇得正丁醇浸膏。
(4)將正丁醇浸膏通過聚醯胺柱(聚醯胺的用量為正丁醇浸膏重量的20-60 倍)，水洗至無羅漢果苷V洗出(檢測方法矽膠G薄層檢測，展開劑CHClfMe0H-H20 65 : 30 : 5，羅漢果苷V的Rf為0. 4)。水洗液濃縮得粗皂苷。
(5)粗皂苷進行矽膠柱層析(矽膠用量為粗皂苷重量的30-100倍)，氯仿-甲 醇-水洗脫(65 : 30 : 1 65 : 30 : 5)，收集含羅漢果苷V在40X以上的組分(檢測 方法高效液相色譜HPLC法，以十八烷基鍵合矽膠為填充劑；以乙腈-水(24 : 76)為流動 相；檢測波長為210nm，流速1. Oml/min)，合併，回收溶劑，得羅漢果苷v粗品。 (6)取羅漢果苷v粗品進行C18反相矽膠柱層析(反相矽膠用量為羅漢果粗苷v 重量的50-200倍)，水洗，棄去水洗液，20 % 50%乙醇洗脫，收集純度在95%以上的流分 (檢測方法同步驟(5))。合併保留時間相同的組分，回收溶劑，即得純度大於95%以上的羅 漢果苷V。經IR、MS H-NMR、"C-NMR數據與羅漢果苷V—致，其結構式如下
本發明有益效果通過上述方法分離製備的羅漢果皂V，純度高，均在95X以上， 且生產成本低。採用乙酸乙酯去除了提取物中大部分脂溶性成分(如脂肪酸、油脂、黃酮、 植物甾醇)，簡化了羅漢果皂V的純化工藝。採用正丁醇從羅漢果抽提羅漢果總苷，避免了 提取物中大量糖分的幹擾，同時也避免了用大孔樹脂柱層析操作麻煩的缺點；對於提取物 剩餘的水溶性黃酮、水溶性色素及鞣質等雜質，通過聚醯胺柱層析方法去除，進一步簡化了 工藝。反相柱層析採用稀醇溶液作為流脫劑，簡化了工藝，具有純度高、收率高、生產成本 低。通過綜合運用聚醯胺、矽膠、反相矽膠等不同分離原理的介質進行純化，
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下進行
實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。
實施例1
本實施例1是在以下實施條件和技術要求條件下實施的
1.羅漢果乾果1Kg，加入5L 71X的工業乙醇回流提取2h，濾過，濾液回收乙醇 (可再次用於藥材提取)，得醇浸膏94g。[0019]
2.取醇浸膏，加入470mL的水懸浮，然後用235mL水體積的水飽和的乙酸乙酯萃 取，分離乙酸乙酯層，減壓回收乙酸乙酯(可再次用於萃取)，得乙酸乙酯浸膏13g。
3.乙酸乙酯萃取後的水溶液繼續用水飽和的正丁醇萃取，用量為235mL。分離出 正丁醇，減壓回收正丁醇(可再次用於萃取)，得正丁醇浸膏15g。
4.將正丁醇浸膏用水溶解後，通過裝有300g 100-200目的聚醯胺柱(柱直徑 4. 5cm，幹法裝柱，溼法上樣)，水洗至無羅漢果苷V流出(檢測方法矽膠G薄層檢測，展開 劑CHCl3-MeOH-H20 65 : 30 : 5，羅漢果苷V的Rf為0. 4)，收集流出液及水洗液。減壓收 盡溶劑，得粗皂苷12. 5g。
5.將粗皂苷進行矽膠柱層析(矽膠用量375g， 300-400目；柱直徑4. 5cm，幹法裝 柱，幹法上樣)，氯仿-甲醇-水(65 : 30 : 1)洗脫，流速5ml/min，每份收集50ml，收集含 羅漢果苷V在40%以上的組分(檢測方法高效液相色譜HPLC法，以十八烷基鍵合矽膠為 填充劑；以乙腈_水24 : 76為流動相；檢測波長為210nm，流速1. Oml/min)，合併，減壓回 收溶劑，得羅漢果苷v粗品2. 2g。
6.取羅漢果苷v粗品進行反相柱層析，反相矽膠用量110g(矽膠粒徑400-600 目；柱直徑4. 5cm，溼法裝柱，溼法上樣)，水洗，棄去水洗液；20 %醇洗，流速2ml/min，每份 收集10ml，對每一流分進行高效液相色譜(HPLC)檢測(檢測方法同5)，合併保留時間相同 且純度大於95%的組分，減壓濃縮，即得純度大於95%以上的羅漢果苷V 464mg，經檢驗其 純度為96. 7% 。
實施例2
本實施例2是在以下實施條件和技術要求條件下實施的
1.羅漢果乾果1Kg，加入10L 95X的工業乙醇回流提取6h，濾過，濾液回收乙醇
(可再次用於藥材提取)，得浸膏。重複上述操作2次，得醇浸膏168g。
2.取醇浸膏，加入1680mL的水懸浮，然後用1680mL的水飽和的乙酸乙酯萃取，分
離乙酸乙酯層，減壓回收乙酸乙酯(可再次用於萃取)，得浸膏。重複上述操作2次，合併浸
膏，得乙酸乙酯浸膏21g。
3.乙酸乙酯萃取後的水溶液繼續用水飽和的正丁醇萃取，用量為1680mL。分離出 正丁醇，減壓回收正丁醇(可再次用於萃取)，得浸膏。重複上述操作2次，合併浸膏，得正 丁醇浸膏29g。
4.將正丁醇浸膏用水溶解後，通過裝有1740g的60-100目聚醯胺柱(柱直徑 8.0cm，溼法裝柱，溼法上樣)，水洗至無羅漢果苷V流出(檢測方法矽膠G薄層檢測，展開 劑CHCl3-MeOH-H20 65 : 30 : 5，羅漢果苷V的Rf為0. 4)，收集流出液及水洗液。減壓收 盡溶劑，得粗皂苷21g。
5.將粗皂苷進行矽膠柱層析，矽膠用量為2100g(柱直徑8. Ocm， 100-200目；溼法 裝柱，溼法上樣)，氯仿-甲醇-水(65 : 30 : 5)洗脫，流速10ml/min，每100ml收集l份， 收集含羅漢果苷V在40X以上的組分(檢測方法高效液相色譜(HPLC)法，以十八烷基鍵 合矽膠為填充劑；以乙腈-水24 : 76為流動相；檢測波長為210nm，流速1.0ml/min)，合 並，減壓回收溶劑，得羅漢果苷v粗品3. 4g。
6.取羅漢果苷v粗品進行反相柱層析，反相矽膠用量為680g(矽膠粒徑300-400 目；柱直徑6. 5cm，溼法裝柱，溼法上樣)，水洗，棄去水洗液；50 %醇洗，流速5ml/min，每30ml收集1份，對每一流分進行高效液相色譜(HPLC)檢測(檢測方法同5)，合併保留時間 相同且純度大於95%的組分，減壓濃縮，即得高純度的羅漢果苷V 623mg，經檢驗其純度為 95. 3%。
實施例3
本實施例3是在以下實施條件和技術要求條件下實施的
1.羅漢果乾果1Kg，加入7. 5L 80%的工業乙醇回流提取4h，濾過，濾液回收乙醇 (可再次用於藥材提取)，得浸膏。重複上述操作l次，得醇浸膏133g。
2.取醇浸膏，加入998mL的水懸浮，然後用749mL體積的水飽和的乙酸乙酯萃取， 分離乙酸乙酯層，減壓回收乙酸乙酯(可再次用於萃取)，得浸膏。重複上述操作l次，得乙 酸乙酯浸膏18g。
3.乙酸乙酯萃取後的水溶液繼續用水飽和的正丁醇萃取，用量為749mL。分離出 正丁醇，回收正丁醇(可再次用於萃取)，重複上述操作1次，合併浸膏得正丁醇浸膏21g。 4.將正丁醇浸膏用水溶解後，通過裝有840g 60-100目聚醯胺柱(柱直徑6. 5cm， 幹法裝柱，溼法上樣)，水洗至無羅漢果苷V流出(檢測方法薄層檢測矽膠G薄層檢測，展開 劑CHCl3-MeOH-H20(65 : 30 : 5，羅漢果苷V的Rf為0. 4)，收集流出液及水洗液。減壓收 盡溶劑，得粗皂苷17g。
5.將粗皂苷進行矽膠柱層析，矽膠200-300目，用量為1105g(柱直徑6. 5cm，溼法 裝柱，幹法上柱)，氯仿-甲醇-水(65 : 30 : 3)洗脫，流速5ml/min，每50ml收集1份， 收集含羅漢果苷V在40X以上的組分(檢測方法高效液相色譜(HPLC)法，以十八烷基鍵 合矽膠為填充劑；以乙腈-水24 : 76為流動相；檢測波長為210nm，流速1.0ml/min)，合 並，減壓回收溶劑，得羅漢果苷v粗品2. 9g。
6.取羅漢果苷v粗品進行反相柱層析，反相矽膠用量為362.5g(矽膠粒徑 200-300目；柱直徑6. Ocm，溼法裝柱，溼法上樣)，水洗，棄去水洗液；35X醇洗，流速3m1/ min，每20ml收集1份，對每一流分進行高效液相色譜(HPLC)檢測(檢測方法同5)，合併保 留時間相同且純度大於95X的組分，減壓濃縮，即得高純度的羅漢果苷V 561mg，經檢驗其 純度為96. 1%。
實施例4
本實施例4是在以下實施條件和技術要求條件下實施的
1.羅漢果乾果1Kg，加入5L 95X的工業乙醇回流提取3h，濾過，濾液回收乙醇 (可再次用於藥材提取)，得浸膏。重複上述操作l次，得醇浸膏86g。
2.取醇浸膏，加入860mL的水懸浮，然後用860mL體積的水飽和的乙酸乙酯萃取， 分離乙酸乙酯層，減壓回收乙酸乙酯(可再次用於萃取)，得浸膏。重複上述操作l次，得乙 酸乙酯浸膏15g。
3.乙酸乙酯萃取後的水溶液繼續用水飽和的正丁醇萃取，用量為430mL。分離出 正丁醇，回收正丁醇(可再次用於萃取)，重複上述操作1次，合併浸膏得正丁醇浸膏20g。 4.將正丁醇浸膏用水溶解後，通過裝有960g 60-100目聚醯胺柱(柱直徑6. 5cm， 幹法裝柱，溼法上樣)，水洗至無羅漢果苷V流出(檢測方法薄層檢測矽膠G薄層檢測，展開 劑CHCl3-MeOH-H20(65 : 30 : 5，羅漢果苷V的Rf為0. 4)，收集流出液及水洗液。減壓收 盡溶劑，得粗皂苷14. 5g。
6[0046] 5.將粗皂苷進行矽膠柱層析，矽膠200-300目，用量為1150g(柱直徑6. 5cm，溼法 裝柱，幹法上柱)，氯仿-甲醇-水(65 : 30 : 3)洗脫，流速5ml/min，每50ml收集1份， 收集含羅漢果苷V在40X以上的組分(檢測方法高效液相色譜(HPLC)法，以十八烷基鍵 合矽膠為填充劑；以乙腈-水24 : 76為流動相；檢測波長為210nm，流速1.0ml/min)，合 並，減壓回收溶劑，得羅漢果苷v粗品2. 5g。
6.取羅漢果苷v粗品進行反相柱層析，反相矽膠用量為300g(矽膠粒徑200-300 目；柱直徑6. Ocm，溼法裝柱，溼法上樣)，水洗，棄去水洗液；40 %醇洗，流速3ml/min，每 20ml收集1份，對每一流分進行高效液相色譜(HPLC)檢測(檢測方法同5)，合併保留時間 相同且純度大於95%的組分，減壓濃縮，即得高純度的羅漢果苷V 525mg，經檢驗其純度為 97. 1%。
權利要求
一種從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵在於，具體包括如下步驟(1)先將羅漢果粉碎成粗粉，加入5-10倍的70％-95％的乙醇回流提取2h-6h，濾過，回收乙醇得醇浸膏；(2)將醇浸膏懸浮於水，用水飽和的乙酸乙酯萃取1次-3次，每次乙酸乙酯體積為水溶液體積的0.5-1.0倍，回收乙酸乙酯母液；(3)繼用水飽和的正丁醇萃取1次-3次上步驟母液，每次正丁醇體積為水溶液體積的0.5-1.0倍，回收正丁醇得正丁醇浸膏；(4)將正丁醇浸膏通過聚醯胺柱，水洗至無羅漢果苷V洗出，水洗液濃縮得粗皂苷；(5)粗皂苷進行矽膠柱層析，氯仿-甲醇-水洗脫，收集含羅漢果苷V在40％以上的組分，合併，回收溶劑，得羅漢果苷v粗品；(6)取羅漢果苷v粗品進行C18反相矽膠柱層析，水洗，乙醇洗脫，收集純度在95％以上的流分，合併保留時間相同的組分，回收溶劑，即得純度大於95％的羅漢果苷V。
2. 如權利要求
1所述的從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵是，步驟(2) 中所述的醇浸膏懸浮於水，水用量為醇浸膏重量的5-10倍。
3. 如權利要求
1所述的從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵是，步驟(4) 中所述正丁醇浸膏通過聚醯胺柱，聚醯胺的用量為正丁醇浸膏重量的20-60倍。
4. 如權利要求
1所述的從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵是，步驟(4) 中，檢測所述水洗至無羅漢果苷V洗出的檢測條件為用矽膠G薄層檢測，展開劑選用 CHCl3-MeOH-H20，配比是65 : 30 : 5，羅漢果苷V的Rf為0. 4。
5. 如權利要求
1所述的從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵是，步驟(5) 所述的矽膠柱中，矽膠用量為粗皂苷重量的30-100倍；氯仿-甲醇-水洗脫各比例為65 : 30 : 1-65 : 30 : 5。
6. 如權利要求
1所述的從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵是，步驟(5) 中收集含羅漢果苷V在40%以上的組分，其收集檢測方法選用高效液相色譜法。
7. 如權利要求
6所述的從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵是，所述高效 液相色譜法的檢測條件為以十八烷基鍵合矽膠為填充劑，以24 : 76比例的乙腈-水為流 動相，檢測波長為210nm，流速1. Oml/min。
8. 如權利要求
1所述的從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵是，步驟(6) 中乙醇濃度為20% -50%。
9. 如權利要求
1至8任一項所述的從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，其特徵 是，步驟(1)可重複操作1次_2次。
專利摘要
一種從羅漢果中製備高純度羅漢果苷V的方法，屬於高純度物質的提取方法。方法步驟為(1)先將羅漢果粉碎成粗粉，加入乙醇回流提取，濾過，得醇浸膏；(2)將醇浸膏懸浮於水，用乙酸乙酯萃取1次-3次，回收乙酸乙酯母液；(3)繼用正丁醇萃取1次-3次母液，回收正丁醇得正丁醇浸膏；(4)將正丁醇浸膏通過聚醯胺柱，水洗液濃縮得粗皂苷；(5)粗皂苷進行矽膠柱層析，氯仿-甲醇-水洗脫，收集得羅漢果苷v粗品；(6)取羅漢果苷v粗品進行層析，水洗，乙醇洗脫，收集純度大於95％以上的羅漢果苷V。本發明簡化了工藝，具有純度高、收率高、生產成本低等優點。
文檔編號A23L1/236GKCN101029071 B發布類型授權 專利申請號CN 200710039130
公開日2010年5月19日 申請日期2007年4月5日
發明者周兢, 屠鵬飛, 李曉波, 王夢月 申請人:上海交通大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (3), 非專利引用 (1),