一種突變的人基因核苷酸序列編碼多肽的製作方法

2023-05-31 12:57:41 1

專利名稱：一種突變的人基因核苷酸序列編碼多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因序列多肽，具體涉及一種突變的人基因核苷酸序列編碼多肽，即一種突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列編碼多肽。
腫瘤細胞的基本生物學特徵是增殖失控、分化受阻、基因結構和功能異常。傳統化療和放療主要抑制腫瘤細胞的繼續增殖和殺傷腫瘤細胞，但由於藥物缺乏特異性，同時損傷正常細胞，以致於治療中產生毒副作用。隨著對腫瘤形成機制的深入研究，已經發現正常細胞與腫瘤細胞在表達某些凋亡相關分子方面存在差異，這給人們研究如何有效殺傷腫瘤細胞，保護正常組織帶來了希望，同時也為抗癌藥物研究提供了新的發展方向。
腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TNF-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL，亦稱Apo2L)是新近發現的一種細胞毒蛋白，其分子結構與TNF和FasL(CD95)相近，屬於TNF家系成員。TNF和Fas L(CD95L)雖然也具有快速誘導細胞凋亡的作用，但因其選擇性不強，臨床應用顯示明顯的副作用。如在肝細胞中表達豐富的CD95，CD95L作用後迅速誘導肝細胞凋亡，致使肝細胞受損，產生嚴重的毒副作用。TRAIL具有快速誘導多種腫瘤細胞發生凋亡的作用，而正常細胞不受TRAIL的影響，因此TRAIL作為藥物進行腫瘤治療具有很好的應用前景。人TRAIL由281個胺基酸組成，研究發現全序列的TRAIL蛋白無誘導腫瘤細胞凋亡的活性，而去除N端部分胺基酸後，具有快速誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
本發明根據Pitti等人(Pitti RM at alInduction of apoptosis byApo-2 ligant，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Bio Chem.1 996，27112687-12690)報導，TRAIL 全序列cDNA表達蛋白無誘導細胞死亡活性，而去除N端部分胺基酸後，具有快速誘導腫瘤細胞凋亡的作用。
本發明的目的在於通過改造，獲得具有快速誘導腫瘤細胞凋亡性死亡的作用。
根據TRAIL的特點，本發明人在已有的克隆的人體TRAIL全序列cDNA的基礎上，去除了N端編碼1-113胺基酸的鹼基序列，同時改造去除了第119和第120兩個胺基酸的鹼基，保留了編碼C端胺基酸的DNA序列，獲得具有一段能編碼168個胺基酸缺失體TRAIL的cDNA。缺失體TR AIL cDNA與表達載體連接，通過篩選獲得表達質粒，然後轉化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得了穩定的工程菌株，產物鑑定表明表達的缺失體TRAIL即本發明具有快速誘導腫瘤細胞凋亡性死亡的作用，體外抗腫瘤活性明顯高於原TRAIL，在動物模型中，也顯示了明顯的抗腫瘤活性，使它有希望成為一種新型的基因工程抗腫瘤藥物。
本發明提供了一種突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列編碼多肽，該多肽序列包括一種缺失突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體cDNA序列和一種缺失突變兩個胺基酸的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列(命名為mh TRAIL)。
本發明的另一目的是提供了一種利用重組技術生產上述一種缺失突變兩個胺基酸的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列編碼多肽的方法。
該方法包括下列步驟(1)表達質粒的構建選取去除N端1-113的編碼序列的cDNA分子作為模板，並考慮表 達 需 要 設 計 引 物， 上 遊 引 物 5『-CATATGGTGAGAGAAAGAGGTAGAGT-3』，其中包含了一個限制性內切酶Nde位點和一個起始胺基酸Met的序列，同時去除了編碼119和120胺基酸的鹼基序列CCT CAG；下遊引物5『-GATCAAGCTTTTAGCCAACT-3』，其中包含了限制性內切酶HindIII的位點。PCR擴增該片段基因，反應參數95℃，20秒；55℃，30秒；72℃，30秒，共35個循環，PCR擴增產物經Nde I和Hind III酶切，其片段大小大約為550鹼基對(圖1)，經進一步測序確認其序列的正確性(圖2)。將兩個不同酶切的粘性末端片段克隆至大腸桿菌蛋白表達載體pRSET上，得到本發明的表達質粒；(2)質粒的表達和純化將本發明表達質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，經氨苄青黴素篩選，挑取單菌落在5ml LB培養基中30℃培養過夜，以1∶50轉接至大瓶，30℃繼續培養至OD 0.8-1.0，加入IPTG誘導表達本發明，4小時後離心收集菌體，將菌體懸於裂菌緩衝液，加入溶菌酶室溫處理1小時，之後冰浴條件下超聲裂菌至無完整桿菌。為確定本發明在大腸桿菌中的位置，分別取誘導表達後離菌上清、離菌沉澱、超聲破菌後離心上清及超聲破菌後離心沉澱進行SDS-PAGE電泳，包涵體用8mol/L尿素在室溫下抽提2小時以上，離心收集上清為粗提物，再經PBS梯度透析，獲得復性樣品，最後經柱層析純化。
本發明的產品經SDS-PAGE還原電泳確定本發明分子量約為19kDa，略低於原TRAIL的分子量，測定蛋白含量並進一步鑑定產物，應用免疫印跡法，將本發明與抗TRAIL抗體結合併顯色，表明本發明具有TRAIL的免疫原性，結合測序結果，可以肯定本發明即為缺失體TRAIL(圖4、5)。經蛋白掃描確定純度大於90％，可用於抗腫瘤活性的研究。
本發明的產品具有誘導人體白血病細胞凋亡作用細胞凋亡期間由於核酸酶的作用，使核染色質DNA降解，並產生不同長度(180-200bp)的寡聚核小體片段，此特徵是判斷細胞凋亡發生的重要指標。應用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測了本發明在25ng/ml濃度條件下分別作用0-4小時後，誘導人早幼粒白血病細胞的DNA降解狀況。操作步驟如下所述。
經本發明處理不同時間的細胞約3×106，用含2mmol/L EDTA的PBS洗2次，加入0.3ml TBE緩衝液，0.25％NP-40以及RNase A(終濃度為1％)，混勻後，37℃溫育30分鐘；再加入蛋白酶K(終濃度為1mg/ml)37℃繼續溫育30分鐘。取上清液45ul加5ul上樣緩衝液，在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳，紫外檢測儀觀察結果並照相。
本發明具有抑制人體惡性腫瘤細胞體外生長活性三種腫瘤(乳腺癌、結腸癌、腎癌)細胞按一定比例分別接種在含5％小牛血清的RPMI1640的96孔培養板中，在5％CO2，37℃條件下培養24小時。換用含不同濃度本發明以及非臨床用標準樣品(Leinco Technologies Inc.產品)的新鮮培養基，繼續培養48小時。SRB方法染色處理細胞，經酶標儀比色測定，並計算GI50(50％細胞生長抑制所需要的濃度)。
表1 標準品TRAIL與本發明抑制三種腫瘤細胞體外生長的比較(GI50，ng/ml)腫瘤細胞類型 標準樣品本發明乳腺癌30.0 20.0結腸癌20.0 10.0腎癌 50.0 20.0本發明具有抑制小鼠異種移植人體腫瘤細胞生長效應無菌條件下以勻漿法製備人體結腸癌細胞懸液，按適當密度每鼠腋皮下接種0.2ml，次日按設計方案靜脈注射給予本發明，連續十天，停藥後繼續觀察 天，解剖各組動物，剖取腫瘤稱重，按下列公式計算抑瘤率
表2 本發明對小鼠異種移植人體腫瘤細胞生長的抑制效應處理組動物數處理劑量抑瘤率(％)陰性對照 12 //5-氟尿嘧啶625mg/kg48.15mg/kg本發明 615mg/kg 74.6本發明 65mg/kg 65.76本發明 61.67mg/kg52.5

圖1本發明DNA序列測定2缺失突變體TRAIL的胺基酸序列圖3聚合酶鏈反應產物電泳鑑定泳道1為DNA分子大小Marker(1Kb DNA Ladder)泳道2-4分別是從3個相同PCR反應體系中取5ul進行電泳，結果表明擴增DNA片段與預期大小相符。
圖4本發明表達形式1為低分子量蛋白電泳Marker，2為未經IPTG誘導表達形式；3為IPTG誘導後的表達形式；4為裂解上清；5為包涵體形式。
圖5本發明蛋白印跡分析鑑定經抗TRAIL單克隆抗體鑑定的表達產物1為本發明；2為原TRAIL。
圖6本發明誘導腫瘤細胞凋亡的DNA降解圖1.DNA Marker2.本發明作用0小時3.本發明作用0.5小時4.本發明作用1小時5.本發明作用2小時6.本發明作用3小時7.本發明作用4小時實施例1本發明表達質粒的構建本發明根據Pitti等人(Pitti RM at alInduction of apoptosis byApo-2 ligant，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Bio Chem.1996，27112687-12690)報導，TRAIL全序列cDNA表達蛋白無誘導細胞死亡活性，而去除N端部分胺基酸後，具有快速誘導腫瘤細胞凋亡的作用。選取去除N端1-113的編碼序列的cDNA分子作為模板，並考慮表達需要設計引物，上遊引物5『-CATATGGTGAGAGAAAGAGGTAGAGT-3』，其中包含了一個限制性內切酶Nde位點和一個起始胺基酸Met的序列，同時去除了編碼119和120胺基酸的鹼基序列CCT CAG；下遊引物5『-GATCAAGCTTTTAGCCAACT-3』，其中包含了限制性內切酶HindIII的位點。PCR擴增該片段基因，反應參數95℃，20秒；55℃，30秒；72℃，30秒，共35個循環。
PCR擴增產物經Nde I和Hind III酶切，其片段大小大約為550鹼基對(圖1)，經進一步測序確認其序列的正確性(圖2)。將兩個不同酶切的粘性末端片段克隆至大腸桿菌蛋白表達載體pRSET上，得到本發明的表達質粒。實施例2本發明的表達和純化將本發明表達質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，經氨苄青黴素篩選，挑取單菌落在5ml LB培養基中30℃培養過夜，以1∶50轉接至大瓶，30℃繼續培養至OD 0.8-1.0，加入IPTG誘導表達本發明，4小時後離心收集菌體。將菌體懸於裂菌緩衝液，加入溶菌酶室溫處理1小時，之後冰浴條件下超聲裂菌至無完整桿菌。為確定本發明在大腸桿菌中的位置，分別取誘導表達後離菌上清、離菌沉澱、超聲破菌後離心上清及超聲破菌後離心沉澱進行SDS-PAGE電泳。本發明主要以包涵體形式存在大腸桿菌內(圖3)。包涵體用8mol/L尿素在室溫下抽提2小時以上，離心收集上清為粗提物，再經PBS梯度透析，獲得復性樣品，最後經柱層析純化，經SDS-PAGE還原電泳確定本發明分子量約為19kDa，略低於原TRAIL的分子量。測定蛋白含量並進一步鑑定產物，應用免疫印跡法，將本發明與抗TRAIL抗體結合併顯色，表明本發明具有TRAIL的免疫原性，結合測序結果，可以肯定本發明即為缺失體TRAIL(圖4、5)。經蛋白掃描確定純度大於90％，可用於抗腫瘤活性的研究。
權利要求
1.一種突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列多肽，其特徵在於該多肽序列包括一種缺失突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體cDNA序列和一種缺失突變的兩個胺基酸的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列。
2.根據權利要求1所述的一種突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列，其特徵在於其中所述的一種缺失突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體cDNA序列是通過在已有的克隆的人體TRAIL全序列cDNA的基礎上，去除了N端編碼1-113胺基酸的鹼基序列，同時改造去除了第119和第120兩個胺基酸的鹼基，保留了編碼C端胺基酸的DNA序列，獲得具有一段能編碼168個胺基酸缺失體TRAIL的cDNA。
3.根據權利要求1所述的一種突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列，其特徵在於其中所述的一種缺失突變的兩個胺基酸的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列是將缺失突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體cDNA序列與表達載體連接，通過篩選獲得表達質粒，然後轉化大腸桿菌獲得的。
4.一種如權利要求1所述的一種突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列的製備方法，其特徵在於該方法包括下列步驟(1)表達質粒的構建選取去除N端1-113的編碼序列的cDNA分子作為模板，並考慮表 達 需 要 設 計 引 物 ， 上 遊 引 物 5『-CATATGGTGAGAGAAAGAGGTAGAGT-3』，其中包含了一個限制性內切酶Nde位點和一個起始胺基酸Met的序列，同時去除了編碼119和120胺基酸的鹼基序列CCT CAG；下遊引物5『-GATCAAGCTTTTAGCCAACT-3』，其中包含了限制性內切酶HindIII的位點。PCR擴增該片段基因，反應參數95℃，20秒；55℃，30秒；72℃，30秒，共35個循環，PCR擴增產物經Nde I和Hind III酶切，其片段大小大約為550鹼基對(圖1)，經進一步測序確認其序列的正確性(圖2)。將兩個不同酶切的粘性末端片段克隆至大腸桿菌蛋白表達載體pRSET上，得到本發明的表達質粒；(2)質粒的表達和純化將本發明表達質粒轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，經氨苄青黴素篩選，挑取單菌落在5ml LB培養基中30℃培養過夜，以1∶50轉接至大瓶，30℃繼續培養至OD 0.8-1.0，加入IPTG誘導表達本發明，4小時後離心收集菌體，將菌體懸於裂菌緩衝液，加入溶菌酶室溫處理1小時，之後冰浴條件下超聲裂菌至無完整桿菌。為確定本發明在大腸桿菌中的位置，分別取誘導表達後離菌上清、離菌沉澱、超聲破菌後離心上清及超聲破菌後離心沉澱進行SDS-PAGE電泳。本發明主要以包涵體形式存在大腸桿菌內(圖3)。包涵體用8mo/L尿素在室溫下抽提2小時以上，離心收集上清為粗提物，再經PBS梯度透析，獲得復性樣品，最後經柱層析純化。
5.一種如權利要求1所述的一種突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體序列的活性蛋白多肽在治療癌症藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種突變的人腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)的cDNA序列和由該序列編碼的多肽。本發明的多肽具有快速誘導腫瘤細胞凋亡性死亡的作用。
文檔編號C07K14/525GK1380339SQ0110594
公開日2002年11月20日 申請日期2001年4月10日 優先權日2001年4月10日
發明者李伯剛, 高小平, 劉忠榮 申請人:成都地奧製藥集團有限公司