多功能菌株及其應用的製作方法

2023-05-31 10:47:41

專利名稱：：多功能菌株及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物製劑領域，具體地涉及一株多功能土壤芽孢桿菌及其應用。
背景技術：
：在我國，長期過量施用化肥導致了土壤板結、肥力退化等一系列問題。同時，人們對農產品的農藥、化肥殘留問題日益關注，綠色食品、有機食品受到巿場的熱捧。在這種大環境下，我國生物肥料產業得以迅速發展，生物肥料的年產量達到400萬口屯，在農業部登記的產品種類多達12個，包括根瘤菌肥料、固氮菌肥料、解磷菌類肥料、解鉀菌類肥料等。但是，目前巿場上銷售的生物肥料普遍存在著功能單一、質量不穩定、土壤適應性差等問題，從而限制了其規模化推廣。克服上述問題的關鍵在於篩選出抗逆性強的多功能菌株。本發明正是基於此思路，經多年實驗篩選出具備多種功能的土壤芽孢桿菌，並改進了現有的孢子粉生產工藝，實現了生物菌肥生產的突破。
發明內容(一)要解決的技術問題本發明的目的是提供一株多功能土壤芽孢桿菌，本發明的另一目的是提供利用該菌株生產孢子粉的方法。(二)技術方案本發明所述的土壤芽孢桿菌(^^7/船eJ"//n'c船)YZH-002，該菌株已於2008年2月25曰被保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCCNo.2315。本發明所述的土壤芽孢桿菌(B""7/we^p/w'cw)CGMCCNo.2315,具備改善土質、分泌植物生長激素、防治病蟲害等多種功能。本發明提供了一種生產前述土壤芽孢桿菌孢子粉的方法，包括如下步驟:(1)種子活化挑取冷凍保藏的菌液，在固體培養基平板上劃線，於30。C培養14-16h;然後挑取單菌落接種於液體培養基中，於30°C、250rpm振蕩培養至OD600nm-l-1.5;(2)芽孢生成取步驟(1)所得菌液0.2mL，接種於裝有固體培養基的克氏瓶中，塗勻，於3(TC培養3-4天，直至培養基表面形成明顯的菌苔，得到芽孢種子；(3)接種種子罐用無菌水衝洗菌苔，接種於滅過菌的種子罐，接種溫度70-80°C,發酵參數設置為溫度30-35°C，罐壓0.03-0.05MPa,通氣量l:0.2-0.3(m3/t/h)，pH6.8-7.2，攪拌轉數200-400rpm,培養時間20-24h;(4)發酵培養將步驟(3)得到的種子液輸入發酵罐，發酵參數的設置同步驟(3)，培養時間28-34h;(5)噴粉將步驟(4)發酵得到的菌液輸入貯存罐，按菌液碳酸鈣=1:3-4的比例加入碳酸鈣，攪拌混勻；然後進入噴霧塔，進口溫度為180-220。C，出口溫度為50-60°C，得到孢子粉。上述方法中所用到的培養基的組成具體如下(1)活化菌種所用的培養基組成按質量百分比計為(用於種子活化和芽孢生成步驟)蛋白腖5~10%o葡萄糖3~8%o酵母粉0.5~2%。5NaCl3~6%0KC10.5~1.5%oMgS04.7H200.2~0.4%opH7.0;(2)發酵培養基按質量百分比計為(用於接種罐和發酵培養步驟)::玉米漿1~10%豆餅粉0.5~5%澱粉0.5~5%NH2S040.01~0.3%K2HP040.01~0.1%MgS040.1%FeS040.01%pH7.0~7.2。本發明所述的土壤芽孢桿菌可應用於製備生物有機肥、生態配方肥、生物農藥以及土壤改良劑等生物製劑。相應地，本發明所述的孢子粉生產方法也可應用於上述製劑的生產。(三)有益效果本發明所述的土壤芽孢桿菌耐鹽、耐熱、抗逆性強，能夠分泌吲哚丙酸、玉米素、赤黴素等多種植物激素，並能防治線蟲及多種真菌病害，適用於生產生物有機肥、生態配方肥、生物農藥以及土壤改良劑等生物製劑。同時，本發明提供的孢子粉生產方法有效減少了核心菌株的死亡率，使得存活率達93%以上，並將孢子粉的保質期提高到12個月以上。圖l、幾丁質分解實驗結果圈。本發明所述的土壤芽孢桿菌(5a"7/w5e^p/2/cw5)YZH-002,該菌株已於2008年2月25日被保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC,保藏編號為CGMCCNo.2315。具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例l本發明所述的土壤芽孢桿菌的性質及功能實驗本發明所述的土壤芽孢桿菌是發明人從水稻根際土壤中分離得到，其性質和功能如下。一、形態及生理生化特性G+、杆狀，大小為(0.4-0.6)x(1.5-3)pm;芽孢側生，多數為橢圓形；VF,培養液pH7.07.2;pH5.5-9.8下生長+。在厭氧培養基上不生長，在7.5%以上的NaCl中不生長；澱粉水解—，明膠液化+，分解酪素+，接觸酶+，氧化酶-，檸檬酸鹽利用—，葡萄糖產氣—，葡萄糖產酸+,L-阿拉伯糖產酸-，木糖產酸-，甘露醇產酸+，硝酸鹽還原+，甲基紅試驗+。以上所用到的檢測方法均為微生物實驗教科書中的經典方法，+表示實驗結果陽性，-表示實驗結果陰性。二、功能實驗1.植物生長激素的分泌表1激素種類分泌量7所用的測定方法為經典的液相色譜法。2、幾丁質分解在活化培養基(見本申請技術方案的記載)中添加濃度為2%的幾丁質,平板培養所述的土壤芽孢桿菌。36h後，觀察到菌落周圍出現透明圈，如附圖l所示，表明該菌具備很強的分解幾丁質能力。幾丁質是線蟲卵外壁和致病真菌細胞壁的主要成分，這說明該菌具備防治線蟲和真菌病害的功能，田間實驗也證明其效果顯著。3.抗逆性實驗3.1耐鹽性取35。/n的(NH4)2S04溶液10mL，加入土壤芽孢桿菌菌液1亳升(發酵菌液，菌體數量40-50億個/mL)，浸泡土壤芽孢桿菌0~15天。用10mL蒸餾水代替35。/。的(NH4)2S04浸泡做對照。然後，將浸泡液加入裝有90mL無菌水的三角瓶(內有無菌坡璃珠)中，50100rpm振蕩培養30min。取1mL稀釋液加入裝有9mL無菌水的試管中，搖勻，重複上述操作，直至稀釋至104倍。取1(T6、10—7、10—s倍的稀釋液各0.1mL置於平板中，塗勻，3(TC培養12天，計數。存活率結果如表2所示，從表2可看出該菌株有較強的耐鹽性。表2耐鹽性實驗tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage93.2耐熱性:以8(TC和9(TC為溫度處理，以1、3小時為時間處理，以自然保存溫度為對照，對所述土壤芽孢桿菌進行耐熱處理。然後取1亳升菌液(發酵菌液，菌體數量40-50億個/mL)加入裝有99ml無菌水的三角瓶(內有無菌玻璃珠)中，50~100rpm振蕩培養30min。取1mL稀釋液加入裝有9mL無菌水的試管中，搖勻，重複上述操作，直至稀釋至10—8倍。取10"6、10—7、10—8倍的稀釋液各O.lmL置於平板中，塗勻，3(TC培養12天，計數，結果如表3所示。根據表3的數據，我們可以看出8(TC處理3小時的菌劑中芽孢存活率為93.25%,表現出很高的耐熱性。表3耐熱性實驗tableseeoriginaldocumentpage9實施例2孢子粉的製備(1)種子活化挑取冷凍保藏的菌液，在固體培養基平板上劃線，於3(TC培養14h;然後挑取單菌落接種於液體培養基中，於3(TC、250rpm振蕩培養至OD6ran=1.5;(2)芽孢生成取步驟(1)所得菌液0.2mL，接種於裝有固體培養基的克氏瓶中，塗勻，於3(TC培養3天，直至培養基表面形成明顯的菌苔，得到芽孢種子；(3)接種種子罐用無菌水衝洗菌苔，接種於滅過菌的種子罐，接種溫度70。C，發酵參數設置為溫度35"C，罐壓0.03MPa，通氣量1:0.2(m3/t/h)，pH6.8，攪拌轉數250rpm，培養時間20h;(4)發酵培養將步驟(3)得到的種子液輸入發酵罐，發酵參數的設置同步驟(3)，培養時間34h;(5)噴粉將步驟(4)發酵得到的菌液輸入貯存罐，按菌液碳酸鈣=1:3的比例加入碳酸鈣，攪拌混勻；然後進入噴霧塔，進口溫度為220°C，出口溫度為6(TC，得到孢子粉。以上所用培養基見技術方案。經檢測，孢子存活率達95%,孢子粉的保質期18個月。實施例3孢子粉的製備(1)種子活化挑取冷凍保藏的菌液，在固體培養基平板上劃線，於30匸培養16h;然後挑取單菌落接種於液體培養基中，於3(TC、250rpm振蕩培養至00600鵬=1;(2)芽孢生成取步驟(1)所得菌液0.2mL，接種於裝有固體培養基的克氏瓶中，塗勻，於3(TC培養4天，直至培養基表面形成明顯的菌苔，得到芽孢種子；(3)接種種子罐用無菌水衝洗菌苔，接種於滅過菌的種子罐，接種溫度80。C,發酵參數設置為溫度30r,罐壓0.05MPa,通氣量1:0.3(m3/t/h)，pH7.2，攪拌轉數400rpm，培養時間24h;(4)發酵培養將步驟(3)得到的種子液輸入發酵罐，發酵參數的設置同步驟(3)，培養時間28h;(5)噴粉將步驟(4)發酵得到的菌液輸入貯存罐，按菌液碳酸鈣=1:4的比例加入碳酸鈣，攪拌混勻；然後進入噴霧塔，進口溫度為18(TC，出口溫度為5(TC,得到孢子粉。以上所用培養基見技術方案。經檢測，孢子存活率達96%，孢子粉的保質期14個月。實施例4在製備生物菌肥中的應用將實施例2所得孢子粉與腐熟好的有機質混合攪拌，經70°C-18(TC高溫烘乾，製造出含水率不超過8%的有機生物顆粒。冷卻至常溫，篩分，得到不同大小的粒子，選取符合標準的粒子打包入庫，製得生物有機菌肥。實施例5在製備生態配方肥中的應用根據土壤中的N、P、K含量和不同農作物N、P、K需求量，在實施例4製得的生物有機菌肥中加入不同含量的N、P、K無機養分，混合均勻，製成有機質、無機養分和微生物三者有機結合的生態配方肥。實施例6線蟲抑制劑的製備取實施例3所得孢子粉，向其中加入5%-20%的澱粉、3%-5%的蝦殼粉或蟹殼粉，製得線蟲抑制劑。以上比例均為重量百分比。權利要求1、一株土壤芽孢桿菌(Bacillusedaphicus)CGMCCNo.2315，其特徵在於該菌株具備改善土質、分泌植物生長激素、防治病蟲害等多種功能。2、一種生產如權利要求l所述的土壤芽孢桿菌孢子粉的方法，包括如下(1)種子活化挑取冷凍保藏的菌液，在固體培養基平板上劃線，於30'C培養14-16h;然後挑取單菌落接種於液體培養基中，於30'C、250rpm振蕩培養至OD600nm-l-1.5;(2)芽孢生成取步驟(1)所得菌液0.2mL，接種於裝有固體培養基的克氏瓶中，塗勻，於3'C培養3-4天，直至培養基表面形成明顯的菌苔，得到芽孢種子；(3)接種種子罐用無菌水衝洗菌苔，接種於滅過菌的種子罐，接種溫度70-80°C,發酵參數設置為溫度30-35°C，罐壓0.03-0.05MPa,通氣量1:0.2-0.3，pH6.8-7.2，攪拌轉數200-400rpm，培養時間20-24h;(4)發酵培養將步驟(3)得到的種子液輸入發酵罐，發酵參數的設置同步驟(3),培養時間28-34h;(5)噴粉將步驟(4)發酵得到的菌液輸入貯存罐，按菌液碳酸鈣=1:3-4的比例加入碳酸鈣，攪拌混勻；然後進入噴霧塔，進口溫度為180-220°C，出口溫度為50-6。C，得到孢子粉。3、根據權利要求2所述的方法，其中所用到的培養基組成是(1)活化菌種所用的培養基組成蛋白腖5~10%o葡萄糖3~8%o酵母粉0.5~2%oNaCl3~6%oKC10.5-'1.5%oMgS04.7H200.2~0.4%0pH7.0;(2)發酵培養基玉米漿1~10%豆餅粉0.5~5%澱粉0.5~5%NH2S040.01~0.3%K2HP040.01~0.1%MgS040.1%FeS040.01%pH7.0—7.2。4、根據權利要求l所述的菌種在製備生物有機肥、生態配方肥、生物農藥以及土壤改良劑等生物製劑中的應用。5、根據權利要求2所述的方法在製備生物有機肥、生態配方肥、生物農藥以及土壤改良劑等生物製劑中的應用。全文摘要本發明提供了一株土壤芽孢桿菌(Bacillusedaphicus)CGMCCNo.2315，該菌株耐鹽、耐熱、抗逆性強，能夠分泌吲哚丙酸、玉米素、赤黴素等多種植物激素，並能防治線蟲及多種真菌病害。本發明還提供了生產前述土壤芽孢桿菌孢子粉的方法，該方法有效減少了核心菌株的死亡率，使得存活率達93％以上，並將孢子粉的保質期提高到12個月以上。本發明提供的多功能菌株和其孢子粉生產方法適用於生產生物有機肥、生態配方肥、生物農藥以及土壤改良劑等生物製劑。文檔編號A01P5/00GK101525582SQ20081010149公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優先權日2008年3月7日發明者劉旭明申請人:北京易眾恆科技有限公司