基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其免疫檢測方法

2023-06-01 00:04:01 2

專利名稱：基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其免疫檢測方法
技術領域：
本發明涉及微間隙電極陣列免疫傳感器件的製備及其免疫檢測方法。
技術背景免疫分析是生物醫學分子檢測最常用的技術之一，對於病原體(致病菌、 病毒)、疾病標誌物、藥物與化學生物毒素等的快速篩査與檢測具有極其重 要的意義，是臨床診斷、醫學研究、食品與公共安全、藥毒物分析、環境監 測等領域主要的研究工具。目前較為普遍使用的免疫分析技術主要是酶聯免 疫法、螢光免疫法、金標側流免疫層析法等。這些檢測方法靈敏度不高，難 以實現早期疾病的診斷與研究，且這些方法大都需要使用精密儀器進行定量分析，不適宜現場快速檢測的需求。 發明內容本發明的目的在於克服傳統免疫分析技術靈敏度低、需精密儀器定量檢 測的不足，提出一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其免疫 檢測方法，具有高靈敏、快速、低成本的特點。本發明的技術方案之一是，所述基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫 傳感器採用微間隙陣列金電極做基片，並採用以下步驟製得1、 取常規光刻印刷法製作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電 極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒D,寬為1,—100|im，間隙"為l|iim—100^im;2、 微間隙陣列金電極的矽烷化處理，其步驟是-a. 將所述微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次lmin;b. 將該電極浸入1 M的NaOH溶液中，靜置28min —32min;c. 用超純水清洗該電極三次，每次lmin;吹乾；d.將該電極浸入含氨丙基三甲氧基矽垸5% (體積百分數)的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時一25小時；這樣可在微間隙陣列金電極間的基片上形成一氨基矽烷自組裝單層； e.用超純水清洗三次，吹乾，獲得矽垸化的微間隙陣列金電極； 3.免疫傳感器的製備步驟a. 將所述矽烷化的微間隙陣列金電極浸入質量分數為5。^的戊二醛水溶 液，室溫下靜置0.8小時一1.2小時，再用超純水清洗三次；b. 在所述電極上滴加30 pL待測物的鼠單克隆或羊多克隆抗體溶液，抗 體濃度為10(Vg/mL， 室溫下靜置反應0. 8小時一l. 2小時；這樣使得抗體 通過戊二醛交聯劑固定在微間隙陣列金電極的基片上；所述鼠單克隆或羊多 克隆抗體溶液是將所述抗體溶於0. OIM、 pH 7.4磷酸緩衝溶液而得；c. 用超純水清洗所述電極三次，吹乾，得到免疫傳感器;保存於4°C備用。 本發明的技術方案之二是，採用上述基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器檢測有鹼性磷酸酶標記的單克隆抗體的分析物方法採用以下步 驟1. 將分析物樣品或標樣溶液(該分析物樣品或標樣溶液溶是將所述分 析物樣品或標樣溶於O.OIM、 pH 7.4磷酸緩衝溶液而得)、鹼性磷酸酶標記鼠單克隆抗體溶液(該單克隆抗體與電極上固定的抗體識別不同抗原決定位 點，溶液中抗體濃度為10(Vg/mL，該溶液是將所述抗體溶於0. OIM、 pH7.4 磷酸緩衝溶液而得，)各2(VL混合後滴加在免疫傳感器上，室溫下靜置反應 0.4小時一0.6小時；這樣，樣品中分析物和鹼性磷酸酶標記單抗分別通過 免疫反應被捕獲到傳感器表面上，並形成一種單抗-分析物-酶標第二單抗的 夾心複合物；2. 將所述傳感器置於銀沉積溶液中，該銀沉積溶液為lmM抗壞血酸磷 酸酯，2raM AgNOs的0. 1M甘氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9.0;室溫下靜置反應 8min— 12min;然後從該傳感器獲取與分析物濃度相關的電導或電阻信號。上述步驟(2)中，傳感器表面上鹼性磷酸酶催化其底物抗壞血酸磷酸 酯水解產生還原劑抗壞血酸，後者將溶液中銀離子還原成銀金屬並沉積在微 間隙陣列金電極上，使微間隙陣列金電極正負電極部分導通，從而增大微間 隙陣列金電極的電導(或降低電阻)，獲得與分析物濃度相關的電導(或電 阻)信號。本發明的技術方案之三是，採用上述基於微間隙陣列電極的酶催化電導 免疫傳感器檢測無鹼性磷酸酶標記的單克隆抗體的分析物方法採用以下步 驟1.將分析物樣品或標樣溶液(該溶液是將所述分析物樣品或標樣溶於0.01M、 pH7.4磷酸緩衝溶液而得)、待測物鼠單克隆抗體溶液(抗體濃度為 10(Vg/mL，該溶液是將所述單克隆抗體溶於0.01M、 pH7.4磷酸緩衝溶液而 得)各2(VL混合後滴加在固定有待測物羊多克隆抗體的免疫傳感器上，室 溫下靜置反應0. 5小時；這樣樣品中分析物和單抗分別通過免疫反應被捕獲 到傳感器表面上，並形成一種多抗-分析物-單抗的夾心複合物；2. 在所述傳感器表面滴加2(VL鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG抗體，濃 度為1(^g/mL，溶於磷酸緩衝溶液，其中Na3P04為0. OIM， pH 7.4，於室溫 下靜置反應0. 4小時一O. 6小時；酶標二抗通過與夾心複合物中的單抗發生 反應而被捕獲到傳感器表面上；3. 將所述傳感器置於銀沉積溶液中，該銀沉積溶液為lmM抗壞血酸磷 酸酯，2mM AgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9.0，室溫下靜置反應 8min—12min;再從所述傳感器獲取與分析物濃度相關的電導或電阻信號。上述步驟(3)中，傳感器表面上鹼性磷酸酶催化其底物抗壞血酸磷酸 酯水解產生還原劑抗壞血酸，後者將溶液中銀離子還原成銀金屬並沉積在微 間隙陣列金電極上，使微間隙陣列金電極正負電極部分導通，從而增大微間 隙陣列金電極的電導(或降低電阻)，獲得與分析物濃度相關的電導(或電 阻)信號。本發明建立的基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感檢測技術，靈敏度高，可實現fg/mL蛋白分子的檢測，且無需精密儀器進行定量檢測，可 望為疾病早期與現場檢測應用提供有效的技術依據。由以上可知，本發明為一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其免疫檢測方法，它的優點有1. 微間隙陣列電極製備簡單，可大批量、低成本生產；2. 檢測步驟簡單，檢測時間在lh內，檢測所需的儀器可用萬用電錶或 自行研製的電阻量測裝置，便攜且價格低廉；3. 本免疫傳感器靈敏度高，可實現fg/mL蛋白分子的檢測，且背景幹 擾很小。


圖l是微間隙陣列電極圖樣(黑色區域為金膜，白色區域為裸露的基片)。 掩膜圖樣與此相反(黑色區域為透明區，白色區域為不透明區)。它為叉指 式雙電極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此通過微米級絕緣間隙交叉組 成陣列式金電極。正負電極的梳形齒數5至20個，寬為1^im—10C^。電極 間隙為ljum—100)am。圖2是基於微間隙陣列電極的免疫傳感器實物照片(黑色區域為金膜， 白色區域為裸露的基片，其中箭頭指向區域固定分析物抗體，金電極兩端通 過導線連接到檢測裝置)。圖3是基於微間隙陣列電極的免疫傳感器對不同濃度hlgG對應的響應 曲線(電位一電流曲線，其斜率代表響應電導)；由該圖可見，傳感器的電 導響應隨分析物hlgG濃度增大而增大，檢測下限可達lfg/mL。
具體實施方式
實施例1:基於微間隙陣列電極的免疫傳感器檢測人免疫球蛋白G(hlgG)。1.免疫傳感器的製備取常規光刻印刷法製作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電 極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極。梳形齒寬為1pm—100nm，間隙為1,—100|im;將微間隙陣列金電極用無水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)後， 將電極浸入1 M的NaOH溶液中30min;再用超純水清洗電極三次(每次lmin)， 吹乾。然後，將電極浸入含氨丙基三甲氧基矽垸5% (體積百分數)的乙醇溶 液中，室溫下靜置24小時。用超純水清洗三次後吹乾，獲得矽垸化的微間 隙陣列金電極。將矽烷化的微間隙陣列金電極浸入戊二醛水溶液(質量分數5%)，室溫 下靜置1小時；用超純水清洗三次後，在電極上滴加3(VL hlgG的羊抗人IgG 多克隆抗體溶液(抗體濃度為10(Vg/mL，溶於磷酸緩衝溶液，其中Na3P04 為0.01M， pH 7.4)，室溫下靜置反應l小時。用超純水清洗三次後吹乾備 用。2. hlgG的檢測將h工gG的標樣溶液、鼠抗hlgG單克隆抗體溶液各2CVL混合後滴加在 如上製備的免疫傳感器上，室溫下靜置反應0.5小時；在傳感器表面滴加 20pL鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG多克隆抗體溶液(酶標抗體濃度為 l(WmL，磷酸緩衝溶液，Na3P04為0.01M， pH7.4)，於室溫下靜置反應0. 5 小時。將傳感器置於銀沉積溶液(lmM抗壞血酸磷酸酯，2mMAgN03的0. 1M甘 氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9.0)中，室溫下靜置反應10min。然後，將免疫傳 感器正負極分別與電化學工作站(CHI 760C)的工作電極與對電極(參比電 極與對電極複合)連接，採用線性掃描伏安法在0 50mV電位範圍檢測，記 錄傳感器電流隨電位變化的響應曲線(如圖3所示)，並計算其斜率(即電 導值)。根據不同濃度hlgG標樣的電導值，獲得工作曲線。我們使用所研製的免疫傳感器如上法對10個hlgG血清樣品進行測定， 根據樣品的電導響應值與工作曲線，求得對應的hlgG濃度。與ELISA方法對照，所研製的免疫傳感器的結果與ELISA的測定值的相對誤差都在5.6% 以內。實施例2:基於微間隙陣列電極的免疫傳感器檢測前列腺特異性抗原(PSA)。1. 免疫傳感器的製備將微間隙陣列金電極用無水乙醇(100%)清洗三次(每次lmin)後， 將電極浸入lM的NaOH溶液中30min;再用超純水清洗電極三次(每次lmin)， 吹乾；然後，將電極浸入含氨丙基三甲氧基矽烷5% (體積百分數)的乙醇溶 液中，室溫下靜置24小時。用超純水清洗三次後吹乾，獲得矽烷化的微間 隙陣列金電極。將矽烷化的微間隙陣列金電極浸入戊二醛水溶液(質量分數5%)，室溫 下靜置1小時；用超純水清洗三次後，在電極上滴加3(VL鼠抗人PSA單克 隆抗體溶液(濃度為10(^g/mL，溶於磷酸緩衝溶液，其中Na3P04為0.01M， pH 7.4)，室溫下靜置反應l小時；用超純水清洗三次後，吹乾，備用。2. PSA的檢測:將分析物PSA標樣溶液、鹼性磷酸酶標記鼠抗人PSA單克隆抗體溶液(該 單克隆抗體與電極上固定的單克隆抗體識別不同抗原決定位點，抗體濃度為 10(Vg/mL，溶於磷酸緩衝溶液，其中Na3P04為0.01M， pH7. 4)各20pL混合 後滴加在免疫傳感器上，室溫下靜置反應0.5小時；將傳感器置於銀沉積溶 液(lmM抗壞血酸磷酸酯，2mMAgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9. 0) 中，室溫下靜置反應10min。按照實施案例1的方法測定傳感器的電導，得 到工作曲線，且傳感器的電導在lfg 10ng/mL範圍內與PSA濃度呈線性關 系。本發明使用所研製的免疫傳感器如上法對8個正常人與10個前列腺癌 病人的血清樣品進行測定，根據樣品的電導響應值與工作曲線，求得對應的PSA濃度。與ELISA方法對照，所研製的免疫傳感器的結果與ELISA的測定 值的相對誤差都在7.9%以內。微間隙陣列電極製備採用傳統的光刻印刷方法在清潔的4X6mm的基 片(石英、普通陶瓷或玻璃材料)上用鬼膠機上塗上一層光刻膠(正膠)， 轉速3000r/min， 80。C烘15min。在光刻機中將掩膜版與基片對準，紫外曝光將掩膜版上的圖形(如圖1)轉移到基片上。顯影去掉曝光部分的光刻膠， 氮氣流吹乾後，採用真空濺射在基片上依次噴塗30nm厚的Ti層和120nm厚 的Au層。然後用有機溶劑氯仿除去基片上的感光膠後，即可得到如圖l所 示的微間隙陣列金電極。其中單個金帶寬度及相鄰兩根金帶之間的寬度可根 據需要，在1 100 um之間調整。
權利要求
1.一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器，其特徵是，採用微間隙陣列金電極做基片，並採用以下步驟製得(1)取常規光刻印刷法製作的微間隙陣列金電極做基片，它為叉指式雙電極，正負電極均為兩個梳形金電極，彼此交叉組成微間隙陣列金電極，梳形齒寬為1μm-100μm，間隙為1μm-100μm；(2)微間隙陣列金電極的矽烷化處理，其步驟是a.將所述微間隙陣列金電極用無水乙醇清洗三次，每次1min；b.將該電極浸入1M的NaOH溶液中，靜置28min-32min；c.用超純水清洗該電極三次，每次1min；吹乾；d.將該電極浸入含氨丙基三甲氧基矽烷5％(體積百分數)的乙醇溶液中，室溫下靜置23小時-25小時；這樣可在微間隙陣列金電極間的基片上形成一氨基矽烷自組裝單層；e.用超純水清洗三次，吹乾，獲得矽烷化的微間隙陣列金電極；(3)免疫傳感器的製備步驟a.將所述矽烷化的微間隙陣列金電極浸入質量分數為5％的戊二醛水溶液，室溫下靜置0.8小時-1.2小時，再用超純水清洗三次；b.在所述電極上滴加30μL待測物的鼠單克隆或羊多克隆抗體溶液，室溫下靜置反應0.8小時-1.2小時；這樣使得抗體通過戊二醛交聯劑固定在微間隙陣列金電極的基片上；所述鼠單克隆或羊多克隆抗體溶液中的抗體濃度為100μg/mL，該抗體溶液是將所述抗體溶於0.01M、pH 7.4磷酸緩衝溶液而得；c.用超純水清洗所述電極三次，吹乾，得到免疫傳感器；保存於4℃備用。
2、 一種採用權利要求1所述基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳 感器檢測有鹼性磷酸酶標記的單克隆抗體的分析物方法，其特徵是，它採用以下步驟(1)將分析物樣品或標樣溶液、鹼性磷酸酶標記鼠單克隆抗體溶液各 2(VL混合後滴加在免疫傳感器上，室溫下靜置反應0.4小時一0.6小時；所述分析物樣品或標樣溶液是將該分析物樣品或標樣溶於0. OIM、 pH 7. 4磷酸 緩衝溶液而得；所述鹼性磷酸酶標記鼠單克隆抗體溶液是將所述抗體溶於 O.OIM、 pH7.4磷酸緩衝溶液而得，抗體濃度為10(Vg/mL，該單克隆抗體與電極上固定的抗體識別不同抗原決定位點；(2)將所述傳感器置於銀沉積溶液中，該銀沉積溶液為lmM抗壞血酸磷酸酯，2mM AgN03的0. 1M甘氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9. 0;室溫下靜置反應8min— 12min;然後從該傳感器獲取與分析物濃度相關的電導或電阻信號
3、 一種採用權利要求1所述基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳 感器檢測無鹼性磷酸酶標記的單克隆抗體的分析物方法，其特徵是，它採用以下步驟(1) 將分析物樣品或標樣溶液、單抗溶液各2(VL混合後滴加在固定有待測物多克隆抗體的免疫傳感器上，室溫下靜置反應0.5小時；(2) 在所述傳感器表面滴加2(VL鹼性磷酸酶標記的第二抗體溶液， 於室溫下靜置反應0. 4小時一O. 6小時；所述第二抗體溶液為鹼性磷酸酶標 記的羊抗鼠IgG抗體溶液，抗體濃度為10)ag/mL，系將所述抗體溶於0. OIM、 pH 7.4磷酸緩衝溶液而得；(3)將所述傳感器置於銀沉積溶液中，該銀沉積溶液為lmM抗壞血 酸磷酸酯，2mM Ag冊3的0. 1M甘氨酸-NaOH緩衝溶液，pH9.0，室溫下靜置 反應8min—12min;再從所述傳感器獲取與分析物濃度相關的電導或電阻信 號。
全文摘要
本發明提供了一種基於微間隙陣列電極的酶催化電導免疫傳感器及其免疫檢測方法，免疫傳感器包括微間隙陣列電極、矽烷化處理的電極基片、具有良好導電性的酶沉積物；本發明利用微間隙電極陣列免疫傳感器，通過在電極間隙基片上固定待測物的抗體，利用酶標抗體夾心進行待測蛋白的檢測，該方法靈敏度高，操作簡單，儀器便攜且價格低廉，可望為疾病早期與現場檢測應用提供快速、實用、低成本、高靈敏、高通量的免疫檢測技術。
文檔編號G01N33/535GK101271114SQ20081003132
公開日2008年9月24日 申請日期2008年5月16日 優先權日2008年5月16日
發明者俞汝勤, 霞 楚, 沈國勵, 蔣健暉, 勇 黃 申請人:湖南大學