一種穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中補料的方法

2023-06-01 04:30:51 2

專利名稱：一種穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中補料的方法
技術領域：
本發明涉及發酵過程中的補料方法，尤其是一種提高穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中
溶氧的補料方法。
背景技術：
微生物穀氨醯胺轉胺酶(蛋白質_穀氨酸_穀氨醯胺轉胺酶， MicrobialTransglutaminase，EC2. 3. 2. 13簡稱MTG)其生物學功能是直接改變蛋白質本身 以及蛋白質所附著的細胞、組織等的結構與功能性質的特性，提高蛋白質的營養價值。因 此，MTG在食品、紡織、生物製藥等領域有著廣泛的應用前景。在前期研究中，本研究室篩選 出一株新的產穀氨醯胺轉胺酶的菌株(Str印tomyces hygroscopicus CCTCC M203062)，對 其進行了發酵條件優化以及探討了 MTG由酶原到成熟酶的活化機制。研究室的前期研究結 果表明，MTG在營養菌絲的的生長階段並不分泌，而是在分化形成氣生菌絲時才開啟動和分 泌，因此提高菌體量，對於促進產酶有很重要的作用。 流加技術是能控制或改變培養基中的一種或一種以上的營養成分的濃度，這樣在 細胞生長或產物形成對底物濃度受限敏感的工藝過程中使用比較理想，還可以做到用較確 定的營養成分來代替複雜的營養源流加培養是提高菌體濃度的傳統方法。對於利用補料發 酵生產MTG，已有報導(許曉娟.吸水鏈黴菌發酵生產穀氨醯胺轉胺酶的補料研究.中國生 物工程雜誌，2009，29(5) :78-82)，通過流加碳源提高酶的產量，取得一定效果，但是該方法 存在一個問題，補加碳源導致發酵液黏度較大，溶氧水平較低，限制了菌體的生長和產酶。 本發明利用補料的方式降低發酵液黏度，未見文獻報導。

發明內容
針對穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中溶氧較低的問題，本發明所要解決的技術問題是 提供一種穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中補料的方法，提高了菌體的生物量和穀氨醯胺轉胺酶 的產量。 為解決上述問題，本發明提供的穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中補料的方法，是在菌 體生長期流加碳源和有機氮源的混合液；穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中，單獨流加碳源提高 菌體的生物量，單獨流加有機氮源避免穀氨醯胺轉胺酶將發酵液中未利用的氮源交聯，導 致發酵液粘稠，將這兩種技術結合，提高了發酵液中溶氧水平，菌體生物量和穀氨醯胺轉胺 酶的產量都相應提高。 本發明技術方案的原理如下在吸水鏈黴菌發酵過程中，穀氨醯胺轉胺酶會使發 酵液中蛋白質氮源交聯，導致發酵液黏稠，嚴重的影響了溶氧水平，對於微生物生長有很大 影響，進而影響酶的產量。本發明通過降低初始發酵培養基中的氮源濃度，減輕了因蛋白質 氮源作為反應底物被交聯而引起的發酵液粘稠現象，通過流加氮源、碳源的方法為菌體生 長和產酶提供營養。發酵前期，營養菌絲生長，MTG並不分泌，8小時後，菌體開始分泌穀氨 醯胺轉胺酶，在此期間通過流加一定碳氮比的營養液的方法，提高菌體生長期溶氧水平及底物利用效率，提高MTG產量。 所述的方法中，生產菌株可為吸水鏈黴菌(Str印tomyces hygroscopicus)、 茂原鏈黴菌(Str印toverticilluim mobaraense)，其中優選菌為吸水鏈黴菌菌種 (Str印tomyceshygroscopicus)由武漢中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為 CCTCCM203062，該菌種在(穀氨醯胺轉胺酶高產菌及其篩選方法和用該菌株發酵法生產谷 氨醯胺轉胺酶，專利號ZL 03152956.9)中公開。 所述的方法中，微生物優選培養基為斜面培養基(g/L)，麥芽汁50(10° Be)，酵 母膏5，葡萄糖5，瓊脂20，pH 7. 0 ;種子培養基(g/L)，玉米澱粉20，蛋白腖20，酵母膏5，無 水硫酸鎂2，磷酸氫二鉀2，無水磷酸二氫鉀2，pH7.0;初始發酵培養基(g/L)，葡萄糖10，蛋 白腖10g，酵母膏5g，無水硫酸鎂2g，磷酸氫二鉀3. 75g，無水磷酸二氫鉀0. 25g，碳酸鈣5g， pH8. 0。 所述的方法中，微生物培養條件為，接一鏟生長良好的斜面培養物至裝有100mL 種子培養基的500mL三角瓶中培養，搖瓶轉速為200r/min，溫度32。C，培養時間24h。以6% 的接種量接入3L全自動發酵罐(LiFlus GM BioTRON，Korea)中，裝液量為1.5L，設定通氣 量1. 25vvm，攪拌轉速700r/min，溫度控制在32。C，對發酵過程的pH不進行控制。
所述的方法中，補料用的營養液碳源為葡萄糖，有機氮源為蛋白腖，混合營養液中 葡萄糖濃度為葡萄糖800g/L，蛋白腖濃度為800-1200g/L，其中優選蛋白腖濃度為800g/L。
所述的方法中，指數流加的方法為發酵8h-16h，通過混合液控制比生長速率為 0. 15h—1 ;16h-24h，通過流加混合液控制比生長速率為0. 10h—、所述的方法中，指數流加方法方程為F = 一、) exp(//0 X、 S分別為發酵罐
中細胞、底物濃度，p為比生長速率，V為發酵液體積，F為底物流加速率，SF為補加底物的 濃度，Yx/S為細胞對底物的得率係數，X。為培養體系的初始生物量。方程中的參數細胞比生 長速率(iO需經過選擇和優化，其他參數由分批發酵獲得。需要說明的是，由於指數流加 方程是時間的指數函數，實際控制流加速率比較困難，為簡化操作，實驗中採用階梯式遞增 流加方式，每lh改變一次營養液的流加速率，基本可符合細胞生長階段對營養的需求。
所述的方法中，穀氨醯胺轉胺酶活力的測定方法為 比色法測定酶活以N- a -CBZ-GLN-GLY為作用底物，L_穀氨酸-y單羥胺酸做 標準曲線。l個單位穀氨醯胺轉胺酶酶活定義為37t:時每分鐘催化形成lymo1 L-穀氨 酸-y單羥胺酸的酶量(U/mL)。 i式劑A : 100mg的N a -CBZ-GLN-GLY溶解於2mL 0. 2moL/L的NaOH溶液中，加入 0. 2mol/L p朋.0的Tris-HC緩衝液4mL，0. lmol/L羥胺2mL，0. Olmol/L的還原型穀胱甘肽 2mL，並調節pH至6. 0。試劑B :3mol/L的HCL， 12% TCA， 5% FeCL3按1 : 1 : 1混合。 配製0-4 ii mol/mL的L-穀氨酸-y -單異羥肟酸標準溶液。取lmL試劑A與0. 4mL
不同濃度的L-穀氨酸-y -單異羥肟酸標準溶液混合，37t:水浴10分鐘。加0. 4mL試劑B
終止反應，在525nm比色，繪製出標準曲線。以0. 4mL經適當稀釋的酶液代替標準溶液，在
相同條件下保溫和比色，從標準曲線求出酶活。以IO(TC加熱10分鐘的離心後的上清液為空白。
酶活力(u/mL) = (6. 8548 X 0D525_0. 0164) X稀釋倍數 傳統意義上發酵過程中補料的目的在於，降低底物抑制作用，提高菌體對底物的 利用效率。往往採用補糖的方式降低初糖濃度過高對菌體生長的抑制作用，這種抑制作用 會導致菌體生長緩慢，延滯期較長。本發明研究發現，在穀氨醯胺轉胺酶的發酵過程中，菌 體在8小時開始分泌穀氨醯胺轉胺酶，在穀氨醯胺轉胺酶的作用下，發酵液中的氮源會被 交聯，從而導致發酵液粘度變大，溶氧水平降低，從而影響了菌體的生長以及穀氨醯胺轉胺 酶的表達。為此，本發明旨在通過流加碳源和氮源混合液的方法，一方面避免氮源被穀氨醯 胺轉胺酶交聯，影響了發酵過程中的溶氧水平；另一方面通過流加氮源的方式，實現高密度 培養。該方法的效果是顯著的，生物量提高125-140%，酶活提高了 58-63%。
具體實施例方式實施例1 :營養液中碳氮比為1 : 1. 0的補料方法。 補加營養液中葡萄糖濃度為800g/L，蛋白腖濃度為800g/L。 8h-16h，控制比生長速率為0. 15h—、 16h-24h，控制比生長速率為0. lOh—、此方法 大大改善了發酵液中的溶氧水平，溶氧在20小時降至10%，其餘時間均在10%以上，發酵 液粘度明顯降低，發酵結束時，細胞乾重48g/L，酶活達到6. 74U/mL。
實施例2 :營養液中碳氮比為1 : 1.5的補料方法。
補加營養液葡萄糖濃度為800g/L，蛋白腖濃度為1200g/L。 8h-16h，控制比生長速率為0. 15h—、 16h-24h，控制比生長速率為0. 10h—、此方法 大大改善了發酵液中的溶氧水平，溶氧在20小時降至5%，其餘時間均在5%以上，發酵液 粘度明顯降低，發酵結束時，細胞乾重45g/L，酶活達到6. 57U/mL。
對比例1 :不補加營養液的發酵過程 溶氧在12小時即降為0，直至發酵結束未有波動，細胞乾重為20g/L，發酵結束時， 酶活4. 1U/mL。 可以理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據本發明的技術方案及其發 明構思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應屬於本發明所附的權利要求的保 護範圍。
權利要求
一種穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中補料的方法，其特徵在於，在微生物發酵生產穀氨醯胺轉胺酶過程中，按照一定的比生長速率流加碳氮比為1.0-1.5的葡萄糖與蛋白腖的混合液。
2. 根據權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述微生物為吸水鏈黴菌(Str印tomyceshygroscopicus)由武漢中國典型培養物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCCM203062。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，比生長速率的控制方法為8h-16h，控制比生長速率為0. 15h—、 16h-24h，控制比生長速率為0. 10h—、
4. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述葡萄糖與蛋白腖的混合液中葡萄糖濃度為800g/L，蛋白腖濃度為800-1200g/L。
5. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述葡萄糖與蛋白腖的混合液中葡萄糖濃度為 /L，蛋白腖濃度為800g/L。
全文摘要
本發明提供了一種穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中的補料方法，特別涉及一種提高穀氨醯胺轉胺酶發酵過程中溶氧的補料方法。在吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus CCTCC M 203062)發酵8h-16h，通過流加氮比為1.0-1.5的葡萄糖(800g/L)與蛋白腖(800g/L-1200g/L)的混合液控制比生長速率為0.15h-1，16h-24h，通過流加混合液控制比生長速率為0.10h-1。此方法一方面避免氮源被穀氨醯胺轉胺酶交聯，影響了發酵過程中的溶氧水平；另一方面通過流加氮源的方式，提高了菌體的生物量。該方法的效果是顯著的，生物量提高125-140％，酶活提高了58-63％。
文檔編號C12R1/55GK101698836SQ20091022352
公開日2010年4月28日 申請日期2009年11月23日 優先權日2009年11月23日
發明者堵國成, 張東旭, 李江華, 陳堅, 陳康康 申請人:江南大學