茶尺蠖神經突觸小泡蛋白基因svp及其應用的製作方法

2023-06-01 01:27:16 1

專利名稱：茶尺蠖神經突觸小泡蛋白基因svp及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於昆蟲基因工程領域。具體的說，本發明涉及一種茶尺蠖神經突觸小泡蛋白(synaptic vesicle protein, svp)基因分離和分析；還涉及利用該基因進行評價鱗翅目害蟲(茶尺蠖)對農藥的抗藥性。
背景技術：
茶尺蠖的頻繁發生是造成茶葉減產和品質下降的原因之一，因此，茶尺 蠖是重要的茶園病蟲害防治對象。擬除蟲菊酯類農藥是目前用於防治茶尺蠖 等茶園鱗翅目害蟲的重要農藥種類之一。擬除蟲菊酯類殺蟲的作用方式是觸 殺、胃毒和燻蒸，但以觸殺為主；其殺蟲機制是擾亂昆蟲神經的正常生理。 由於擬除蟲菊酯類農藥具有高效、低毒的特點，因此茶園中應用較普遍。由 於多次、多年連續使用，近來的調查顯示，擬除蟲菊酯類農藥對茶尺蠖等鱗 翅目害蟲的防效正在逐漸下降，顯見茶尺蠖對擬除蟲菊酯類農藥產生了某些 抗藥性。如何利用現代分子生物學技術分析害蟲對農藥抗藥性機制，加快防 止害蟲產生抗藥性的新技術的開發成了人們迫切希望解決的問題。已有的研究表明，突觸是神經系統中最活躍的部位，神經信號的傳遞、 加工都是經突觸完成的。昆蟲突觸遞質釋放的過程可以描述為突觸小泡沿 細胞骨架的微絲和微管轉運或大量附著於細胞骨架上，離開細胞骨架後的小 泡，攝入神經遞質，並與突觸前膜結合錨定；在動作電位到達時引起(^2+通道 開放，從而促進小泡與前膜融合，並釋放神經遞質。突觸小泡外側表面富含蛋白，這些蛋白是多種蛋白激酶的底物，通過其分子磷酸化及脫磷酸化的可 逆過程對突觸小泡釋放神經遞質起調節作用。可見突觸小泡膜表面蛋白對昆 蟲神經傳遞有重要作用。但是利用分子生物學技術對茶尺蠖等鱗翅目茶樹重要害蟲進行抗藥性研 究目前尚未有報導。 發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種茶尺蠖神經突觸小泡蛋白基因svp及其編碼的蛋白質，該基因可用於評價和測定鱗翅目害蟲對農藥的抗藥性。為了解決上述技術問題，本發明提供了一種茶尺蠖神經突觸小泡蛋白基因svp，其具有SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。本發明還提供了上述基因svp編碼的蛋白質，其具有SEQIDNO: 2所示的胺基酸序列。本發明還提供了上述基因SVp用途用於評價和測定鱗翅目害蟲對農藥的抗藥性。作為本發明的基因SXT的用途的改進該農藥為擬除蟲菊酯類農藥。 作為本發明的基因SVp的用途的改進鱗翅目害蟲為茶尺蠖。 本發明主要針對茶尺蠖等害蟲對擬除蟲菊酯類農藥抗藥性機制不明確這 一問題，通過對茶尺蠖抗藥性相關基因篩選和克隆，以及重要抗藥性相關基 因表達的研究，明確與擬除蟲菊酯類農藥抗藥性相關的基因及其特點。為利 用該基因進行茶尺蠖等害蟲的農藥抗性機理研究提供條件，同時也為以這些 基因為作用位點的新農藥開發奠定基礎。本發明是採用了以下技術方案來實現:採用cDNA-AFLP技術分離與茶尺 蠖對擬除蟲菊酯類抗藥性有關的基因SVp;提供一種茶尺蠖SVp核心區的蛋白質序列，其具有如SEQIDNo: 2所示序列。編碼上述svp蛋白的基因，其具 有SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。本發明還提供了抗性茶尺蠖與非抗性茶尺蠖svp基因表達差異特性，證明 本發明基因svp表達對茶尺蠖正常生長有非常重要的影響，該基因是茶尺蠖等害蟲的新型殺蟲劑研製中潛在的重要的作用位點。實現本發明的具體技術步驟如下 一、茶尺蠖SVp基因分離和分析取對擬除蟲菊酯有不同抗性的茶尺蠖幼蟲各10頭，將擬除蟲菊酯稀釋 5000- 10000倍後對茶尺蠖幼蟲進行噴霧處理。0.2-6小時之內，在不抗和抗藥性群體中各選取若干頭幼蟲。將上述不抗和抗性幼蟲分別置於不同研缽中液 氮研磨，以TRIZOL (Invitrogen公司)試劑提取總RNA，並以UNIQ-IO柱式 mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公司)獲得茶尺蠖mRNA。取 1-5嗎mRNA為模板，採用M-MLV RTase cDNA synthesis kit(寶生物工程[大連] 有限公司)合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA經過異丙醇沉澱純化後，以Bspffl (上 海前塵生物科技有限公司)與BssHII (寶生物工程[大連]有限公司)組合酶切 消化。消化後的片段與事先設計的2個接頭以TaKaRaT4DNALigase (寶生物 工程[大連]有限公司)連接。以連接完成的cDNA片段為模板，以SEQIDNo: 5和SEQIDNo: 6預擴增引物進行PCR預擴增，將擴增產物適當稀釋後，以兩 組選擇性擴增引物組合SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8，以及SEQIDNo: 9和 SEQIDNo: 10，分別進行PClUi擇性擴增。擴增產物以6%變性聚丙烯醯胺凝 膠進行電泳分析，以核酸銀染試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進行銀
染方法顯帶。從凝膠上割取顯著差異的條帶，以純水浸提過夜後，取適量浸提液作為模板，以選擇性引物組合進行PCR，產物在1.5。/。瓊脂糖凝膠上電泳。以UNIQ-IO 柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進行目標片段回收， 並委託Invitrogen公司進行序列分析。經與美國生物信息資料庫 htt。:〃www.ncbi.nlm.nih.gov比對，確定了其中一個290bp的顯著差異序列是茶 尺蠖突觸小泡蛋白。再次設計並委託上海生工生物工程有公司合成引物，其 序列見SEQIDNo: ll和SEQIDNo: 12。並以MMLC—步法RT-PCR擴增試劑 盒(上海生工生物工程有限公司)進行擴增。產物直接委託Invitrogen公司進 行序列分析。獲得了1260bp的svp基因序列，見SEQIDNo: 1，經Edits叫軟體 (DNAStar公司)推演，獲得了該基因的包含420個胺基酸的蛋白序列，見SEQ ID No: 2。二、擬除蟲菊酯對不同抗性茶尺蠖內源svp基因表達影響 取對擬除蟲菊酯有不同抗性的茶尺蠖幼蟲各10頭，將農藥稀釋5000-10000 倍後進行噴霧。0.2-6小時後，在非抗群體幼蟲中選取出現明顯中毒症狀的l-2 頭，同時在抗性群體中選取l-2頭表現正常的幼蟲。並取l-2頭未噴藥幼蟲為對 照。以TRIZOL (Invitrogen公司)法提取RNA，以MMLV第一鏈cDNA合成試 劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。採用引物組合SEQIDNo: ll和SEQIDNo: 12進行PCR。結果顯示，對除蟲菊酯敏感的茶尺蠖經過殺蟲 劑處理後中毒症狀明顯，同時svp表達顯著下降；而噴施殺蟲劑後的抗藥性茶尺蠖幼蟲並不表現出中毒症狀，SVp基因表達比較強烈；未噴藥的對照SVp表達強烈。說明svp基因的正常表達與茶尺蠖的抗藥性有很強的相關性，是一個研
究害蟲抗藥性機理的重要途徑。


下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。 圖l是實施例l的擴增產物進行電泳分析後，以核酸銀染試劑盒進行銀染 方法的顯帶圖；注選擇性擴增引物組合為SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8; M為分子量 標記，l為無抗藥性茶尺蠖樣品，2為抗藥性茶尺蠖樣品；箭頭所指分別為差異目標條帶和300bp分子量標記。圖2是實施例2中，恆壓電泳結束後進行照相所得的圖；注l為噴藥處理後無抗性茶尺蠖個體，2為噴藥處理後的抗藥性茶尺蠖個體，3為未噴藥對照，M為分子量標記。
具體實施方式
實施例l取對功夫菊酯有不同抗性的3齡茶尺蠖幼蟲各10頭，將市售濃度2.5%功夫 菊酯乳劑以水稀釋10000倍後進行噴霧處理。0.5小時後，在無抗藥性幼蟲群體 中選取出現明顯中毒症狀的3頭，同時在抗性群體中選取3頭表現正常的幼蟲。 上述2類幼蟲分別置於不同研缽中液氮研磨，以TRIZOL (Invitrogen公司)提 取總RNA，並以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限 公司)處理，獲得茶尺蠖mRNA。以l嗎mRNA為模板，採用M-MLVRTase cDNA synthesis kit(寶生物工程[大連]有限公司)合成雙鏈cDNA。在合成的雙鏈 cDNA加入等體積的預冷異丙醇，冰浴0.5-12小時後，13000轉/分鐘離心10-30 分鐘。將雙鏈cDNA沉澱溶於純水中。先以BspHI (上海前塵生物科技有限公
司)酶切消化2小時(具體操作如產品說明)；酶切完成後在產物中加等體積的異丙醇，並在冰浴下沉澱30分鐘後，13000轉/分鐘離心20分鐘，收集沉澱。 在酶切產物中加入BssfflI(寶生物工程[大連]有限公司)進行消化(具體操作參 照產品使用說明)。消化後的產物於7(TC加熱15分鐘鈍化酶後，加等體積異 丙醇冰浴下沉澱過夜，13000轉/分鐘離心30分鐘收集沉澱。將消化產物與接頭 SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4混合，以T4-DNALigase(寶生物工程[大連]有限 公司)於25。C連接過夜。以連接完成的cDNA片段為模板，以SEQIDNo: 5和 SEQIDNo: 6預擴增引物對進行PCR預擴增，具體如表l第l列所示，得預擴 增產物。取稀釋20倍後的預擴增產物2 u L，以選擇性擴增引物組合SEQ ID No: 7和SEQIDNo: 8，以及SEQIDNo: 9和SEQIDNo: 10，分別進行PCR選擇 性擴增，具體如表1第2列所示。擴增產物以6%變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳 分析，以核酸銀染試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進行銀染方法顯帶， 如圖l。表lPCR預擴增PCR選擇性擴增PCR常規擴增9fC變性30 秒；56。C退火 60秒;72° C延 伸60秒；共30 個循環。94。C變性30秒；65。C退火30秒；72° C延 伸60秒；l個循環。 94。C變性30秒；65。C退火30秒，並以每 循環下降0.7。C; 72。C延伸60秒；12個循環。 94。C變性30秒;56。C退火30秒;72° C延 伸60秒；23個循環。94。C變性4分鐘； 一個循 環。 94。C變性30秒；55。C退火 30秒；72。C延伸60秒；35個 循環。 72。C延伸5分鐘。注本發明中未做特別說明的PCR或PCR擴增均指PCR常規擴增。從凝膠上割取顯著差異的條帶，以純水浸提過夜後，取2PL浸泡液作為模 板，以引物組合SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8進行PCR擴增(如表1第3列所 示)，產物電泳後以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限
公司)進行片段回收，委託Invitrogen公司進行序列分析。經與美國生物信息 資料庫http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov比對，確定了其中一個差異顯著的目標序列 為突觸小泡蛋白svp。重新設計引物SEQIDNo: ll和SEQIDNo: 12，以抗性 群體幼蟲的mRNA為模板，採用MMLV—步法RT-PCR擴增試劑盒(上海生工 生物工程有限公司)進行PCR擴增，具體操作參照試劑盒使用說明。產物經割 膠純化後，委託Invitrogen公司進行序列分析。獲得了 1260bp的茶尺蠖svp基因 核心序列，見SEQIDNo: 1。經Editseq軟體(DNAStar公司)推演，獲得了 該基因序列的胺基酸順序，該序列包含420個胺基酸殘基，見SEQIDNo: 2。 經過序列比對顯示，茶尺蠖svp核苷酸序列與寄生黃蜂、瘧蚊等svp的一致性為 70%左右，而胺基酸順序與埃及伊蛟和寄生黃蜂等相似性超過80%。 實施例2將市售2.5%功夫菊酯乳劑以水稀釋5000倍後，對具有不同菊酯農藥抗性 的茶尺蠖4齡幼蟲進行噴霧處理，2小時後，取對功夫菊酯敏感以及有抗藥性 的幼蟲各l-2頭(約0.2g)，同時取未經施藥處理4齡幼蟲l-2頭，上述樣品分 別置於研缽中液氮快速研磨，力nimlTRIZOL (Invitrogen公司)充分混勻，並 按照TRIZOL試劑說明書步驟提取總RNA。經分光光度法分析，該RNA樣品 OD260/OD280比值為1.8、濃度約750/ig/mL。以1.5nL上述RNA溶液為模板， 以MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。 以4L cDNA為模板，以SEQ ID No: ll和SEQ ID No: 12為引物組合，進行PCR。 PCR結束後以1.5n/。的瓊脂糖凝膠進行恆壓電泳，電泳結束後進行照相，如圖2。 結果顯示，對功夫菊酯敏感的茶尺蠖經過殺蟲劑處理後中毒症狀明顯，同時svp 條帶的吸光度為0.14，而抗藥性茶尺蠖幼蟲噴施殺蟲劑後並不表現出中毒症
狀，svp條帶強度為0.96，而未經噴藥處理的幼蟲svp條帶強度為0.89。說明施 藥後敏感茶尺蠖中該基因表達受到抑制，蟲體就表現出明顯不適症狀。可見svp 與抗藥茶尺蠖幼蟲的抗藥性表現密切相關。因此，我們可以得知將擬除蟲菊酯類農藥經稀釋2500-20000倍後，按照等同於實施例2的方 法處理後；svp條帶強度為>=0.5的為抗藥性茶尺蠖，且該值越大，表明抗性 越厲害；svp條帶強度0.5的為對擬除蟲菊酯類農藥敏感的茶尺蠖。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。 顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人 員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明 的保護範圍。
序列表SEQ ID No: 1ttggtgggtg cgtacgcgtg gggctcggtg gcggactcgc tgggccgcaa gcgcgtgctc 60 atcgccatct ccatcatcaa cgggctegcc ategtcgcct cttccttcac gcaaaactac 120 gagctcttca tgctcttccg attcatcaac ggcgctgcgt taggagggtc gggtccggta 180 atctggtcgt atttcgccga gttccagccg aaaaagaagc gaggcgctat gttgagcttc 240 atggcggctt tctggacgct cgggaacctg ttcgtggccg gcctcgcctg ggtcatcatt 300 ccagctgaaa toggcatcaa cacggcagga ttcgtctaca actcatggcg tatattcctg 360 ctggtgatgt cactgccgtc cttcgtggta gcggctottc tgttcctgct tcccgagtct 420 cccaagttcc tcatgtottg cggtagacac gaggatgcgt tagaagtctt caagggaatc 480 tatctcatga acacaggaaa gagcaaggag gagtatcccg tgaagcagat acttgtcgat 540 gatgtgcata tccacaacag caagcccgaa aaggtgaaga gcatcgatga ggcgcccaag 600 tcgaagacgc gtaagatgtt gagcgacatc gtggaacaca gcaagcagct gttcgtgccg 660 cccatcctca agttcactgc catctccate accatcaact ttaccttcca tatcgggtac 720 tacggcctga tgatgtggtt ccccgagatg ttcaaccgtt tcgacgagtg gtcgcgcgcc 780 aacgacaacg ctgaagctga catttgtcag gtgacgagat ac魄acgca gcaggggacg 840 cactcggcgg acgcgctgtg cgactogcac atccactccg atgtgtttca tttcatggag 900 tctctcatoa cggtcgccgc ggccatacct tccaacatct togccgtgct cggcatggac 960 cgcctoggga ggaagttctt cttggtgttc gcgacgttct ccgcgggcct gtgctcggcg 1020 gcgatgtact tcgtgtacaa caagaccaac aacctgatag tgagcgccat cttctcctcc 1080 gtcatatcct gcggaaacgc ctcgctcgac tgcctcatca cagaggtctt ccccaccaac 1140 ctacgagcga cgggtgtggc agtgtccatg gtagcagccc ggctgggagg cateatoggc 1200 aac跑魄a tagccgcact cctggatacc tactgtccag ctcccaccat catcaggaaa 1260SEQIDNo: 2Leu Val Gly Ala Tyr Ala Tip Gly Ser Val Ala Asp Ser Leu Gly 1 5 10 15Arg Lys Arg Val Leu lie Ala lie Ser lie lie Asn Gly Leu Ala 2025 30lie Val Ala Ser Ser Phe Thr Gin Asn Tyr Glu Leu Phe Met Leu 3540 45Phe Aig Phe lie Asn Gly Ala Ala Leu GlyGly Ser Gly Pro Val 5055 60lie Trp Ser Tyr Phe Ala Glu Phe Gin Pro Lys Lys Lys Arg Gly 6570 75Ala Met Leu Ser Phe Met Ala Ala Phe Trp Thr Leu Gly Asn Leu 8085 90Phe Val Ala Gly Leu Ala Trp Val lie lie Pro Ala Glu lie Gly 95100 105lie Asn Thr Ala Gly Phe Val Tyr Asn Ser Trp Arg He Phe Leu 110115 120Leu Val Met Ser Leu Pro Ser Phe Val Val Ala Ala Leu Leu Phe 125130 135Leu Leu Pro Glu Ser Pro Lys Phe Leu Met Ser Cys Gly Arg His 140145 150Glu Asp Ala Leu Glu Val Phe Lys Gly lie Tyr Leu Met Asn Thr 155160 165Gly Lys Ser Lys Glu Glu Tyr Pro Val Lys Gin lie Leu Val Asp 170175 180Asp Val His lie His Asn Ser Lys Pro Glu Lys Val Lys Ser lie 185190 195Asp Glu Ala Pro Lys Ser Lys Thr Arg Lys Met Leu Ser Asp lie 200205 210Val Glu His Ser Lys Gin Leu Phe Val Pro Pro lie Leu Lys Phe 215220 225Thr Ala lie Ser lie Thr lie Asn Phe Thr Phe His lie Gly Tyr 230235 240Tyr Gly Leu Met Met Trp Phe Pro Glu Met Phe Asn Arg Phe Asp 245250 255Glu Trp Ser Arg Ala Asn Asp Asn Ala Glu Ala Asp lie Cys Gin 260265 270Val Thr Arg Tyr Val Thr Gin Gin Gly Thr His Ser Ala Asp Ala 275280 285Leu Cys Asp Ser His He His Ser Asp Val Phe His Phe Met Glu 290295 300Ser Leu lie Thr Val Ala Ala Ala lie Pro Ser Asn lie Phe Ala 305310 315Val Leu Gly Met Asp Arg Leu Gly Arg Lys Phe Phe Leu Val Phe 320325 330Ala Thr Phe Ser Ala Gly Leu Cys Ser Ala Ala Met Tyr Phe Val 335340 345 Tyr Asn Lys Thr Asn Asn Leu lie Val Ser Ala lie Phe Ser Ser 350355 360Val lie Ser Cys Gly Asn Ala Ser Leu Asp Cys Leu lie Thr Glu 365370 375Val Phe Pro Thr Asn Leu Arg Ala Thr Gly Val Ala Val Ser Met 380385 390Val Ala Ala Arg Leu Gly Gly lie lie Gly Asn Val Val lie Ala 395400 405Ala Leu Leu Asp Thr Tyr Cys Pro Ala Pro Thr lie lie Arg Lys 410415 4205'-CTCGTAGACTGCGTACC -3' SEQIDNo: 3 (BspH據頭)3'- CATCTGACGCATGGGTAC-5'SEQIDNo: 4 (BssHII接頭)S，-GACGATGAGTCCTGAG -3' 3'- TACTCAGGACTCGCGC-5'SEQIDNo: 5 (預擴增上遊引物) SEQIDNo: 6 (預擴增下遊引物)-GTAGACTGCGTACCCATGA-3' 5 ， -GATGAGTCCTGACGCGC-3'SEQIDNo: 7 (選擇性擴增上遊引物) SEQIDNo: 8 (選擇性擴增下遊引物)-GACTGCGTACCCATGAA-3' -GATGAGTCCTGACGCGCG-3'SEQIDNo: 9 (選擇性擴增上遊引物) SEQIDNo: 10 (選擇性擴增下遊引物)隱GACTGCGTACCCATGAC-3' ，-GATGAGTCCTGACGCGCA-3 ，SEQIDNo: 11 (SVP基因上遊引物) SEQIDNo: 12 (SVP基因下遊引物)-TTGGTGGGTGCGTACGCGTG-3 ， -TTTCCTGATGATGGTGGGAG-3，
權利要求
1、一種茶尺蠖神經突觸小泡蛋白基因svp，其特徵是具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 如權利要求l所述的基因svp編碼的蛋白質，其特徵是:具有SEQIDNO: 2所示的胺基酸序列。
3、 如權利要求l所述的基因SVp的用途，其特徵是用於評價和測定鱗翅目害蟲對農藥的抗藥性。
4、 根據權利要求3所述的基因svp的用途，其特徵是所述農藥為擬除蟲菊酯類農藥。
5、 根據權利要求3所述的基因svp的用途，其特徵是所述鱗翅目害蟲為茶
全文摘要
本發明公開了一種茶尺蠖神經突觸小泡蛋白基因svp，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發明還公開了上述基因svp編碼的蛋白質，其具有SEQID NO2所示的胺基酸序列。本發明也公開了上述基因的用途用於評價和測定鱗翅目害蟲對農藥的抗藥性。
文檔編號C12N15/12GK101210246SQ20071016481
公開日2008年7月2日 申請日期2007年12月24日 優先權日2007年12月24日
發明者杜穎穎, 楊曉利, 晨 林, 梁月榮, 陸建良 申請人:浙江大學