檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片以及試劑盒的製作方法
2023-05-31 12:14:31
檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片以及試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片和試劑盒。本發明基因晶片和檢測試劑盒和檢測方法可以準確、有效的檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒，且特異性強、靈敏度高、耗時短，檢測快速，應用前景良好。
【專利說明】檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片以 及試劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片以及檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒（FMDV)引起的偶蹄動 物的一種急性，熱性，高度傳染性疫病，主要特徵是在口腔黏膜、蹄部、乳房、皮膚出現水皰， 繼而發生潰瘍的一類傳播速度極快的傳染病。該病嚴重危害畜牧業生產，影響國際貿易和 國家聲譽，受到了各國政府的普遍關注，被國際獸疫局列為法定通報的動物傳染病，我國將 其列為一類重大動物疫病之首。FMD易感動物包括牛、綿羊、山羊、胳駝和豬等 70多種家養 和野生偶蹄類動物。該病曾在全球範圍廣泛流行，給世界養殖業造成巨大的經濟損失。近 年來，我國曾發生過〇型、A型、Asial型3個血清型的FMD疫情：2005年?2007年發生多 起Asial型口蹄疫疫情；2009年武漢、上海和北京發生A型FMD疫情；2009年和2010年在 中國臺灣與香港自治區相繼發生0型FMD疫情，在2010年廣東省廣州市的白雲區發生〇型 FMD疫情，至2010年末我國大陸的9個省的18個地方發生0型FMD疫情。此外，在健康牛 群中發現有帶毒情況。我國周邊的印度、越南、阿富汗等國家FMD流行情況比較複雜，國外 毒株多次傳入我國，對我國FMD的防控造成巨大的威脅。FMD傳染性強，危害巨大，快速、準 確的診斷對FMD的防控具有重要意義。
[0003]豬繁殖與呼吸症候群（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS) 又稱豬監耳病，是由豬繁殖與呼吸症候群病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRSV)，引起豬的高度接觸性傳染病。按臨床表現的不同可分為經典豬藍耳病 和高致病性豬藍耳病。經典豬藍耳病以母豬繁殖障礙、早產、流產、死胎、木乃伊胎和仔豬呼 吸症候群為特徵；高致病性豬藍耳病以高度接觸性傳播、全身出血、肺部實變和母豬繁殖障 礙為特徵，仔豬、育肥豬和成年豬均可發病和死亡，其中仔豬發病率可達 100 %，死亡率可達 5〇%以上，母豬流產率可達3〇%以上。我國2008年新修訂的《一、二、三類動物疫病病種名 錄》將高致病性豬藍耳病列為一類動物疫病。目前，該病已廣泛流行於世界上所有養豬的國 家和地區，是危害養豬業最嚴重的疾病。 PRRSV自上世紀90年代傳入我國以來，給養豬業造 成了巨大的損失，特別是20〇6年下半年爆發的高致病性豬藍耳病 （HPRRSV)疫情，造成了巨 大的經濟損失。目前，我國pRRSV流行毒株主要為美洲型，經典株和高致病性變異株均在豬 群中廣泛存在。
[0004] 口蹄疫（FMD)和豬藍耳病（豬繁殖與呼吸症候群，PRRS)可造成巨大的經濟損失， 對·$ 3個病的防控是豬群疫病防控的重點和首要任務。對發病畜禽進行及時準確地診斷， λ量:開展動物疫病主動監測，掌握畜禽疫病的感染情況，是採取科學防控措施的前提和基 礎，也是提，動物疫病科學防控水平的必然要求；同時，通過監測，對病原學陽性動物進行 淨化，可有效降低野毒汙染，促進畜禽健康。目前針對 FM〇v和pRRSV的病原學檢測方法已 有很多報導，對每個病單獨檢測，費事、耗力，增加了檢測成本。生產中迫切需要敏感性高、 特異性強的高通量聯合檢測技術，以提高檢測效率，有效降低勞動強度，節約檢測成本。
[0005] 王小強，"用於診斷四種豬疫病病毒寡核苷酸晶片的研製"，西北大學，微生物學， 2007公開了同時檢測豬流感病毒、豬偽狂犬病毒、口蹄疫病毒、豬藍耳病毒（豬繁殖與呼吸 症候群病毒）的基因晶片，該基因晶片檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合症病毒的最低 檢測限分別是：口蹄疫病毒6個/mL，豬繁殖與呼吸綜合症病毒5 . 05X 102個/mL。
【發明內容】
[0006]為了解決上述問題，本發明提供了一種新的、靈敏度高的同時檢測口蹄疫病毒和 豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片和試劑盒。
[0007] 本發明檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片，它包括固相載體 以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID N0 :5?7所示任意一個或者任意多 個基因片段和SEQ ID N0 :8?10所示任意一個或者任意多個基因片段。
[0008] 基因晶片，是指指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、cDNA、genomic DNA、多膚、 抗體、抗原等）固著於矽片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質上形成的 生物分子點陣，其突出的特點是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0009] 其中，它還包括陽性對照探針是SEQ ID N0 :12所示的基因片段，陰性對照探針是 SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探針是標記了螢光染料的SEQ ID N0:14所示的基因 片段。
[0010] 所述螢光染料是cy3螢光染料或Cy5螢光染料。
[0011] 所述固相載體為醛基化玻片。
[0012] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0013] 所述豬繁殖與呼吸症候群病毒是美洲型豬繁殖與呼吸症候群病毒。
[0014] 所述美洲型豬繁殖與呼吸症候群病毒是美洲型高致病性豬藍耳病病毒或美洲型 豬藍耳病經典毒株。
[0015] 本發明檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於：它包 括權利要求1或2所述的基因晶片與擴增口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因的 試劑，其中，擴增口蹄疫病毒基因的試劑包括SEQ ID N0 :1?2所示引物對；擴增豬繁殖與 呼吸症候群病毒基因的試劑包括SEQ ID N0 :3?4所示引物對。
[0016] 所述引物對中，SEQ ID N0 :1、3所示上遊引物與SEQ ID N0 :2、4所示下遊引物的 摩爾比為1:10
[0017] 所述SEQ ID N0 :2、4所示下遊引物上標記有螢光染料。
[0018] 所述螢光染料是cy3螢光染料或Cy5螢光染料。
[0019] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0020] 所述豬繁殖與呼吸症候群病毒是美洲型豬藍耳病病毒。
[0021] 所述美洲型豬藍耳病病毒是美洲型高致病性豬藍耳病病毒或美洲型豬藍耳病經 典毒株。
[0022] 本發明提供了 SEQ ID N0 :5?7所示任意一個或者任意多個基因片段，與SEQ ID NO :8?10所示任意一個或者任意多個基因片段在製備檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜 合徵病毒的基因晶片中的用途。
[0023] 所述基因晶片還包括陽性對照探針是SEQ ID N0 :12所示的基因片段，陰性對照探 針是SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探針是標記了螢光染料的SEQ ID N0:14所示的 基因片段。
[0024] 本發明還提供了 SEQ ID N0 :1?2和SEQ ID N0 :3?4所示引物對在製備同時擴 增口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒基因的試劑中的用途。
[0025] 本發明提供了 SEQ ID N0 :1?2和SEQ ID N0 :3?4所示引物對，與SEQ ID N0 : 5?7所示任意一個或者任意多個基因片段、SEQ ID NO :8?10所示任意一個或者任意多 個基因片段在製備檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒中的用途；其中，2 對引物對為擴增試劑，SEQ ID N0 :5?10所示基因片段為檢測探針。
[0026] 所述引物對中，SEQ ID N0 :1、3所示上遊引物與SEQ ID N0 :2、4所示下遊引物的 摩爾比為1:10。
[0027] 所述SEQ ID N0 :2、4所示下遊引物標記有螢光染料。
[0028]所述螢光染料是cy3螢光染料或Cy5螢光染料。
[0029] 所述口蹄疫病毒是A型、0型或Asial型口蹄疫病毒。
[0030] 所述豬繁殖與呼吸症候群病毒是美洲型豬藍耳病病毒。
[0031]所述美洲型豬藍耳病病毒是美洲型高致病性豬藍耳病病毒或美洲型豬藍耳病經 典毒株。
[0032] 本發明基因晶片和試劑盒可以有效檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒， 特異性強，靈敏度高，兩種病毒最低檢出濃度的數量級為102C〇PieS/μ L，耗時短，檢測快 速，可以迅速掌握畜禽疫病的感染情況，有效防控口蹄疫（FMD)和豬藍耳病的發生，臨床應 用前景良好。
[0033] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實施例。凡基於本發明權利要 求書記載的內容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0034]圖1寡聚核苷酸晶片探針點樣示意圖；
[0035]圖2定位探針和陰陽性對照探針濃度篩選晶片點樣示意圖；
[0036] 圖3 FMDV檢測探針濃度篩選晶片點樣分布圖；
[0037]圖4 Ml:分子量Marker DL1000 ;Μ2:分子量Marker DL2000 ; 1-3 :A、〇、Asial FMDV RNA擴增產物；4 :PMD20-T對照；5 :PMD3D擴增產物；
[0038]圖5克隆基因片段的測序結果；
[0039] 圖6 RT-PCR擴增產物電泳結果。M :100bp的分子量Marker ;1、2 :CH1_R株和 JXA1-R株RNA擴增結果；3 :陰性對照；4、5 :質粒PMDP和PMDHP擴增結果；6:pMD_20T載體 對照；
[0040]圖7克隆基因片段序列；
[0041]圖8陽性對照標記物靶基因（PC2)和探針（PC1)的結果；
[0042]圖9陽性對照標記物（PC2)濃度和探針（PC1)濃度對雜交信號的影響；
[0043]圖1〇單重和多重RT-PCR擴增產物電泳結果。Μ : lOObp的分子量Marker ; 1，3, 5, 7, 9:單重 RT-PCR 擴增結果；2, 4, 6, 8, 10 :多重 RT-PCR 擴增結果；1、2 :FMDV ;7、 8:CH1-R ;9、10:JXA1-R ;
[0044]圖11多重不對稱RT-PCR標記產物雜交結果。1 :FMDV ;2:CH1-R ;3 JXA1-R ; [0045]圖12 FMDV 3D片段標記物與檢測探針在不同溫度下的雜交結果；
[0046]圖13豬藍耳病經典株（CH1_R)標記物在不同溫度下的雜交結果；
[0047]圖14高致病性豬藍耳病變異株（JXA1-R)標記物在不同溫度下的雜交結果； [0048]圖15特異性檢測結果；
[0049]圖16不同稀釋度質粒PMD3D(FMdv)的基因晶片檢測結果。1#?10#: 10X稀釋的 質粒 PMD3D,濃度分別為 8· 34X109 ?8. 34X10°copies/u L ;
[0050]圖17不同稀釋度質粒PMDP(PRRSV)的基因晶片檢測結果。1#?10#: 10X稀釋的 質粒 PMDP,濃度分別為 3· 76X 109 ?3. 76X10〇copies/y L ;
[0051]圖18不同稀釋度質粒pMDhp(HPRRSV)的基因晶片檢測結果。1#?10#:10X稀釋 的質粒 PMDHP,濃度分別為 3. 65X109 ?3. 65X10〇copies/y L。
【具體實施方式】
[0052] 一、實驗材料和儀器
[0053] 材料準備
[0054] 1. 1 毒株
[0055] A型、0型、Asial型FMDV標準抗原：中國農業科學院蘭州獸醫研究所生產的口蹄 疫抗體液相阻斷ELISA試劑盒；美洲型高致病性豬藍耳病病毒（HPRRSV，JXA1-R株）、美洲 型豬藍耳病經典毒株（PRRSV，CH1-R株）、豬偽狂犬病毒（PRV):來自商品弱毒疫苗；豬圓 環病毒（PCV-2)、豬細小病毒（PPV)、豬乙型腦炎病毒（JEV)、牛病毒性腹瀉/黏膜病病毒 (BVDV) :四川農業大學保存；20份臨床不穩定豬群組織樣品，四川省動物疫病預防控制中 心保存。
[0056] 1. 2主要試劑
[0057] RT-PCR-步法擴增試劑盒PrimeScript one st印 RT-PCR kit、載體pMD-20T購自 TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，質粒提取試劑盒TIAN pure Midi Plasmid Kit， 感受態細胞DH5a購自天根公司；RNA、DNA柱式提取試劑盒購自北京世紀元亨。
[0058] Baio@醛基載玻片、Baio@2X點樣緩衝液、Baio@雜交緩衝液，均購自上海百傲 科技有限公司；洗滌液1(2\55(：，0.1%508)、洗滌液11(0.2\55(：，0.1%305)、洗滌液 III (0. 2XSSC)、0. 5% NaBH40. lmol/L 磷酸鹽緩衝液等。
[0059] 1. 3主要儀器
[0060] 基因晶片點樣儀（Microgrid II Compact, BioRobotics，UK);基因晶片掃描儀 (GenePix Personal 4100A，Axon Instruments Inc.，USA);紫外交聯儀（CL-508,Uvitec， UK);高速冷凍離心機（Sigma，Germany);普通梯度PCR儀（BI0-RAD，USA);震蕩培養箱 (THZ-92C，上海博訊實業有限公司）；核酸蛋白質檢測儀（Ependorf Biophotometer，德 國）；隔水式恆溫培養箱（上海齊欣科學儀器有限公司）。
[0061] 實施例1本發明檢測方法
[0062] 1、材料和儀器
[0063]同前述實驗材料和儀器。
[0064] 2、實驗方法
[0065] 2· 1 PCR引物、檢測探針的設計與合成
[0066] 登錄GenBank獲取FMDV、PRRSV主要基因型（血清型）代表毒株的基因序列，利 用DNAStar軟體的MegAlign模塊分別進行同源性分析，選取保守基因作為檢測靶區，根據 經驗，用01ig〇7. 0軟體設計擴增引物和寡核苷酸探針。在標記樣品時，下遊引物選用5-端 Cy3修飾的引物；寡核苷酸探針5'端添加 Poly T15連接臂並氨基化。引物序列見表1，寡 核苷酸探針見表2,經Blast比對後送上海生工合成。
[0067] 表1:引物序列和位置
[0068]
【權利要求】
1. 一種檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因晶片，其特徵在於：它包括 固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO :5?7所示任意一個或 者任意多個基因片段以及SEQ ID NO :8?10所示任意一個或者任意多個基因片段。
2. 根據權利要求1所述的基因晶片，其特徵在於：它還包括陽性對照探針、陰性對照探 針和/或定位探針，其中，陽性對照探針是SEQ ID NO: 12所示的基因片段，陰性對照探針是 SEQ ID N0:11所示的基因片段，定位探針是標記了螢光染料的SEQ ID N0:14所示的基因 片段。
3. -種檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於：它包括權 利要求1或2所述的基因晶片與擴增口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基因的試 齊U，其中，擴增口蹄疫病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :1?2所示引物對；擴增豬繁殖與呼 吸症候群病毒基因的試劑包括SEQ ID NO :3?4所示引物對。
4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於：所述引物對中，SEQ ID NO :1、3所示上 遊引物與SEQ ID NO :2、4所示下遊引物的摩爾比為1:10。
5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於：所述SEQ ID NO :2、4所示下遊引物標 記有螢光染料。 6. SEQ ID NO :5?7所示任意一個或者任意多個基因片段，與SEQ ID NO :8?10所示 任意一個或者任意多個基因片段在製備檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的基 因晶片中的用途。
7. 根據權利要求6所述的用途，其特徵在於：所述基因晶片還包括陽性對照探針、陰性 對照探針和/或定位探針，其中，陽性對照探針是SEQ ID NO :12所示的基因片段，陰性對照 探針是SEQ ID NO :11所示的基因片段，定位探針是標記了螢光染料的SEQ ID NO :14所示 的基因片段。 8. SEQ ID NO :1?2和SEQ ID NO :3?4所示引物對在製備同時擴增口蹄疫病毒和豬 繁殖與呼吸症候群病毒基因的試劑中的用途。 9. SEQ ID NO :1?2和SEQ ID NO :3?4所示引物對，與SEQ ID NO :5?7所示任意 一個或者任意多個基因片段以及SEQ ID NO :8?10所示任意一個或者任意多個基因片段 在製備檢測口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒中的用途；其中，兩對引物對 為擴增試劑，SEQ ID NO :5?10所示基因片段為檢測探針。
10. 根據權利要求9所述的用途，其特徵在於：所述引物對中，SEQ ID NO :1、3所示上 遊引物與SEQ ID NO :2、4所示下遊引物的摩爾比為1:10。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232790SQ201410455893
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月9日 優先權日:2014年9月9日
【發明者】文心田, 李金海, 李興玉, 黃小波, 曹三傑, 文翼平, 伍銳 申請人:四川農業大學