乳中游離多肽的測定方法與流程

2023-05-31 14:54:51 1

本發明涉及一種乳品分析方法。更具體地說，本發明涉及一種乳中游離多肽的測定方法。

背景技術：

眾所周知，乳中含有豐富的蛋白質，是蛋白質的優質來源之一。可是，對乳中同樣由胺基酸組成的多肽關注較少。對生物學樣本中多肽的研究稱之為多肽組學。在醫學領域，血清中多肽組學的研究對於疾病的診斷具有重要的意義，現在已有技術利用血清中特有肽段的種類及含量進行腫瘤的診斷。另外，有研究顯示人體呼吸系統、心血管系統及神經系統中游離肽段具有重要的生物學功能。

可是，目前對於乳中多肽組學的研究相對較少。因為乳是一種獨特的生物學體系，其中脂肪、蛋白及鹽類的組成與人體血清組織有所不同，進而適用於其他人體組織中的多肽組學技術並不完全適用於乳品研究。因此，根據乳品體系的特點，開發適用於乳中多肽的方便、準確及深入的組學方法對深入挖掘乳品多肽的功能性質，開展乳中生物學標記物研究具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的一個目的是解決至少上述問題，並提供至少後面將說明的優點。

本發明還有一個目的是提供一種乳中游離多肽的測定方法，其樣品乳的前處理操作簡單，所述超濾步驟徹底除去影響質譜測定的蛋白質，質譜測定鑑定出的乳中多肽數量大，範圍廣，來源廣泛。

為了實現根據本發明的這些目的和其它優點，提供了一種乳中游離多肽的測定方法，其包括以下步驟：將樣品乳進行脫脂和蛋白質脫除處理之後，取上清液；將上清液選用截留分子量為5-30KDa的濾管離心，於4℃，6000g條件下離心10-20min，得濾過液；對所述濾過液進行脫鹽處理製得多肽樣品，將所述多肽樣品進行質譜測定。

優選的是，所述脫脂具體包括：將樣品乳在4℃條件下，於7000-9000rmp轉速下離心10-20min脫除乳中脂肪。

優選的是，所述蛋白質脫除具體包括以下步驟：

(1)乙醇沉澱蛋白質：將經過脫脂的樣品乳置於冰盒中,在低溫條件下加入純乙醇抽提,邊加邊攪拌,使乙醇終濃度為60％(V/V),攪拌25-35min後,12000g離心8-10min,取上層清亮液體；

(2)乙醇脫除：將所述上層清亮液體進行真空濃縮至接近乾燥；然後加水至1ml，於4℃，8000rpm條件下離心5min,去沉澱,留取上清液。

優選的是，所述脫鹽處理具體為：利用SPE C18柱對所述濾過液進行脫鹽處理。

優選的是，所述質譜測定具體包括：多肽樣品利用Ultimate 3000-液相-Q-Exactive HF二級質譜進行測定；質譜條件為：流動相為5-35％乙腈，流速為600nl/min.荷質比為300-1400的離子被Orbitrap收集。

優選的是，所述多肽樣品選用360um*2cm的c18搜集柱及150um*12cm的分離柱進行分離。

本發明至少包括以下有益效果：本發明所述乳中游離多肽的測定方法，其將樣品乳中的脂肪和蛋白質進行脫除後，利用製得的上清液進行游離多肽的測定，所述濾過液在進行質譜測定時，幾乎沒有雜質的影響，測定出的多肽種類大大增加。選用上清液作為測定對象，在脫除脂肪和蛋白質後，進一步通過截留分子量為5-30KDa的濾管離心，可以徹底除去上清液中殘留的影響質譜測定的蛋白質。提高質譜測定的精確度。本發明所述乳中游離多肽的測定方法，前處理步驟簡單，容易操作，通過質譜測定出的游離多肽種類多，測定結果精確，為乳品鑑定以及乳源體質鑑定提供可靠的理論依據。

本發明的其它優點、目標和特徵將部分通過下面的說明體現，部分還將通過對本發明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。

附圖說明

圖1為本發明所述乳中游離多肽的測定方法各實施例中游離肽段長度分布圖；

圖2為本發明所述乳中游離多肽的測定方法各實施例中肽段來源蛋白質分布圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

應當理解，本文所使用的諸如「具有」、「包含」以及「包括」術語並不排除一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。

本發明提供一種乳中游離多肽的測定方法，包括以下步驟：

(1)離心脫脂：將樣品乳在4℃條件下，於7000-9000rmp轉速下離心10-20min脫除乳中脂肪。

(2)乙醇沉澱蛋白質：將脫脂乳置於冰盒中,在低溫條件下加入純乙醇抽提,邊加邊攪拌,使乙醇終濃度為60％(V/V),酪蛋白、乳清蛋白等蛋白組分不斷析出,攪拌25-35min後,12000g離心8-10min,取上層清亮液體。

(3)乙醇脫除：將所述上層清亮液體進行真空濃縮至接近乾燥。加水至1ml，於4℃，8000rpm條件下離心5min,去沉澱,留取上清液。

(4)超濾去除未完全沉澱蛋白質：選用截留分子量為5-30KDa的濾管，對所述上清液進行離心，於4℃，6000g條件下離心10-20min。取濾過液。

(5)脫鹽：利用SPE C18柱對所述濾過液進行脫鹽處理，製得多肽樣品。

(6)質譜測定：

多肽樣品經Ultimate 3000-液相-Q-Exactive HF二級質譜測定。多肽樣品在360um*2cm的c18搜集柱及自製的150um*12cm的分離柱上進行分離，流動相為5-35％乙腈，流速為600nl/min.荷質比為300-1400的離子被Orbitrap收集。響應值最高的30個離子利用HCD進行碎片斷裂。

實施例1

本發明所述乳中游離多肽的測定方法，包括以下步驟：

(1)離心脫脂：取母乳100g，在4℃條件下，於8000rmp轉速下離心15min脫除乳中脂肪。

(2)乙醇沉澱蛋白質：將脫脂乳置於冰盒中,在低溫條件下加入純乙醇抽提,邊加邊攪拌,使乙醇終濃度為60％(V/V),酪蛋白、乳清蛋白等蛋白組分不斷析出,攪拌30min後,12000g離心10min,取上層清亮液體。本發明所述乳中游離多肽的測定方法中，棄去蛋白質，僅僅選用上層清亮液體作為測定游離多肽的樣品，相對減少了樣品處理步驟，同時，其通過質譜測定出的游離多肽的種類大大增加，對於乳品的鑑定提供更多的參考依據。

(3)乙醇脫除：將2中所獲液體進行真空濃縮至接近乾燥。加水至1ml，於4℃，8000rpm條件下離心5min,去沉澱,留取上清液。

(4)超濾去除未完全沉澱蛋白質：選用截留分子量為10KDa的濾管離心，於4℃，6000g條件下離心15min。取濾過液。通過超濾完全去除上清液中蛋白質，進一步減少殘留蛋白質對質譜測定的影響，提高乳中游離多肽鑑定的準確性，對乳品質量以及通過乳品多肽的種類判斷乳源的體質狀況提供更加準確的依據。

(5)脫鹽：利用SPE C18柱對4步中濾過液進行脫鹽處理，製得多肽樣品。

(6)質譜測定：多肽樣品經Ultimate 3000-液相-Q-Exactive HF二級質譜測定。多肽樣品在360um*2cm的c18搜集柱及自製的150um*12cm的分離柱上進行分離，流動相為5-35％乙腈，流速為600nl/min.荷質比為300-1400的離子被Orbitrap收集。響應值最高的30個離子利用HCD進行碎片斷裂。在母乳中鑑定出187種游離肽段；母乳中肽段長度主要為18個胺基酸組成的肽段。

實施例2

本發明所述乳中游離多肽的測定方法，包括以下步驟：

選用牛乳100g，牛全脂乳粉100g，牛脫脂乳粉I100g以及牛脫脂乳粉I I100g，分別進行離心脫脂。選用截留分子量為30KDa的濾管離心，於4℃，6000g條件下離心15min。取濾過液。其他步驟同實施例1，最終測定出牛乳中473種游離肽段，牛全脂乳粉中110種游離肽段，牛脫脂乳粉I中223種游離肽段，牛脫脂乳粉I I中107種游離肽段；牛乳中主要為15個胺基酸組成的肽段。測定結果見圖1和圖2。

實施例3

本發明所述乳中游離多肽的測定方法，包括以下步驟：

選用取羊乳100g，羊全脂乳粉100g，分別在4℃條件下，於8000rmp轉速下離心15min脫除乳中脂肪。選用截留分子量為5KDa的濾管離心，於4℃，6000g條件下離心15min。取濾過液。其他步驟同實施例1，最終測定羊乳中共有207種游離肽段，羊全脂乳粉中測定出54種游離肽段。羊乳中為15個胺基酸組成肽段。測定結果見圖1和圖2。

如圖1和圖2所示，母乳肽段來源於165種蛋白質，但多數不屬於母乳蛋白；牛乳游離肽段來源於58種蛋白質，均來源於牛乳蛋白；羊乳游離肽段來源於25種蛋白質，均來源於羊乳。採用本發明所述前處理方法結合質譜技術，鑑定出乳中多肽的數量大，範圍廣，來源廣泛。本方法操作簡單，超濾步驟徹底除去影響質譜測定的蛋白質。

儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的圖例。