抗巖沙海葵毒素單克隆抗體及其試劑盒、產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞系以及它們的用途的製作方法
2023-05-31 23:10:06
專利名稱：抗巖沙海葵毒素單克隆抗體及其試劑盒、產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞系以及它們的用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫學和免疫學領域，特別涉及一種特異性的單克隆抗體 以及產生該抗體的雜交瘤細胞系，以及含有該單克隆抗體的試劑盒及它們在
衝企測PTX中的用途。
背景技術：
巖沙海葵毒素(Palytoxin, PTX)是從腔腸動物皮沙海葵科沙群海葵屬毒 沙群海葵Palythoatoxica中分離得來的一種非蛋白毒素，其是由129個碳原子組 成的聚醚化合物，分子量為2677，含有40個羥基和8個曱基。有極強的神經系 統、心血管系統或細胞系統活性，皮摩爾級濃度的分子即可損傷細胞，而且 PTX的作用速度極快，動物從中毒到死亡的時間僅3 5分鐘，是迄今為止在非 蛋白毒素中毒性最強的化合物之一。
巖沙海葵是一種海洋腔腸動物類，它生長在海濱巖石上或半截身子埋在 海沙裡或吸附在曱殼類生物的殼上，人類多由誤食或不慎接觸其觸手而中毒。 巖沙海葵毒素屬於聚醚類水溶性神經毒素，作用於Na+-K+-ATP酶，阻斷鈉離 子通道；它是最強烈的血管收縮劑，對冠狀動脈的收縮強度比血管緊張素強 IOO倍。中毒症狀主要表現為呼吸困難、呼吸衰竭、驚厥、痙攣、運動失調、 嗜睡、四肢無力、虛脫、嘔吐、消化道廣泛出血、休克、死亡等。由於人類 愈來愈熱衷於海鮮產品，使得誤食這種毒素造成食物中毒的可能性越來越大， 但是目前對該類毒素中毒尚無特效治療藥物，因此，建立起一種靈敏性高、 特異性強的檢測方法用於鑑別高致中毒性海葵種群以及測定供人類食用的海 產品裡PTX的分布含量，以減輕或避免PTX中毒事件的發生實為必要。國內外對PTX的研究主要都是圍繞PTX對Na-K泵或Ca泵的毒理影響方 面。由於PTX分子量小，不能直接免疫小鼠，甚至是不能直接與載體蛋白連接， 其研究難度較大，研究進程比較緩慢。1988年Levine L等通過使用1125的放射 免疫測定法(RIA)來4全測PTX ( Levine L, Fujiki H， Gjika HB, Van Vunakis H. A radioimmunoassay for palytoxin. Toxicon. 1988; 26(12): 1115-21 ) ， 1992年 Bignami GS等製備出PTX的單克隆抗體，並發展到5種有關PTX免疫檢測方法 的報導，包括'間接竟爭抑制法(CIEIA)、兩種直接竟爭抑制法以及直接和 間才矣夾心法(Bignami GS ， Raybould TJ等.Monoclonal antibody-based enzyme-linked immunoassays for the measurement of palytoxin in biological samples. Toxicon. 1992 Jul; 30(7): 687-700 )。通過比較發現，ELISA的敏感度 是RIA的3倍，檢測範圍在6-250 ng/ml之間(Frolova GM, Kuznetsova TA, Mikhalov VV， Eliakov GB, Immunoenzyme method for detecting microbial producers of palytoxin. Bioorg Khim. 2000 Apr; 26(4): 315-20),但是該ELISA 實驗是採用鹼性磷酸酶(AP)作為標記，而且過程過於繁瑣，對實驗的環境要求 較高。在我國，最相關的報導只涉及焦紅、劉必勇等人製備出PTX多克隆抗體 (焦紅，劉必勇,郭素珍,席靜,林峰,王家驥.海洋生物巖沙海葵毒素血清免疫抗 體的製備.檢驗檢疫科學.2005(2))以及對巖沙海葵毒素直接酶聯免疫吸附檢 測方法的研究(焦紅，劉必勇，王家驥，林峰.巖沙海葵毒素直接酶聯免疫吸 附檢測方法的研究)，未見其他更詳盡的報導。
發明內容
本發明提供一種抗巖沙海葵毒素(PTX)的單克隆抗體及其試劑盒、產生 該單克隆抗體的雜交瘤細胞系以及它們的用途。
本發明的目的之一是"t是供一種抗巖沙海葵毒素(PTX)單克隆抗體的雜 交瘤細胞系，其保藏在武漢大學的中國典型培養物保藏中心(CCTCC),保
4藏號為CCTCC No. C200922,保藏日為2009-5-19,命名為抗巖沙海葵 毒素單克隆抗體雜交瘤細胞株。
本發明的第二個目的是提供所述抗巖沙海葵毒素單克隆抗體的雜交瘤細 胞系分泌的單克隆抗體。
本發明的第三個目的是提供一種能準確方便的檢測巖沙海葵毒素的試劑 盒，所述試劑盒含有所述抗巖沙海葵毒素的單克隆抗體。
本發明的第四個目的是提供所述單克隆抗體、含有該單克隆抗體的試劑 盒、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞系在檢測PTX中的應用。
本發明建立了一種快速、準確、重複性好、特異性強、靈敏度高的檢測 的方法，用於鑑別高致中毒性海葵種群以及測定供人類使用的海產品裡PTX 的含量分布，可以有效地減輕或避免PTX中毒事件的發生。
下面將詳細介紹本發明的抗巖沙海葵毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞系、 單克隆抗體及其試劑盒和用途。
本發明提供的雜交瘤細胞系，其保藏在武漢大學的中國典型培養物保藏 中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCNo.C200922，保藏日為2009-5-19， 命名為抗巖沙海葵毒素單克隆抗體雜交瘤細胞抹，本發明的抗巖沙海葵毒 素單克隆抗體雜交瘤細胞抹，為半懸浮細胞，在安靜情況下生長時能輕輕貼 壁於培養瓶上，經吹打能脫落下來，形成細胞懸液。該細胞呈圓形，在光學
顯微鏡下發亮而透明。
圖l為本發明的雜交瘤細胞林在光學顯微鏡下的圖片。如圖所示，在光學 顯微鏡下觀察可以雜交瘤細胞成群生長，與圖中箭頭所指的死細月包所呈現出 的棕色或黑色及其不透明性，有明顯的不同。
具體實施方式
本發明先將PTX與異型雙功能試劑SPDP反應，然後再偶聯載體蛋白KLH 製備完全抗原，免疫Balb/c小鼠，並製備PTX-PDP-BSA偶聯物作為檢測抗原。 取小鼠脾細胞與NS-1細胞融合，間接ELISA篩選分泌PTX單克隆抗體的雜交瘤 細胞株並製備腹水型單克隆抗體。利用該單克隆抗體初步建立並比較檢測PTX 的直接和間接竟爭酶免疫學^f企測方法。
實施例一、雜交瘤細胞系的製備
1. PTX與栽體蛋白的偶聯
在PH7.5， 0.1M PBS:DMSO19:l的混合液中加入20pg PTX和12iig的 SPDP, 4。C冰箱過夜。混合物加入等量CH2CL2萃取3次，取水層部分過5ml SephadexG-25預裝柱，用含0.1MNaCl的PH7.0， O.IMPBS洗脫，收集最大吸 收波長在263nm下的洗脫液。
在0.025M, pH9.0硼酸鹽緩沖液中加入45 pg KLH蛋白和50倍摩爾濃度 (2隱iminothiolate: KLH)的2-亞氨基硫醇鹽(2-iminothiolate) ， 4。C冰箱過夜。 混合物過截留分子量為30K的超濾管，取上層管液體，在分光光度計下檢測 KLH-SH最大吸收波長278nm下的洗脫液，並凍幹。BSA-SH的製備跟KLH-SH 相同，收集在279nm下的洗脫液，並凍千。
免疫抗原將PTX-PDP、 BSA-SH和KLH-SH均溶解於PH7.5, 0.1MPBS 中，體積分別為lml、 0.5ml、 0.5ml。然後BSA-SH和KLH-SH都分別加入到等 體積的PTX-PDP溶液中，4。C過夜。然後再過5mlSephadexG-25預裝柱，用含 O.lMNaCl的PH7.0, O.IMPBS洗脫，收集分光光度計4全測下收集最大吸收波 長為267nm的PTX-PDP-KLH和最大吸收波長為273歸的PTX-PDP-BSA。
2. 動物免疫以及免疫後血清的檢測
將100ng、 150ng、 200ng、 300ng PTX-PDP-KLH分別溶於0.2ml生理鹽水， 並用等體積的弗氏完全佐劑充分混合；選用雌性6 8周齡BALB/C小鼠作為免 疫動物多點免疫；2周後取同樣體積抗原與弗氏不完全佐劑混合，免疫方法同上；免疫3周後開始檢測小鼠血清中抗體效價以PTX-PDP-BSA為包被抗原， 採用間接ELISA法檢測；免疫6次後直接取PTX-PDP-KLH 0.2ml腹腔注射加強免疫。
3.細胞融合以及融合後篩選 3.1飼養細胞的培養
處死2 3隻8 12周齡的健康BALB/C小鼠，消毒；無菌條件下在小鼠腹腔 注入3ml4。C的基礎培養液衝洗腹腔，收集各小鼠腹腔衝洗液，連續操作3次； 1000rpm離心10min,棄上清；用HAT培養液稀釋離心沉澱細胞，進行細胞計 數，調整細胞密度為2xl05個/ml，經細胞懸液加入到96孔培養板中，每孑U).lml， 放置到37。C、 5。/。C02的培養箱內培養。 3.2免疫脾細胞懸液的製備
① 取已經免疫的、效價高的BALB/C小鼠，摘除眼^求放血，並分離血清 供抗體檢測用，同時將小鼠處死，浸泡於75 。/。酒精中5min,隨即方欠入超淨臺 內。無菌手術打開腹部，取出脾臟，放入己盛有8ml不完全培養基的平皿中 輕輕洗一次，並細心剝去周圍結締組織。
② 將脾臟移入另一盛有5ml不完全培養基的平亞內，置於鋼絲網上。用 注射器內芯擠壓研磨脾臟，並用平皿內的不完全培養基輕輕沖洗鋼絲網，使 脾細胞全部通過鋼絲網孔擠壓到溶液中。
③ 將脾細胞溶液轉至50ml離心管中，加不完全培養基至30ml，混勻。
1000 rpm離心5 min,棄去上清。
⑤ 沉澱細胞再用不完全培養基同法離心洗滌一次，然後將細胞重懸至 10ml,混勻。
⑥ 取脾細胞懸液，加臺盼藍染液作活細胞計數後備用。 3,3 NS-1骨髓瘤細胞懸液的製備① 在融合前2 3天將NS-l骨髓瘤細胞擴大培養於75ml細胞培養瓶中， 每瓶加12 15ml培養液，置37。C， 5 %C02的培養箱內培養。
② 融合時，收集細胞於50ml離心管中。
③ 1000rpm離心5min ,棄上清。
④ 沉澱細胞中加入30ml不完全培養基，同上離心洗滌一次。然後將細 胞重懸至10ml ，混勻。
⑤ 取骨髓瘤細胞懸液，加臺盼藍染液作活細胞計數後備用 3.4脾細月包與NS-1細月包融合
① 將脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞，按8:1的比例加入到一支50ml離心 管中，補加完全培養基至20ml ，充分混勻；
② 100rpm離心7min ,棄上清；輕叩管底使細胞鬆散；加入相對分子量 為4000的50。/。的PEG0.7ml ,邊搖邊加，lmin內加完；
③ 再用吸管吸取細胞，靜置30sec ,然後30sec內將細胞吹入離心管中； 在5min內加入20ml完全培養基稀釋PEG;⑤800rpm離心7min ，棄上清； 加入10mlHAT培養基，輕輕混勻細胞；
⑥ 將細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔培養板中，每孔0.1ml。共加有 兩塊96孔培養板，將此兩塊板放入37。C ， 5。/。C02培養箱內培養。
4.融合後篩選
融合後18天用間接ELISA檢測細胞培養上清，同時用BSA、 KLH包被抗原 對照以排除與載體蛋白之間的交叉反應，檢測方法同小鼠免疫血清的檢測。 三天後重複檢測一次。
將檢測到的陽性孔細胞A6、 B8用有限稀釋法克隆化，同時將細胞從96孔 板轉移到24孔板中擴大培養，待細胞達到要求數量並處於對數生長期時收集 細胞凍存。以後每次克隆化的細胞用同樣的方法檢測，並及時將陽性雜交瘤 細胞擴大培養和凍存一批。實施例二、腹水型單克隆抗體的生產與純化
1. 腹水型單克隆抗體的製備
(1) 小鼠預處理每隻BALB/C小鼠腹腔內注射0.5ml弗氏不完全佐劑；
(2) 接種雜交瘤細胞24h後將雜交瘤細胞收集，1000rpm離心7min，棄 上清，用不完全培養基懸浮細胞細胞懸起並計數，每隻小鼠注射0.5ml細胞懸 液(約7xl05個/ml)。同時以相同數量的NS-1細胞注射小鼠，製備腹水作為 陰性對照。
(3) 接種雜交瘤細胞後18天後，用注射器抽取腹水。將抽取的腹水經 3000rpm離心15min,棄去沉澱，收集上清，分裝並置於-20。C水箱保存。
2. 腹水型單克隆抗體的純化
2.1硫酸銨鹽析法初提單克隆抗體
(1) 飽和碌u酸銨的配製於100ml蒸餾水中加90g硫酸銨，80。C溶解過濾， 降至室溫後即有結晶析出，任其留在瓶中，用時取所需要量，用氨水調PH至 7.2;
(2) 在冰浴中將處理好的腹水用0.02M PH7.4的PBS稀釋4倍。然後在4。C 攪拌下，逐滴加入8倍腹水量的飽和硫酸銨，然後在水箱放置2h以上，使其形 成沉澱物；
(3) 10000rpm， 4。C離心15min，棄上清，將沉澱物溶解於0.02M PH7.4的 PBS中，透析過夜，凍存。
2.2 rProteinA FF純化分離抗體 2.2.1 rProteinAFF純化分離腹水器材與試劑 rProteinA FF預裝柱 GE公司
0.1MPH8.0PBS: Na2HP04'12H20 33g， KH2P04 0.76g, NaCl 8g,加蒸 餾水至1000ml。0.1MPH6.0檸檬酸緩衝液0.1M檸檬酸9.5ml 0.1M檸檬酸鈉40.5ml。 0.1MPH5.0檸檬酸緩衝液0.1M檸檬酸20.5ml 0.1M檸檬酸鈉29.5ml。 0.1MPH4.2檸檬酸緩沖液0.1M檸檬酸31.5ml 0.1M檸檬酸鈉18.5ml。 0.1MPH3.0杼檬酸緩衝液0.1M檸檬酸46,5ml 0.1M檸檬酸鈉3.5ml。 lMPH9.0Tris-HCl緩衝液12.1gTris， 5mllMHCl ,加蒸餾水至100ml。 0.2MPH2.2Gly陽HCl緩衝液50ml 0.2MGly, 44.0ml 0.2M HC1,加蒸餾 水至100ml。
2.2.2 rProteinA FF純化分離腹水方法
(1) 用2 ~3倍體積的O . 2M PH2.2 Gly-HCl緩衝液洗rProteinA FF預裝 柱，然後用0.1MPH8.0PBS平衡。
(2) 樣品處理1體積預處理過的腹水加3體積量0.1MPH8.0PBS，20000g 4°C離心30min，取上清用1M PH9.0 Tris-HC1緩衝液調至PH8.0。
(3) 上樣1柱床體積加樣0.2體積樣品，靜置15min。
(4) 洗脫依次用0.1MPH6.0檸檬酸緩沖液、0.1MPH5.0檸檬酸緩衝液、
0. 1MPH4.2檸檬酸緩衝液、0.1MPH3.0檸檬酸緩沖液、0.2M PH2.2 Gly-HCl 緩衝液洗脫，收集樣品。
3.純化結果
收集的樣品在280nm下檢測吸光值，發現在PH4.2處出現一個主峰，說明 此腹水較純，成分為IgG3。純化後的抗體進行SDS-PAGE檢測，發現在50KD 和25KD處各出現一條較強和較弱的條帶，分別與抗體重、輕鏈實際大小相符， 說明純化得到的蛋白是抗體蛋白。
實施例三、酶聯免疫檢測方法的建立(試劑盒組成及操作方法)
1. 4金測方法的原理基於竟爭性酶聯反應原理，相關的巖沙海葵毒素PTX包被於微孔板上，吸 附在孔內的抗原與被測試的樣品中的抗原竟爭性與PTX單克隆抗體相結合。當 樣品抗原相結合的抗體被洗塗去除後，只剩下與《鼓孔內抗原相結合的抗體， 與經酶標記的二抗相結合，酶底物在酶作用下產生藍色產物，加酸鄉冬止反應， 在450nm波長測定其OD值。OD值的大小與樣品中PTX的含量成反比。
2. ;險測方法的材料
2.1儀器酶標儀、水浴箱、酶標《敬孔板。
2.2主要試劑巖沙海葵毒素標準品、抗PTX-KLH的單克隆抗體、包被液 (PH7.4 0.01MPBS )、封閉液(5%BSA/0.01MPBS )、洗滌液(0.01MPBS/0.05% Tween20,PBS-T)、抗體稀釋液(1%BSA/PBS-T) 、 TMB顯色液、2MH2S04、 HRP-羊抗鼠IgG
3. 操作程序
(1) 包被用PH7.4 PBS緩衝液按需稀釋PTX，以100jul/孔的PTX加入到96 孔酶標板中，置4。C冰箱過夜；
(2) 甩幹板孔中液體，然後向孔中加入PBS-T洗滌緩衝液,每孔300nl，放 置搖床上輕輕晃動3min,棄去洗液，拍幹，重複洗板4次；
(3) 用封閉液300pl/孔，37。C水浴封閉2h;
(4) 洗板4次，操作同(2),加樣品提取液(或標準液)50nl/孔和已稀 釋的單抗50iil/孔，37。C水浴放置lh;
(5) 洗板3次，操作同(2);
(6) 加入已稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG，每孔100ial， 37。C水浴;^文置lh, 洗板3次；
(7) 加入TMB顯色液，每孔100pl， 37。C顯色30min; (8 ) 2M H2SO4終止液終止顯色反應,每孔50^il;
(9)酶標儀測定OD450值。
ii4.結果計算
巖沙海葵毒素的濃度按下面的公式計算
巖沙海葵毒素PTX濃度(ng/g) = " m
式中
c一PTX含量，單位為納克(ng)，對應標準曲線按數值插入法求； Vl—樣品提取液的體積，單位為毫升(mL); V2—滴加樣液的體積，單位為毫升(mL); D一稀釋倍數；
m—試樣質量，單位為克(g) 實施例四、單克隆、多克隆抗體ELISA間接法測定巖沙海葵毒素的比較 1.材料與方法
1.1 PTX免疫抗原與檢測抗原的製備
在PH7.5, 0.1M PBS: DMS0=19: 1的混合液中加入20pg PTX和12pg 的SPDP, 4。C水箱過夜。混合物加入等量CH2CL2萃取3次，取水層部分過 5mlSephadexG-25預裝柱，用含0.1MNaCl的PH7.0, O.IMPBS洗脫，收集 最大吸收波長在263nm下的洗脫液。
在0.025M, PH9.0硼酸鹽緩衝液中加入45叫KLH蛋白和50倍摩爾濃度 (2畫iminothiolate: KLH)的2-亞氨基硫醇鹽(2-iminothiolate )， 4。C冰箱過夜。 混合物過截留分子量為30K的超濾管，取上層管液體，在分光光度計下檢測 KLH-SH最大吸收波長278nm下的洗脫液，並凍幹。BSA-SH的製備跟KLH-SH 相同，收集在279nm下的洗脫液，並凍幹。
免疫抗原將PTX-PDP、 BSA-SH和KLH-SH均溶解於PH7.5,0.1MPBS 中，體積分別為lml、 0.5ml、 0.5ml。然後BSA-SH和KLH-SH都分別加入到 等體積的PTX-PDP溶液中，4。過夜。然後再過5ml Sephadex G-25預裝柱， 用含0.1MNaCl的PH7.0， O.IMPBS洗脫，收集分光光度計檢測下收集最大吸收波長為267nm的PTX-PDP-KLH和最大吸收波長為273nm的
PTX-PDP-BSA。
1.2抗PTX多克隆抗體的製備
將PTX-PDP-KLH按常規方法免疫雌性6 8周齡BALB/C小鼠。經親和層 析處理得到與KLH和BSA無交叉反應性的抗血清。 1.3抗PTX單克隆抗體的製備按常規方法製備。 1.4多克隆、單克隆抗體EUSA間接測定方法
(1) 用濃度梯度的PTX檢測抗原加入到96孔酶標板中，每個濃度做2個 孔，置4'C冰箱過夜；
(2) 甩幹板孔中液體，然後向孔中加入PBS-T洗滌緩衝液,每孔 放置搖床上輕輕晃動3min,棄去洗液，拍幹，重複洗板4次；
(3 )用封閉液300ixl/孔,37 °C水浴封閉2h;
(4) 洗板4次，操作同(2)，在同樣濃度的孔中分別加入單克隆抗體和 多克隆抗體，在37t水浴放置lh;
(5) 洗板3次,操作同(2);
(6) 加入已稀釋的HRP標記的羊抗小鼠IgG，每孔100nl， 37。C水浴放 置lh,洗板3次；
(7 )加入TMB顯色液，每孔100|li1， 37。C顯色30min;
(8) 2MH2SCM冬止液終止顯色反應，每孔50ixl;
(9) 酶標儀測定OD450值。 2結果與討論
結果顯示PTX濃度0.5mg/L時單抗法結果高於多抗法。出現這樣的原 因主要是因為單克隆抗體是由生長在細胞培養物中的同一 B淋巴細月包的群體 合成並分泌的，因此所有的抗體識別的是同一個抗原決定簇。
此外，由於單克隆抗體是針對抗原某一抗原決定簇分泌的，不同於多克隆抗體，是多個不同克隆的B細胞產生的，是多種抗體的混合物，因此能夠
避免了因動物之間的同源性而導致的交叉反應，從而確保了結果的真實可靠。 另外，分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞能夠在體外"永久"地存活並傳代， 只要不發生細胞林的基因突變，就可以不斷的生產高特異性、高均一性的抗 體，而不同於多克隆抗體，每次必須要對小鼠進行免疫後才能得到。巖沙海 葵毒素樣品價格昂貴，供貨來源少，其免疫抗原的製備工序複雜，可重複性
不高。使得多克隆抗體的方法不適合用於巖沙海葵毒素的實際;險測中，而更
凸現單克隆抗體技術在PTX檢驗中的重要性。
以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本 發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在 本發明的保護範圍之內。
權利要求
1、一種產生抗巖沙海葵毒素的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其保藏號為CCTCC No.C200922。
2、 一種由權利要求1所述的雜交瘤細胞系產生的單克隆抗體，所述單克 隆抗體特異性地抗巖沙海葵毒素。
3、 一種巖沙海葵毒素檢測試劑盒，其包含權利要求2所述的單克隆抗體。
4、 權利要求1所述的雜交瘤細胞系在檢測巖沙海葵毒素中的應用。
5、 權利要求2所述的單克隆抗體在檢測巖沙海葵毒素中的應用。
6、 權利要求3所述的試劑盒在檢測巖沙海葵毒素中的應用。
全文摘要
本發明屬於生物醫學和免疫學領域，特別涉及一種特異性的單克隆抗體以及產生該抗體的雜交瘤細胞系，及含有該單克隆抗體的試劑盒和在檢測PTX毒素檢測中的用途。本發明涉及的雜交瘤細胞系，保藏在CCTCC，保藏號為CCTCC No.C200922。本發明建立了一種快速、準確、重複性好、特異性強、靈敏度高的檢測的方法，用於鑑別高致中毒性海葵種群以及測定供人類使用的海產品裡PTX的含量分布，可以有效地減輕或避免PTX中毒事件的發生。
文檔編號C07K16/44GK101597596SQ20091003986
公開日2009年12月9日 申請日期2009年5月31日 優先權日2009年5月31日
發明者戴悅嬋, 紅 焦, 王家驥, 陳思強 申請人:焦 紅;王家驥;陳思強;戴悅嬋