一種芒果苷小檗鹼鹽及其製備方法與用途的製作方法

2023-05-31 23:02:26

專利名稱：一種芒果苷小檗鹼鹽及其製備方法與用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種芒果苷小檗鹼鹽及其製備方法及作為AMPK激活劑的用途。
背景技術：
芒果苷(mangiferin)是天然多酚類化合物，分子式=C19H18O11,分子量422。其化學結構如下 小檗鹼(berberine)為異喹啉類生物鹼。分子式[C2tlH18NO4]+,分子量336· 37。其化學結構如下 廣西中醫學院李學堅課題組公開的專利說明書公開號CN101066275A;發明名 稱芒果苷_小檗鹼組合物之發明內容第一段論到「芒果苷呈酸性，而小檗鹼(或其鹽 類)呈鹼性，可在一定條件下反應生成芒果苷_小檗鹼組合物——定位為組合物，是因為兩 者的結合併不十分牢固，只是分子間範德華力作用的結果。這種組合物在濃度較大，或在體 內消化時，又互相分開而獨立存在，這也為它們發揮各自的藥理作用創造了條件。，，第五段 論到「試驗結果表明，濃度在2. 5%以下的芒果苷-小檗鹼組合物溶液十分穩定，即使置於 5°C環境中保存，也不會析出結晶；如是2. 5-5%的溶液，即配即用，在8個小時內不會析出 結晶；如是5-10%的溶液，即配即用，在3個小時內不會析出結晶」。分析上述技術方案可知首先其闡述的物質基礎是「溶液狀態下的組合物」，其次， 由於該物質基礎為溶液狀態下的組合物，故存在著以下缺陷1、穩定性差；根據上述專利說明書中公開的內容可見，該組合物的穩定性為數小 時，而符合藥物特性的穩定性至少需達1年以上，可見該技術方案中闡述的組合物的穩定
性較差。
2、不易貯存；3、無法製備固體製劑。上述專利說明書中公開的內容僅為將該組合物製備成液體 製劑或半固體製劑，未見有固體製劑的內容。我們已公開的關於芒果苷與小檗鹼的組合物公開號W0/2008/043246 ；發明名 稱具有2型糖尿病及其慢性併發症治療作用的藥物組合物則僅為芒果苷與小檗鹼兩個 化合物按一定比例組合的組合物，並未涉及化合物間的反應或結合。CN101066275A公開的專利申請中提供的芒果苷小檗鹼溶液狀態下的組合物的制 備方法，儘管芒果苷呈弱酸性，而小檗鹼(或其鹽類)呈弱鹼性，但在其所公開的反應條件 下，無法獲得芒果苷小檗鹼鹽。該說明書中亦論到「芒果苷呈酸性，而小檗鹼(或其鹽類) 呈鹼性，可在一定條件下反應生成芒果苷_小檗鹼組合物——定位為組合物，是因為兩者的 結合併不十分牢固，只是分子間範德華力作用的結果。」綜上可見，上述公開文獻皆未給出將芒果苷與小檗鹼通過反應可結合為芒果苷小 檗鹼鹽的技術啟示。磷酸腺苷(AMP)激活的蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase, AMPK)是一 種在細胞內行使能量代謝調節的蛋白激酶。隨著對AMPK研究的日益深入，AMPK在代謝性 疾病、心血管疾病、神經系統疾病、炎症性疾病、腫瘤、肌肉系統疾病的發病中發揮至關重要 的作用，AMPK正成為疾病治療新靶點，但目前尚未有上市的AMPK激活劑，故研究開發AMPK 激活劑具有重要的臨床意義李忌.AMPK 糖尿病與心血管疾病治療新靶點.中國醫學論 壇報，2009，(1149)；任俊芳.AMPK與心血管重構.國際病理科學與臨床雜誌，2008，28 (1) 33-36 ；RicardoLage, Carlos Dieguez, Antonio Vidal-Puig. et al. AMPK -.a metabolic gaugeregulating whole-body energy homeostasis. Trends Mol Med,2008,14(12) 539-49 ；符慶瑛，高鈺琪.蛋白激酶AMPK的研究進展.生命科學，17(2) :147_152 ；陳奇，梁 後傑，鄒嵐，等.一磷酸腺苷活化蛋白激酶對環氧合酶_2表達與5-氟尿嘧啶治療結腸癌敏 感性的關係.實用醫院臨床雜誌，2008，5 (3) :56-58等。

發明內容
我們通過大量的研究創造性地獲得芒果苷小檗鹼鹽。該芒果苷小檗鹼鹽的物質 基礎為芒果苷與小檗鹼通過離子鍵結合的化合物，其相較於CN101066275A所公開的芒果 苷_小檗鹼組合物具有以下特點1、穩定性好。2、可製成固體、液體等各種製劑。3、易於貯存。另外，該芒果苷小檗鹼鹽更表現出以下意想不到的技術效果我們的研究發現該芒果苷小檗鹼鹽在較強酸性溶液溶解，PH值越小溶解越好，在 PH值1-3的酸液中，芒果苷小檗鹼鹽濃度低於2mg/ml的溶液中12小時內僅有微量沉澱析 出；在芒果苷小檗鹼鹽濃度大於4mg/ml，溶解後會很快析出沉澱。由於人體胃液的pH值為 1-3，芒果苷小檗鹼鹽的上述性質可使其很好的溶解在胃液中，這非常有利於藥物在體內的 吸收。而芒果苷小檗鹼任何比例的組合物在酸水中不能增加溶解度。具體技術方案如下
本發明提供一種芒果苷小檗鹼鹽，其特徵在於①所述芒果苷小檗鹼鹽具有下式(I)的結構； ②所述芒果苷小檗鹼鹽的熔點為176°C -178°C。本發明所述的芒果苷小檗鹼鹽，還具有以下特徵所述芒果苷小檗鹼鹽的碳譜數 據具有以下特徵小檗鹼c6，C13a，C8a，C12a碳原子的化學位移由於屏蔽作用而發生顯著改變。本發明所述的芒果苷小檗鹼鹽，還具有以下特徵所述芒果苷小檗鹼鹽的碳譜數 據具有以下特徵芒果苷c3，C7碳原子的化學位移由於去屏蔽作用而發生顯著改變。本發明提供所述芒果苷小檗鹼鹽的製備方法，其特徵在於①將芒果苷與鹼性鈉(鉀)鹽反應製備成芒果苷單鈉(鉀)鹽；②將芒果苷單鈉(鉀)鹽與小檗鹼反應生成芒果苷小檗鹼鹽。本發明所述的芒果苷小檗鹼鹽可以採用的製備方法如下①在反應器中加入反應溶媒和芒果苷混懸得混懸液，將鹼性鈉(鉀)鹽水溶液加 入混懸液中，反應至澄清，濾過，得溶液A。②將小檗鹼加入水中溶解，濾過，得溶液B。③將溶液A滴加入攪拌狀態下的溶液B中，滴加完畢繼續攪拌，使反應完全，產生 大量沉澱，過濾，固體物乾燥，得芒果苷小檗鹼鹽。本發明所述的芒果苷小檗鹼鹽的製備方法，其特徵在於所述芒果苷與鹼性鈉 (鉀)鹽的摩爾配比為1 0.5-1。本發明所述的芒果苷小檗鹼鹽的製備方法，其特徵在於所述芒果苷單鈉(鉀)鹽 與小檗鹼摩爾配比為1 1。本發明所述的芒果苷小檗鹼鹽的製備方法，其特徵在於所述鹼性鈉(鉀)鹽可以 選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、醋酸鈉、醋酸鉀中的一種或兩種以上的混合物。上述製備方法中所述反應溶媒為水與乙醇、甲醇、丙酮等可與水混溶的有機溶劑 中一種或兩種以上的混合物，其中水的體積比10-90% (ν/ν) 0本發明所述的芒果苷小檗鹼鹽的製備方法，其特徵在於所述小檗鹼也可以是鹽 酸小檗鹼、硫酸小檗鹼、鞣酸小檗鹼或小檗鹼其他醫學上可接受的鹽。優選小檗鹼、鹽酸小 檗鹼、硫酸小檗鹼。芒果苷小檗鹼鹽的理化性質芒果苷小檗鹼鹽，橙色粉末狀物，熔點176-178°C，幾乎不溶於水，在沸水中略溶。 結構式如下 芒果苷小檗鹼鹽的結構確證芒果苷小檗鹼鹽與芒果苷、小檗鹼13CNMR(400MHz)數據如下表 芒果苷小檗鹼鹽與芒果苷、小檗鹼13HNMR(400MHz)數據如下表 上述數據分析如下芒果苷小檗鹼鹽的碳核磁數據與芒果苷、小檗鹼碳核磁數據比較小檗鹼基團的 C6, C13a，C8a，C12a等碳原子的化學位移由於屏蔽作用改變顯著，其他碳原子的化學位移都有 不同程度的改變。芒果苷基團的c3，C7碳原子的化學位移由於去屏蔽作用而發生顯著改變， 其他碳原子的化學位移由於屏蔽作用均有不同程度的改變。芒果苷小檗鹼鹽的氫核磁數據與芒果苷、小檗鹼氫核磁數據比較小檗鹼基團的 H5，H12，H13等氫原子的化學位移由於屏蔽作用而改變顯著，其他氫原子的化學位移都有不同 程度的改變。芒果苷基團的端基質子H/和三個芳香質子H4, H5, H8等氫原子的化學位移由於屏蔽作用改變顯著。上述核磁數據化學位移的變化表明芒果苷基團與小檗鹼基團中各原子的化學環 境發生了變化，說明小檗鹼基團與芒果苷基團結合形成了芒果苷小檗鹼鹽。本發明的另一目的是提供一種藥物，該藥物由上述芒果苷小檗鹼鹽與藥學上可接 受的藥用輔料組合，並按相應的製藥方法，即可製成臨床適用的任何一種口服製劑、外用制 劑或注射劑，例如片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、丸劑、糖漿劑、口服溶液劑、口服混懸 劑、凝膠劑、凍乾粉針等臨床可接受的劑型。本發明提供所述芒果苷小檗鹼鹽在製備AMPK激活劑中的用途。本發明提供以芒果苷小檗鹼鹽為活性成分製備的藥物在製備AMPK激活劑中的用 途。鑑於現代醫學對AMPK在疾病發生發展中所起重要作用的揭示，本發明提供一種 芒果苷小檗鹼鹽在製備AMPK激活劑中的應用，其特徵在於所述AMPK激活劑可用於預防或 治療下述疾病中的任何一種或幾種糖尿病、糖尿病各種慢性併發症(包括冠心病、動脈粥 樣硬化、腦血管病等大血管病變；糖尿病腎病、糖尿病性視網膜病變等微血管病變；神經病 變；糖尿病足；黃斑病、白內障、青光眼、屈光改變、虹膜睫狀體病變等眼的其他病變等)、肥 胖、高脂血症、胰島素抵抗、高胰島素血症、X症候群、心肌肥大、心律失常、動脈粥樣硬化、缺 血性心臟病、心力衰竭、高血壓、上呼吸道感染、慢性支氣管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纖 維化、肝炎、脂肪肝、酒精肝、肝纖維化、肝硬化、前列腺炎、胰腺炎、腎炎、腎病症候群、慢性 腎功能不全、風溼性關節炎、類風溼性關節炎、骨性關節炎、炎症性腸病、阿爾茨海默氏病、 記憶障礙、梗塞性痴呆、帕金森氏症、腫瘤(包括腫瘤放療、化療不敏感；腫瘤放療、化療產 生的毒性反應)、肌肉萎縮、肌肉無力症。本發明提供一種芒果苷小檗鹼鹽在製備AMPK激活劑中的應用，其特徵在於所述 AMPK激活劑可用於運動替代。本發明提供的芒果苷小檗鹼鹽用作AMPK激活劑的有效劑量範圍為0. l-30mg/kg/ 日/人。以上用量是根據體外試驗及動物實驗結果推算的，因動物與人體之間的差異，各種 疾病之間的差異、體內外差異，故允許實際臨床應用劑量有所調整。用法可根據具體疾病進 行選擇，以口服為優選。 下面給出具體實施方式
對本發明作進一步說明，但不限於此。


圖1芒果苷小檗鹼鹽的差熱分析(DSC)曲線圖。圖2芒果苷小檗鹼鹽對腫瘤細胞毒性的影響。縱坐標為細胞死亡率(％ )。(注 與單獨給藥組比較*P < 0. 05，< 0. 01)圖3芒果苷小檗鹼鹽對KK-ay小鼠胰島素敏感指數與血脂等的影響(注與模型 組比較*P < 0. 05，**P < 0. 01，***P < 0. 001)圖4芒果苷小檗鹼鹽對KK-ay小鼠肝酶的影響(注與模型組比較*P < 0. 05， **P < 0. 01)圖5芒果苷小檗鹼鹽對痴呆大鼠學習記憶力影響。縱坐標為潛伏期(EL)。(注 與模型組比較*P < 0. 05，**P < 0. 01)
圖6芒果苷小檗鹼鹽對類風溼性關節炎模型大鼠的影響。(注與模型組比較*P < 0. 05，**P < 0. 01)
具體實施例方式本發明所述的芒果苷採用市售品(廣西百色天星科技開發有限公司，具有相應提 取設備的廠家均可以生產)。鹽酸小檗鹼、小檗鹼等均為市售品(西安小草植物科技有限公 司)。碳酸氫鈉、碳酸鈉、碳酸氫鉀、碳酸鉀試等劑均採用市售品。實施例1 芒果苷小檗鹼鹽的製備在反應器中加入芒果苷42. 2g(0. lmol)、水1800ml、乙醇600ml充分混懸，將碳酸 氫鈉8.4g(0. lmol)加水製成0.5% (w/v)溶液，緩慢加入攪拌狀態的混懸液中，反應至澄 清，濾過，得反應液A ；取小檗鹼33. 6g(0. lmol)加沸水1500ml溶解，濾過，得溶液B。將反 應液A緩慢加入溶液B中，充分攪拌，靜置12小時，有沉澱析出，過濾，沉澱物用純水充分洗 滌，固體物低於60°C真空乾燥，得棕色固體芒果苷小檗鹼鹽53. 4g，收率為70. 5%。樣品純 度經HPLC測定為98.6%。實施例2 芒果苷小檗鹼鹽的製備在反應器中加入芒果苷42. 2g(0. lmol)、水2000ml、乙醇800ml充分混懸，將碳酸 鈉5.3g(0.05mol)加水製成(w/v)溶液，緩慢加入攪拌狀態的混懸液中，反應至澄清， 濾過，得反應液A ；取鹽酸小檗鹼37. 3g(0. lmol)加沸水2500ml溶解，濾過，得溶液B。將反 應液A緩慢加入溶液B中，充分攪拌，靜置12小時，有沉澱析出，過濾，沉澱物用純水充分洗 滌，固體物低於60°C真空乾燥，得棕色固體芒果苷小檗鹼鹽53. 3g，收率為67. 4%。樣品純 度經HPLC測定為98. 5%0實施例3 芒果苷小檗鹼鹽的製備在反應器中加入芒果苷42. 2g(0. lmol)、水1600ml、甲醇800ml充分混懸，將碳酸 鉀6. 9g(0. 05mol)加水製成0. 2% (w/v)溶液，緩慢加入攪拌狀態的混懸液中，反應至澄清， 濾過，得反應液A ；取硫酸小檗鹼43. 2g(0. lmol)加水2500ml溶解，濾過，得溶液B。將反 應液A緩慢加入溶液B中，充分攪拌，靜置12小時，有沉澱析出，過濾，沉澱物用純水充分洗 滌，固體物低於60°C真空乾燥，得棕色固體芒果苷小檗鹼鹽51. 8g，收率為60. 6%。樣品純 度經HPLC測定為98.6%。實施例4 芒果苷小檗鹼鹽的製備在反應器中加入芒果苷42. 2g(0. lmol)、水1000ml、甲醇1000ml充分混懸，將碳 酸氫鉀10.0g(0. lmol)加水製成2% (w/v)溶液，緩慢加入攪拌狀態的混懸液中，反應至澄 清，濾過，得反應液A ；取小檗鹼33. 6g(0. lmol)加沸水2500ml溶解，濾過，得溶液B。將反 應液A緩慢加入溶液B中，充分攪拌，靜置12小時，有沉澱析出，過濾，沉澱物用純水充分洗 滌，固體物低於60°C真空乾燥，得棕色固體芒果苷小檗鹼鹽49. 5g，收率為65. 3%。樣品純 度經HPLC測定為98. 5%0實施例5 芒果苷小檗鹼鹽的製備在反應器中加入芒果苷42. 2g(0. lmol)、水3000ml、丙酮300ml充分混懸，將碳酸 鈉5.30g(0.05mol)加水製成5% (w/v)溶液，緩慢加入攪拌狀態的混懸液中，反應至澄清， 濾過，得反應液A ；取小檗鹼33. 6g(0. lmol)加沸水2500ml溶解，濾過，得溶液B。將反應液A緩慢加入溶液B中，充分攪拌，靜置12小時，有沉澱析出，過濾，沉澱物用純水充分洗滌，固 體物低於60°C真空乾燥，得棕色固體芒果苷小檗鹼鹽50. 9g，收率為67.2%。樣品純度經 HPLC 測定為 98. 5%。實施例6 芒果苷小檗鹼鹽的製備在反應器中加入芒果苷42. 2g(0. lmol)、水300ml、乙醇3000ml充分混懸，將碳酸 鈉5.30g(0.05mol)加水製成0.2% (w/v)溶液，緩慢加入攪拌狀態的混懸液中，反應至澄 清，濾過，得反應液A ；取小檗鹼33. 6g(0. lmol)加沸水3000ml溶解，濾過，得溶液B。將反 應液A緩慢加入溶液B中，充分攪拌，靜置12小時，有沉澱析出，過濾，沉澱物用純水充分洗 滌，固體物低於60°C真空乾燥，得棕色固體芒果苷小檗鹼鹽51. 6g，收率為68. 1%。經HPLC 測定純度為98.6%。實施例7 芒果苷小檗鹼鹽片劑的製備稱取上述方法製備的芒果苷小檗鹼鹽粉末333g，過100目篩，加入微晶纖維素 200g、藥用澱粉300g作為稀釋劑組成製劑配方，混勻，加入粘合劑制軟材，用24目篩制粒， 乾燥後整粒，加入適量潤滑劑，壓片，製成10000片，包衣，即得，含藥量為33. 3mg/片。實施例8 芒果苷小檗鹼鹽顆粒的製備稱取上述方法製備的芒果苷小檗鹼鹽粉末10g，過100目篩，加入羧甲基纖維素 490g、木糖500g，混勻，加入粘合劑制軟材，用24目篩制粒，乾燥後整粒，製成lOOOg，即得， 含藥量為10mg/g。實施例9 芒果苷小檗鹼鹽膠囊的製備稱取上述方法製備的芒果苷小檗鹼鹽粉末333g，過100目篩，加入微晶纖維素 100g、藥用澱粉600g作為稀釋劑組成製劑配方，混勻，加入粘合劑制軟材，用24目篩制粒， 乾燥後整粒，加入適量潤滑劑，分裝膠囊，即得，含藥量為33. 3mg/粒。實施例10 芒果苷小檗鹼鹽混懸劑的製備稱取上述方法製備的芒果苷小檗鹼鹽粉末10g，研成極細粉，備用；取羧甲基纖維 素鈉、羥苯乙酯適量，加適量水製成膠漿，分別加入芒果苷小檗鹼鹽，單糖漿適量，隨加隨攪 拌，加水至1000ml，攪勻，分裝，即得含藥量為10mg/ml。試驗例1 芒果苷小檗鹼鹽溶解度測定分別精密稱取研成細粉芒果苷小檗鹼鹽5mg，置於25°C 士 2°C 50ml蒸餾水中，每隔 5分鐘強力振搖30秒鐘；觀察30分鐘內的溶解情況。芒果苷小檗鹼鹽仍有可見溶質顆粒， 其水溶解度小於0. lmg/ml，屬水幾乎不溶物質。試驗例2 芒果苷小檗鹼鹽在不同pH酸水中的溶解情況取純淨水，加鹽酸分別調pH值為1、3、5 ；分別取不同pH值的水各50ml，分別精密 稱取研成細粉的芒果苷小檗鹼鹽50mg加入，振搖；觀察溶解情況。芒果苷小檗鹼鹽在pH值 1的水中在數秒鐘內迅速溶解，在PH值3的水中5分鐘內溶解，在pH值5的水中不能完全溶解。另取pH值1、3的水各50ml，分別精密稱取研成細粉的芒果苷小檗鹼鹽IOOmg加 入，振搖；觀察溶解情況。芒果苷小檗鹼鹽在PH值1的水中在1分鐘溶解，在pH值3的水 中不能完全溶解。另取pH值1的水50ml，分別精密稱取研成細粉的芒果苷小檗鹼鹽200mg加入，振搖；觀察溶解情況。芒果苷小檗鹼鹽在PH值1的水中在仍能溶解，但很快有沉澱物析出。取pH值1的水50ml三份，分別精密稱取研成細粉不同比例芒果苷-小檗鹼組合物 (摩爾比1 1,1 3,1 5)各50mg，加入，振搖；觀察溶解情況。不同比例芒果苷-小 檗鹼組合物均僅有微量溶解。將上述溶液標記後室溫靜置，觀察24小時內的現象。在pH值1、3的酸液中，芒果 苷小檗鹼鹽濃度lmg/ml、2mg/ml的溶液中12小時內僅有微量沉澱析出；在pH值1的酸液 中，芒果苷小檗鹼鹽濃度4mg/ml的溶液中12小時沉澱析出較多。試驗例3 芒果苷小檗鹼鹽的初步穩定性考察試驗取芒果苷小檗鹼鹽數份置玻璃瓶內，密閉，置藥品穩定性試驗箱內，設置為加速試 驗條件40°C 士2°C /75% RH+5% RH.分別在0、1、2、3月取樣，採用高效液相法測定芒果苷 小檗鹼鹽的含量。試驗結果顯示芒果苷小檗鹼鹽在加速試驗條件下三月內含量無明顯變 化，提示本品在常溫條件下的穩定性大於1年。為了說明發明內容中所述芒果苷小檗鹼鹽的藥理活性，本發明人採用體內外相結 合、以具代表性的疾病模型作為各類疾病代表的方式進行實驗研究。即用體外方式研究芒 果苷小檗鹼鹽對AMPK磷酸化的影響及對腫瘤細胞的化療增敏作用；又分別以KK-ay小鼠、 類風溼性關節炎大鼠、阿爾茨海默氏病大鼠來代表糖脂代謝紊亂性疾病、自身免疫疾病、神 經變性疾病。以期說明芒果苷小檗鹼鹽作為AMPK激活劑、用以治療各種疾病的可行性。詳 細闡述如下試驗例4 芒果苷小檗鹼鹽對AMPK激活作用1、材料按上述實施例製備芒果苷小檗鹼鹽，以DMSO溶解。臨用前以培養基或HBS緩衝液 稀釋。DMSO終濃度彡0. 2%。L6細胞購自ATCC。高糖DMEM培養基購自GIBCO公司；胎牛血清購自Hyclone公 司。抗AMPK兔源多克隆抗體、抗ACC兔源多克隆抗體、抗AMPK蘇氨酸172位點磷酸化兔源 多克隆抗體、抗ACC絲氨酸79位點磷酸化兔源多克隆抗體購自Cell Signal Technology 公司。2、實驗方法2.1細胞培養與分化分化前的L6細胞用高糖DMEM培養基，含10%胎牛血清，100U/ml青黴素、100U/ml 鏈黴素，置於含有的5% C02的培養箱內37°C培養。L6細胞的分化是在細胞長滿60%左右 時，換成含2%胎牛血清的高糖DMEM培養基，每兩天更換一次培養基，直到L6細胞分化至 90%左右。2. 2化合物處理及樣品收集先將6孔板中的細胞在無血清的高糖DMEM培養基中飢餓。受試物以不同的濃度 梯度加到無血清的高糖DMEM培養基中，DMSO含量0.2%。受試物與細胞孵育3h，然後，用 冰冷的 1 XPBS 洗 2 次，加入 200 μ 1 IX SDS 電泳緩衝液(50mMTris ·Η(Χ，IOOmM DTT，2% 電 泳級SDS，0. 溴酚藍，10%甘油)裂解細胞lOmin。收集裂解液，超聲15秒鐘，在100°C煮 樣品IOmin02. 3免疫印跡檢測
裂解液經10% SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析，再在轉膜儀中以100V，l_2h轉移 到PVDF膜上。將凝膠中的蛋白質半乾轉移到硝酸纖維薄膜上，麗春紅S(P0nceaU S)確定 條帶。在封閉液(3%脫脂奶粉，0. 1% Tween, TBS溶解)中封閉1小時，加入1 1000稀 釋一抗4°C過夜，TBS洗滌3X15min，加入1 1000稀釋二抗，室溫孵育1小時，TBS洗滌 3X15min,置於ECL中衝洗5_10min，用X光片壓片顯影。3、結果結果表明2. 5-5 μ mol/L芒果苷小檗鹼鹽呈劑量依賴性地顯著增強了 AMPK磷酸 化水平，同時顯著增強ACC磷酸化水平。試驗例5 芒果苷小檗鹼鹽對腫瘤細胞的化療增效作用1、材料:按實施例方法製備芒果苷小檗鹼鹽(簡稱BM)。順鉬(DDP)、阿黴素(ADM)、紫杉醇 (TAXOL)由市場購得。實驗樣品者皆用DMSO溶解後使用。2、分組:陰性對照組為DMSO組、芒果苷小檗鹼鹽組(20 μ mol/L)、順鉬組(1 μ mol/L)、阿黴 素組(Ιμπιο /υ、紫杉醇組(1 μ mol/L)、芒果苷小檗鹼鹽(20 μ mol/L) +順鉬組(1 μ mol/ L)、芒果苷小檗鹼鹽(20 μ mol/L) +阿黴素組(1 μ mol/L)、芒果苷小檗鹼鹽(20 μ mol/L) +紫 杉醇組(1 μ mol/L)。3、實驗方法將體外培養的人肝癌Bel-7402細胞系，按照IO3-IO4/孔，每孔200 μ 1接種到96 孔細胞培養板中，24小時後加入各受試物，其中加入兩個樣品的組別，需在加入芒果苷小檗 鹼鹽後與細胞共同培養3h後，再加入順鉬或阿黴素或紫杉醇，培養72h，然後採用四氮唑鹽 還原法(MTT法)檢測細胞毒性。試驗重複兩次。4、結果芒果苷小檗鹼鹽聯合順鉬或阿黴素或紫杉醇組的細胞毒性顯著高於單獨應用順 鉬或阿黴素或紫杉醇組。表明芒果苷小檗鹼鹽對化療具有增加其細胞毒作用(見附圖2)。試驗例6 芒果苷小檗鹼鹽對KK-ay小鼠的影響1、藥物按實施例方法製備芒果苷小檗鹼鹽，用3%。羧甲基纖維素鈉混懸後使用。鹽酸羅格 列酮為浙江萬馬藥業有限公司生產。2、動物雄性KK-ay小鼠，16周齡。3、分組及給藥將KK-ay小鼠隨機分為8組，即模型組(η = 10)，芒果苷小檗鹼鹽低劑量組[20mg/ kg, η = 10，簡稱BML組]，芒果苷小檗鹼鹽中劑量組[40mg/kg，n= 10，簡稱BMM組]，芒果 苷小檗鹼鹽高劑量組[80mg/kg,n = 10，簡稱BMH組]，二甲雙胍組[500mg/kg,n = 10]。每 日固定時間以灌胃給藥的方式進行。空白組給予等量的生理鹽水。共給藥30天。4、觀察指標血糖與血脂試驗結束時採血標本，血糖(mmol/L)、血脂[包括甘油三酯(TG， mmol/L)、膽固醇(TC，mmol/L)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL，mmol/L)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL，mmol/L)]、肝酶[包括丙氨酸轉氨酶(ALT，U/L)、天門冬氨酸轉氨酶(AST，U/L)]採用 GF-D800型半自動生化分析儀(山東高密彩虹分析儀器有限公司生產)檢測。胰島素放射免疫法，γ計數器計數，胰島素放免分析試劑盒，山東濰坊市三維 (3V)生物公司生產。胰島素敏感指數(ISI)計算=ISI= Ln(l/FPGX1/INS)。尿微量白蛋白於代謝籠中收集24h尿液並記錄尿量，尿液離心取上清-80 V保存 備用。隨意尿於每周周一 13 00用提尾反射法收集。採用競爭ELISA法檢測尿微量白蛋白， 計算尿白蛋白排洩率(尿白蛋白排洩率=尿微量白蛋白濃度(mg/L)X尿液的總量(ml)/ 收集總量的時間(分鐘)=Pg/分鐘，UAER)，圖中單位以mg/24h表示。5、統計學分析計量資料值以均數標準差(LSD)表示。兩組間比較採用t檢驗。6、結果芒果苷小檗鹼鹽40mg/kg即能顯著改善KK_ay小鼠的血糖、血脂、胰島素、尿白蛋 白排洩率、肝酶等各項指標，顯著提高胰島素敏感指數(見附圖3-4)。試驗例7 芒果苷小檗鹼鹽對痴呆大鼠的活性作用1試驗材料1.1 動物SD雄性大鼠，SPF級，體重250 300g，自由飲水進食，實驗前在實驗環境中適應 2-3d，實驗室溫度控制在25°C，相對溼度為40% -80%。1.2藥品、試劑及設備芒果苷小檗鹼鹽按實施例方法製備。凝聚態β澱粉樣肽1 40片段(AM_4C1)購自美國Sigma公司。實驗動物腦立體定位儀(SN2型)為日本成茂公司產品。水迷宮中國醫學科學院藥物研究所研製。2分組與給藥將SD鼠隨機分為5組，每組10隻，具體如下⑴假手術對照組即海馬內注射 等量生理鹽水；(2)AM_4Q處理模型組；(3)芒果苷小檗鹼鹽低劑量組(20mg/kg，簡稱BML 組)；(4)芒果苷小檗鹼鹽中劑量組(40mg/kg，簡稱BMM組)；(5)芒果苷小檗鹼鹽高劑量組 (80mg/kg,簡稱 BMH 組)。給藥方法各組動物於造模前一周開始灌胃給藥，每天1次，連續4周。迷宮訓練 期間，於訓練前0. 5h給藥。3試驗方法3. 1 AM_4Q誘導大鼠AD樣病變模型的製備應用凝聚態β澱粉樣肽1 40片段(AM_4CI)注入大鼠海馬內建立AD樣病變的動 物模型。具體如下SD大鼠經麻醉後於立體定位儀下以AM_4Q行雙側海馬內注射，每側各1μ 1(預先 將Αμ_4(1溶於無菌生理鹽水10 μ g/ μ 1，用前37°C下孵育1周)。注射部位為前囟後3. 5mm, 腦正中線旁開2. 0mm，其深度為2. 7mm。3. 2觀察指標與方法
空間學習記憶力測試採用Morris水迷宮法。平臺設於迷宮東北象限正中，水平 面高出平臺1. 5cm，水溫保持在19°C 20°C，大鼠連續訓練5d，每天2次，設定最長遊動時 間為70s，以秒表記時，記錄大鼠找到平臺所需時間(潛伏期，EL)。4.結果隨訓練天數增加，各組大鼠平均EL逐漸縮短。與假手術組比較，模型組大鼠EL 明顯延長，第4天開始差異顯著，說明造模成功。以第5d潛伏期為例，比較實驗各組的EL， 結果芒果苷小檗鹼鹽中高劑量組大鼠EL皆明顯縮短，表明芒果苷小檗鹼鹽能顯著改善 Αμ_40誘導的大鼠空間學習記憶障礙(見附圖5)。試驗例8 芒果苷小檗鹼鹽對類風溼性關節炎動物模型的影響1 材料Wistar大鼠，雌性，100士20g。牛源性II型膠原蛋白(Collagen II)，酸可溶性， 美國Sigma公司產品；弗氏不完全佐劑，美國Sigma公司產品。TNF-α試劑盒購自南京建 成生物工程研究所。2 造模將酸溶性II型膠原蛋白(C II)用弗氏不完全佐劑配成C II濃度為2. 5mg/ml的 乳劑，按每隻大鼠100 μ 1乳劑含C II 250 μ g，於右後足蹠皮內注射致炎。正常對照組每隻大鼠注射不含C II的弗氏不完全佐劑製成的乳劑100 μ 1。3給藥與分組將大鼠隨機分為6組，每組10隻，具體如下(1)正常對照組；(2)模型組；(3)芒 果苷小檗鹼鹽低劑量組(10mg/kg，簡稱BML組)；(4)芒果苷小檗鹼鹽中劑量組(20mg/kg， 簡稱BMM組)；(5)芒果苷小檗鹼鹽高劑量組(40mg/kg，簡稱BMH組)；(6)陽性對照組地 塞米松磷酸鈉組(0. lmg/kg,簡稱Dexa組)。給藥方法初次免疫2周後開始灌胃給藥，每天1次，連續4周，正常對照組與模型 組給予同等體積的生理鹽水。4觀察指標4. 1足腫脹度用毛細管放大測量法測右後足體積，求出腫脹增長百分率[(給藥 後值-給藥前值)/給藥前值]X100 %。4. 2細胞因子的檢測實驗結束時大鼠股動脈取血，提取血清，冷藏待測。TNF-α 按ELISA試劑盒說明進行檢測。5 結果芒果苷小檗鹼鹽中高劑量組可顯著抑制模型大鼠足腫脹與細胞因子TNF-α的分 泌。表明芒果苷小檗鹼鹽對類風溼性關節炎模型大鼠具有治療作用(見附圖6)。
權利要求
一種芒果苷小檗鹼鹽，其特徵在於①所述芒果苷小檗鹼鹽具有下式(I)的結構；②所述芒果苷小檗鹼鹽的熔點為176℃ 178℃。F200910040336XC0000011.tif
2.根據權利要求1所述的芒果苷小檗鹼鹽，其特徵在於所述芒果苷小檗鹼鹽的碳譜 數據具有以下特徵小檗鹼C6，C13a，C8a，C12a等碳原子的化學位移由於屏蔽作用而發生顯著 改變。
3.根據權利要求2所述的芒果苷小檗鹼鹽，其特徵在於所述芒果苷小檗鹼鹽的碳譜 數據具有以下特徵芒果苷C3，C7碳原子的化學位移由於去屏蔽作用而發生顯著改變。
4.權利要求1所述的芒果苷小檗鹼鹽的製備方法，其特徵在於①將芒果苷與鹼性鈉(鉀)鹽反應製備成芒果苷單鈉(鉀)鹽；②將芒果苷單鈉(鉀)鹽與小檗鹼反應生成芒果苷小檗鹼鹽。
5.根據權利要求4所述的芒果苷小檗鹼鹽的製備方法，其特徵在於所述芒果苷與 鹼性鈉(鉀)鹽的摩爾配比為1 0.5-1 ；所述芒果苷單鈉(鉀)鹽與小檗鹼摩爾配比為1 1.
6.根據權利要求4所述的芒果苷小檗鹼鹽的製備方法，其特徵在於所述鹼性鈉(鉀) 鹽可以選自碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、醋酸鈉、醋酸鉀中的一種或兩種以上的混 合物；所述小檗鹼也可以是鹽酸小檗鹼、硫酸小檗鹼、鞣酸小檗鹼或小檗鹼其他醫學上可接 受的鹽，優選小檗鹼、鹽酸小檗鹼、硫酸小檗鹼。
7.權利要求1-3所述的芒果苷小檗鹼鹽在製備AMPK激活劑的應用。
8.根據權利要求7所述的芒果苷小檗鹼鹽在製備AMPK激活劑中的應用，其特徵在於 所述AMPK激活劑可用於預防或治療下述疾病中的任何一種或幾種糖尿病、糖尿病各種慢 性併發症(包括冠心病、動脈粥樣硬化、腦血管病等大血管病變；糖尿病腎病、糖尿病性視 網膜病變等微血管病變；神經病變；糖尿病足；黃斑病、白內障、青光眼、屈光改變、虹膜睫 狀體病變等眼的其他病變等)、肥胖、高脂血症、胰島素抵抗、高胰島素血症、X症候群、心 肌肥大、心律失常、動脈粥樣硬化、缺血性心臟病、心力衰竭、高血壓、上呼吸道感染、慢性支 氣管炎、慢性阻塞性肺病、哮喘、肺纖維化、肝炎、脂肪肝、酒精肝、肝纖維化、肝硬化、前列腺 炎、胰腺炎、腎炎、腎病症候群、慢性腎功能不全、風溼性關節炎、類風溼性關節炎、骨性關節 炎、炎症性腸病、阿爾茨海默氏病、記憶障礙、梗塞性痴呆、帕金森氏症、腫瘤(包括腫瘤放 療、化療不敏感；腫瘤放療、化療產生的毒性反應)、運動替代。
9.一種藥物，其特徵在於所述藥物由權利要求1所述的芒果苷小檗鹼鹽與可藥用輔 料組成。
10.權利要求9所述的藥物，其特徵在於所述藥物可以製成臨床適用的各種劑型，具 體為片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、顆粒劑、丸劑、糖漿劑、口服溶液劑、口服混懸劑、凝膠劑、凍 乾粉針。
全文摘要
本發明提供了一種芒果苷小檗鹼鹽及其製備方法。另外亦提供該芒果苷小檗鹼鹽用作AMPK激活劑的用途。
文檔編號C07D455/03GK101921270SQ20091004033
公開日2010年12月22日 申請日期2009年6月16日 優先權日2009年6月16日
發明者吳巍, 滕厚雷 申請人:海南德澤藥物研究有限公司