一種改良型的同型半胱氨酸試劑盒及其檢測方法與流程

2023-06-22 20:05:56 2

本發明涉及一種改良的同型半胱氨酸試劑盒及其檢測方法，屬於臨床體外檢測
技術領域：
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背景技術：
：同型半胱氨酸（c4h9no2s）是蛋氨酸去甲基後形成的一種含硫胺基酸，屬於蛋氨酸循環的中間產物，血漿同型半胱氨酸是一個總稱，包括還原型同型半胱氨酸，雙硫同型半胱氨酸，混合雙硫半胱氨酸和混合雙硫蛋白質，正常情況下游離同型半胱氨酸較少，主要以蛋白質形式存在。相關臨床資料顯示同型半胱氨酸是冠心病的一個新的獨立危險因素，可作為心腦血管病、腎臟病、老年痴呆與帕金森症、妊娠合併症、先兆子癇與不良事件的預測指標，是近年來醫學研究的新熱點。同型半胱氨酸的檢測方法很多，主要有：1.同位素檢測法，該法靈敏度高，特異性強，由於操作繁瑣且有放射汙染，雖經改良也未能推廣使用；2.氣相色譜一質譜測定t-同型半胱氨酸色譜檢測法，該方法測定精度和分析速度能用於大量樣本分析，但是成本較高；3.免疫學法和酶法，這兩種方法具有方法簡單、準確度與精密度高的優點，相對於免疫學法，酶法成本更低，使用更方便，能結合全自動生化分析儀，隨著目前酶法試劑中酶類提純水平的提高，該法檢測試劑的成本進一步降低，而酶法檢測血清同型半胱氨酸又分為兩種方法，一種是使用s-腺苷同型半胱氨酸水解酶，因此叫水解酶法，而另一種是使用胱硫醚β合成酶(cbs)，也叫胱硫醚法，前者成本較高，而後者酶成本較低，更利於推廣，其檢測原理為同型半胱氨酸（氧化形式）被還原成游離的同型半胱氨酸，在胱硫醚β合成酶(cbs)的催化下和絲氨酸反應生成l-胱硫醚，l-胱硫醚被胱硫醚β裂解酶分解成間型半胱氨酸和丙酮酸，丙酮酸參與煙醯胺腺嘌呤二核苷酸的顯色反應，生成的同型半胱氨酸再次參與第一步反應，如此循環進行。但是由於胱硫醚循環酶法檢測血清同型半胱氨酸需要加入煙醯胺腺嘌呤二核苷酸、胱硫醚β合成酶、胱硫醚β裂解酶等酶或者輔酶，這些酶類在液態的情況下容易衰減，尤其是在溫度偏高的環境下，非常容易衰減，因此市面上多為凍乾粉的試劑，這給臨床使用帶來了很大的不便。針對這一情況，本發明提供一種血清同型半胱氨酸試劑盒及其檢測方法，本品在試劑中加入一套另外的緩衝體系，以保證試劑開口穩定性能30天測試同型半胱氨酸濃度值的精度在1%以內。本品具有靈敏度高，準確度高，特異性強，穩定性好等優點。技術實現要素：針對現有技術存在的不足，本發明所要解決的技術問題是，提供一種血清同型半胱氨酸試劑盒及其檢測方法，本品在試劑中加入一套另外的緩衝體系，以保證試劑開口穩定性能30天測試同型半胱氨酸濃度值的精度在1%以內。為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案是，提供一種血清同型半胱氨酸試劑盒，它包括r1與r2試劑，其中r1的組成為：緩衝液（三羥甲基氨基甲烷，ph8～9）：200mmol/l，穩定緩衝體系（或帶有磷酸根離子，或帶有硼酸根離子）：100mmol/l，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）0.45mmol/l，乳酸脫氫酶（ldh）：5ku/l，三(2-羧乙基)膦（tcep）：3mmol/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：10-20g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.1-0.2%，防腐劑（疊氮鈉或者pc300）：1g/lr2的組成為：緩衝液（三羥甲基氨基甲烷，ph7～8）：100mmol/l，胱硫醚-β-合成酶（cbs）：3ku/l，胱硫醚-β-裂解酶（cbl）：2ku/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：10-20g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.1-0.2%，防腐劑（疊氮鈉或者pc300）：1g/l。同型半胱氨酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：第一步，預備：提供標準液、血清同型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑以及待測標本；其中，標準液採用健康人血清為基質；用健康人血清混合，反覆凍融數次至上層澄清，取澄清的上層液經0.15um～0.30um濾膜的過濾器過濾後，添加0.05%～0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用；第二步，初步混勻：取13ul待測標本和r1試劑240～280ul混勻，置30-45℃孵育3～5分鐘；第三步，二次混勻：取r2試劑40～70ul與上述混合液混勻，孵育180～240秒後，空白管調零，讀取吸光度a1，90秒後讀吸光度a2，其中△a標準=a2-a1，測區吸光度的主波長300～400nm，副波長400～500nm；同樣的步驟測量待測試樣的a1測定、a2測定，得到△a測定=a2測定-a1測定；標準濃度為標準液中血清同型半胱氨酸的濃度；血清：同型半胱氨酸測定試劑盒r1：r2試劑與待測標本的比例=240～280ul：40～70ul：13；第四步，計算得出血清同型半胱氨酸濃度：血清同型半胱氨酸(mmol/l)=△a測定×標準濃度／△a標準。本發明的血清同型半胱氨酸試劑盒檢測血清同型半胱氨酸的檢測方法，能有效提高減少非特異性還原物質的幹擾，消除標準液的基質效應和脂濁現象，具有廣泛的市場前景。本發明的血清同型半胱氨酸試劑盒檢測血清同型半胱氨酸的檢測方法還提供了一種人血清基質標準液的製備方法，解決了基質效應問題，提高檢測的準確度。具體實施方式實施例l本實施例的血清同型半胱氨酸試劑盒，它包括r1與r2試劑，r1和r2均以水為溶劑；r1緩衝液（三羥甲基氨基甲烷，ph8～9）：200mmol/l，穩定緩衝體系（或帶有磷酸根離子，或帶有硼酸根離子）：100mmol/l，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）0.45mmol/l，乳酸脫氫酶（ldh）：5ku/l，三(2-羧乙基)膦（tcep）：3mmol/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：10g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.1%，防腐劑（疊氮鈉或者pc300）：1g/lr2緩衝液（三羥甲基氨基甲烷，ph7～8）：100mmol/l，胱硫醚-β-合成酶（cbs）：3ku/l，胱硫醚-β-裂解酶（cbl）：2ku/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：10g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.1%，防腐劑（疊氮鈉或者pc300）：1g/l本實施例的血清同型半胱氨酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：第一步，預備：提供標準液、血清同型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑以及待測標本；血清同型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑與待測標本的比例為240:40:13其中，標準液採用健康人血清為基質；所述標準液的製備方法為：用健康人血清混合，反覆凍融數次至上層澄清，取澄清的上層液經0.15um濾膜的過濾器過濾後，添加0.05%生物防腐劑，混勻，待用。用做標準液的基質，經二級或一級參考品和參考測量方法量值溯源定值；第二步，初步混勻：取13ul待測標本和r1試劑240ul混勻，置30-45℃孵育3分鐘；第三步，二次混勻：取r2試劑40ul與上述混合液混勻，孵育210秒後，空白管調零，讀取吸光度a1，90秒後讀吸光度a2，其中，測區吸光度的主波長340nm，副波長410nm；△a=a2-a1；第四步，計算：根據如下公式計算得出血清同型半胱氨酸濃度：血清同型半胱氨酸(mmol/l)=△a測定×標準濃度／△a標準。實施例2本實施例的血清同型半胱氨酸試劑盒，它包括r1與r2試劑，r1和r2均以水為溶劑；r1緩衝液（三羥甲基氨基甲烷，ph8～9）：200mmol/l，穩定緩衝體系（或帶有磷酸根離子，或帶有硼酸根離子）：100mmol/l，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）0.45mmol/l，乳酸脫氫酶（ldh）：5ku/l，三(2-羧乙基)膦（tcep）：3mmol/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：15g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.12%，防腐劑（疊氮鈉或者pc300）：1g/lr2緩衝液（三羥甲基氨基甲烷，ph8～9）：100mmol/l，胱硫醚-β-合成酶（cbs）：3ku/l，胱硫醚-β-裂解酶（cbl）：2ku/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：15g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.12%，防腐劑（疊氮鈉或者pc300）：1g/l本實施例的血清同型半胱氨酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：第一步，預備：提供標準液、血清同型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑以及待測標本；血清同型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑與待測標本的比例為250:50:13；其中，標準液採用健康人血清為基質；所述標準液的製備方法為：用健康人血清混合，反覆凍融數次至上層澄清，取澄清的上層液經0.30um濾膜的過濾器過濾後，添加0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用。用做標準液的基質，經二級或一級參考品和參考測量方法量值溯源定值；第二步，初步混勻：取13ul待測標本和r1試劑250ul混勻，置30-45℃孵育5分鐘；第三步，二次混勻：取r2試劑50ul與上述混合液混勻，孵育240秒後，空白管調零，讀取吸光度a1，90秒後讀吸光度a2，其中，測區吸光度的主波長300nm，副波長400nm；△a=a2-a1；第四步，計算：根據如下公式計算得出血清同型半胱氨酸濃度：血清同型半胱氨酸(mmol/l)=△a測定×標準濃度／△a標準。實施例3本實施例的血清同型半胱氨酸試劑盒，它包括r1與r2試劑，r1和r2均以水為溶劑；r1緩衝液（三羥甲基氨基甲烷，ph8～9）：200mmol/l，穩定緩衝體系（或帶有磷酸根離子，或帶有硼酸根離子）：100mmol/l，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）0.45mmol/l，乳酸脫氫酶（ldh）：5ku/l，三(2-羧乙基)膦（tcep）：3mmol/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：18/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.18%，防腐劑：1g/lr2緩衝液三羥甲基氨基甲烷，ph8～9）：100mmol/l，胱硫醚-β-合成酶（cbs）：3ku/l，胱硫醚-β-裂解酶（cbl）：2ku/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：18g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.18%，防腐劑：1g/l本實施例的血清同型半胱氨酸誡劑盒的檢測方法，包括如下步驟：第一步，預備：提供標準液、血清同型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑以及待測標本；血清同型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑與待測標本的比例為260:60:13其中，標準液採用健康人血清為基質；所述標準液的製備方法為：用健康人血清混合，反覆凍融數次至上層澄清，取澄清的上層液經0.20um濾膜的過濾器過濾後，添加0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用。用做標準液的基質，經二級或一級參考品和參考測量方法量值溯源定值；第二步，初步混勻：取13ul待測標本和r1試劑260ul混勻，置30-45℃孵育5分鐘；第三步，二次混勻：取r2試劑60ul與上述混合液混勻，孵育180秒後，空白管調零，讀取吸光度a1，90秒後讀吸光度a2，其中，測區吸光度的主波長380nm，副波長450nm；△a=a2-a1；第四步，計算：根據如下公式計算得出血清同型半胱氨酸濃度：血清同型半胱氨酸(mmol/l)=△a測定×標準濃度／△a標準。實施例4本實施例的血清同型半胱氨酸試劑盒，它包括r1與r2試劑，r1和r2均以水為溶劑；r1緩衝液三羥甲基氨基甲烷，ph8～9）：200mmol/l，穩定緩衝體系（或帶有磷酸根離子，或帶有硼酸根離子）：100mmol/l，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸（nadh）0.45mmol/l，乳酸脫氫酶（ldh）：5ku/l，三(2-羧乙基)膦（tcep）：3mmol/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：20g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.2%，防腐劑（疊氮鈉或者pc300）：1g/lr2緩衝液（三羥甲基氨基甲烷，ph8～9）：100mmol/l，胱硫醚-β-合成酶（cbs）：3ku/l，胱硫醚-β-裂解酶（cbl）：2ku/l，保護劑（甘露醇、甘油、葡萄糖中的一種或組合）：20g/l，表面活性劑（吐溫20或者吐溫80）：0.2%，防腐劑（疊氮鈉或者pc300）：1g/l本實施例的血清同型半胱氨酸試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：第一步，預備：提供標準液、血清型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑以及待測標本；血清型半胱氨酸測定試劑盒r1與r2試劑與待測標本的比例為13:275:70其中，標準液採用健康人血清為基質；所述標準液的製備方法為：用健康人血清混合，反覆凍融數次至上層澄清，取澄清的上層液經0.25um濾膜的過濾器過濾後，添加0.lwt%生物防腐劑，混勻，待用。用做標準液的基質，經二級甚至一級參考品和參考測量方法量值溯源定值；第二步，初步混勻：取13ul待測標本和r1試劑275ul混勻，置30-45℃孵育4貧鍾；第三步，二次混勻：取r2試劑70ul與上述混合液混勻，孵育200秒後，空白管調零，讀取吸光度a1，90秒後讀吸光度a2，其中，測區吸光度的主波長375nm，副波長480nm；△a=a2-a1；第四步，計算：根據如下公式計算得出血清型半胱氨酸濃度：血清型半胱氨酸(mmol/l)=△a測定×標準濃度／△a標準。根據上述實施例1-4的技術方案得到的實驗測試結果：1．本發明血清中型半胱氨酸測定方法達到的幾項技術指標：a．測定參考值範圍：健康人血清及血漿中的hcy濃度隨著年齡、性別、地理區域以及遺傳因素的不同而不同。科學文獻報導，成年男性及女性在5到15μmol/l之間，男性比女性值高，絕經後婦女比絕經前婦女的hcy濃度高。老年人（>60歲）是5-20μmol/l；b．線性範圍：2-46μmol/lc．精密度．n=30批內=0.12cv=o.g%批間=0.123cv=0.9%d．準確度相對偏差≤±1%2．r1試劑在保存條件下的穩定性將r1試劑分別置於24～26℃、2～8℃環境下，一年後複測以下指標：表1：r1試劑在不同貯存條件下的穩定性新鮮24～26℃一年2～8℃一年空白吸光度0.00000.00010.0003r1中的乳酸脫氫酶酶活性100%100%98%乳酸脫氫酶為該試劑盒中最不穩定的物質，現以最初酶活性100%為基準。從表l得出結論：試劑r1和r2貯存一年相對穩定；3．測定試劑盒最大線性範圍、定標的k因數和高、中、低三個水平質控血清的穩定性（上述三方面為行業內評價試劑盒穩定性的指標）：表2：試劑盒穩定性測試結果測試數據如下（30天）：第1天14第2天14.1第3天14.02第4天13.99第5天13.98第6天13.9第7天14第8天14第9天14第10天14.1第11天14.2第12天14.3第13天14第14天14第15天14第16天14第17天13.9第18天13.8第19天14第20天14第21天14.2第22天14第23天14第24天13.9第25天14第26天14.09第27天14第28天14.2第29天14第30天14.0230天測試平均值為14.02，標準差為0.0988，變異係數為0.7047%。測試結果穩定；4．與朗道測定法的相關性：本試劑與朗道測定法比較，用二法同測樣品100份，得相關係數r=0.991，線性擬合y=o.9805x-o.0016，二法相關良好。以上所述，僅是對本發明的較佳實施例而己，並非是對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是，凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬於本發明的保護範圍。當前第1頁12