用於生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器的製造方法
2023-06-22 09:51:41
用於生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器的製造方法
【專利摘要】本發明公開了用於具有高靈敏度的生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器，通過反應氧化還原酶、含金屬配合物和萘酚綠B，所述試劑組合物能夠改善分析物(例如葡萄糖)的分析線性，並且由於可以檢測少量分析物的濃度，其能夠使測量血糖所需的血液儘可能少。所述用於生物傳感器的試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質，所述至少兩種電子傳遞介質包括萘酚綠B。
【專利說明】用於生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求於2013年7月2日提交的韓國專利申請N0.10-2013-0077335的優先權,其公開內容通過引用整體併入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及用於具有高靈敏度的生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器，其中所述試劑組合物能夠改善分析物(例如葡萄糖)的分析線性、檢測少量分析物的濃度以及使測量血糖所需的血液儘可能少。
【背景技術】
[0004]本發明涉及用於生物傳感器的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器，並且特別地涉及用於對生物樣品中的特定成分進行定量的試劑組合物及包含所述試劑組合物的生物傳感器。
[0005]最近，隨著糖尿病患者數量的增加，為了診斷和預防糖尿病，定期測量血糖量的必要性一直在增加。已知這樣的糖尿病是重要的健康風險因素。通常，美國糖尿病協會(American Diabetes Associat1n,ADA)推薦大多數胰島素依賴性糖尿病患者每天檢查血糖三次或更多。胰島素控制血糖的利用並預防高血糖症，在未對糖尿病進行治療時，高血糖症可導致酮病。但是，胰島素治療的不恰當管理(management)可導致低血糖症。由於低血糖症可導致昏迷，所以其對於患者而言可能是致命的。
[0006]此外，當患者長期患有糖尿病時，可導致併發症，例如心臟病、動脈粥樣硬化、失明、中風、高血壓和腎衰竭。由於胰島素注射量與血糖的量相關，所以精確檢測血糖對於適當地治療糖尿病是必要的。
[0007]因此，生產了多種血糖儀以使得可以使用可攜式儀器容易地測量血糖。通常，在血糖儀中，每位使用者使用條型生物傳感器(strip-type b1sensor)。這樣的生物傳感器的操作原理基於光學方法或電化學方法。
[0008]在這些方法中，電化學方法的最大特徵是使用電子傳遞介質(electron transfermediator)。作為電子傳遞介質，可以使用:二茂鐵、二茂鐵的衍生物；醌、醌的衍生物；含過渡金屬的有機物質和無機物質(例如，六胺合釕、含鋨聚合物和鐵氰化鉀)；以及電子傳遞有機物質，例如有機導電鹽和紫羅鹼(v1logen)。
[0009]使用電化學方法測量血糖的原理如下。首先，由於葡萄糖氧化酶的催化作用，血糖氧化成葡萄糖酸鹽。同時，作為葡萄糖氧化酶的活性位點的FAD被還原成FADH2。然後，經還原的FADH2通過與電子傳遞介質的氧化還原反應被氧化成FAD,而電子傳遞介質被還原。由以這種方式形成的還原態電子傳遞介質產生的電子分散到電極表面。此時，通過測量由還原態電子傳遞介質的氧化電勢施加於工作電極表面產生的電流來測量血糖濃度。
[0010]與採用常規光學方法的生物傳感器不同，採用上述測量原理的電化學生物傳感器可降低氧的影響，並且即使在樣品渾濁時也可使用樣品而無需分離預處理。
[0011]此外，一般的電化學生物傳感器製作成使得採用諸如絲網印刷(screenprinting)的方法在電絕緣基板上形成包括多個電極的電極系統，並且在所形成的電極系統上形成由親水聚合物、氧化還原酶和電子受體形成的酶反應層。當包含底物的樣品溶液滴在電化學生物傳感器的酶反應層上時，酶反應層溶解，底物與酶反應，底物被氧化，從而電子受體被還原。在酶反應完成後，可以由通過對還原的電子受體進行電化學氧化而獲得的氧化電流來獲得樣品溶液中底物的濃度。
[0012]當使用這樣的生物傳感器時，使用少量樣品精確快速地獲得測量值對於最大限度方便使用者是非常重要的問題。大多數用於測量血糖的產品使用採集血樣然後用生物傳感器量化血液中的血糖的方法。但是，由於採集血樣對於患者來說是相當疼痛的操作，所以有必要使測量所必需的血液量儘可能少以減輕患者的疼痛。特別地，當使用I μ L或更少量的樣品、優選地使用0.5 μ L或更少量的樣品、更優選0.3 μ L或更少量的樣品時，由於可以從替代部位(例如前臂)採集血樣和進行測量，所以可以使在患者測量血糖時導致的疼痛儘可能小。因此，生物傳感器需要使測量血糖所必需的血液量儘可能少。
[0013]此外，該生物傳感器的另一個問題是測量的靈敏度隨小型化而降低。固定至電極表面的反應相關物質的量是影響生物傳感器的靈敏度的主要因素之一。但是，最近，隨著生物傳感器的逐漸小型化，與特定物質反應的物質可固定的面積也隨之減小。因此，嚴重限制了具有高靈敏度的緊湊型傳感器的開發。
【發明內容】
[0014]鑑於上述問題，本發明提供了用於具有高靈敏度的生物傳感器的試劑組合物，其能夠改善分析物(例如葡萄糖)的分析線性，並且使測量分析物(例如葡萄糖)所必需的血液儘可能少。
[0015]本發明還提供了生物傳感器，其使用所述試劑組合物，並且能夠以工業和經濟上可用的方式測量分析物例如葡萄糖。
[0016]通過描述示例性實施例的以下描述，本發明的上述和其他目的和效果將變得明顯。
[0017]根據本發明的一個方面，提供了用於生物傳感器的試劑組合物，其中所述試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質，其中所述至少兩種電子傳遞介質包括萘酚綠B(Naphthol Green B)。這裡,所述電子傳遞介質還可包括含金屬配合物。
[0018]優選地，所述含金屬配合物可以是釕配合物或鐵氰化物配合物。
[0019]優選地，所述釕配合物可以是選自以下的至少一種:Ru(NH3)6C13、[Ru(2，2'，2"-三聯吡啶)(1，10-菲咯啉)(OH2) ]2+、反式-[Ru (2，2' _ 聯吡啶)2 (OH2) (OH) ]2+、[(2，
2,-聯吡啶)2 (OH) RuORu (OH) (2，2' bpy) 2]4+ 和[Ru (4，4'-聯吡啶)(NH3) 5]2+。
[0020]這裡，相對於100重量份的緩衝液，可以使用等於或大於0.1重量份並且等於或小於20重量份的萘酚綠B。
[0021]這裡，所述酶可以是氧化還原酶、脫氫酶、轉移酶或水解酶中的任何酶。
[0022]優選地，所述氧化還原酶可以是選自以下的至少一種:黃素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶(flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)、煙酸胺腺嘌呤二核苷酸 _ 葡萄糖脫氫酶(nicotinamide adenine dinuc leoti de-glucose dehyrogenase)、批咯並喹啉醌葡萄糖脫氫酶(pyrroloquinoline quinine glucose dehydrogenase)、穀氨酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶和膽紅素氧化酶。
[0023]優選地，所述試劑組合物還可包含表面活性劑、水溶性聚合物、脂肪酸、季銨鹽和酶穩定劑中的至少一種。
[0024]更優選地，所述表面活性劑可以是非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和天然表面活性劑中的至少一種。
[0025]更優選地，所述水溶性聚合物可以是聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、全氟磺酸、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、羧甲基纖維素(CMC)、醋酸纖維素和聚醯胺中的至少一種。
[0026]這裡，所述試劑組合物可以是用於葡萄糖生物傳感器的試劑組合物。
[0027]根據本發明的另一個方面，提供了用於測量樣品中的分析物的生物傳感器。所述生物傳感器包括:下基板，所述下基板在其表面上包含至少一個電極，所述電極上施加有與所述分析物反應的試劑組合物；形成在所述下基板上的分隔件(spacer)，所述分隔件在面向所述電極的表面上包含樣品注入單元，以使得將樣品吸入並引入到電極的位置；和設置在所述分隔件上的上基板，其中所述試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質，所述至少兩種電子傳遞介質包括萘酚綠B。
[0028]優選地，所述電子傳遞介質還可包括含金屬配合物。
[0029]優選地，所述酶可以是氧化還原酶、脫氫酶、轉移酶或水解酶中的任何酶。
[0030]優選地，所述含金屬配合物可以是釕配合物或鐵氰化物配合物。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]通過參照附圖詳細描述其示例性實施方案，本發明的上述和其他目的、特徵和優點對於本領域技術人員而言將變得更明顯。
[0032]圖1是根據本發明實施方案的生物傳感器的分解透視圖；
[0033]圖2是根據本發明的比較例I至3的葡萄糖測量電流變化曲線圖；
[0034]圖3是根據本發明的比較例4至6的葡萄糖測量電流變化曲線圖；以及
[0035]圖4是根據本發明的實施例1至4的葡萄糖測量電流變化曲線圖。
【具體實施方式】
[0036]在下文中，將參照本發明的實施例和附圖詳細描述本發明。這些實施例僅示例性地提供以更具體地描述本發明，對於本領域技術人員而言明顯的是，本發明的範圍不限於這些實施例。
[0037]根據本發明的一個方面，所述用於生物傳感器的組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質，所述至少兩種電子傳遞介質包括萘酚綠B。
[0038]充當電子傳遞介質的萘酚綠B是萘酚綠Y的鈉鹽，其具有良好的溶解性、在工業上廉價並且在多個領域中用作染料。
[0039]另外，所述電子傳遞介質包括含金屬配合物。
[0040]這裡，可使用可通過與酶反應被氧化或還原的物質作為含金屬配合物，例如鐵氰化物配合物、鐵氰化鉀、釕配合物、六胺氯化釕(hexaammineruthenium chloride)、二茂鐵及其衍生物、醌及其衍生物、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate)及其衍生物、對苯醌及其衍生物、2,6- 二氯靛酹(2,6-dichlorophenolindophenol)、亞甲基藍、硝基四氮唑藍和鋨配合物。其中，優選使用釕配合物或鐵氰化物配合物作為含金屬配合物，更優選地，可使用六胺氯化釕和鐵氰化鉀，最優選地，可使用六胺氯化釕。
[0041]本發明的釕配合物可以是選自以下的釕配合物:仙(見13)6(:13、[仙(2，2'，2"-三聯吡啶)(1，10-菲咯啉)(OH2) ]2+、反式-[Ru (2，2'-聯吡啶)2 (OH2) (OH)]2+、[(2，2'-聯吡啶)2 (OH) RuORu (OH) (2，2' bpy) 2]4+和[Ru (4，V _ 聯吡啶)(NH3) 5]2+。最優選的釕配合物是六胺氯化釕，其具有以下性質:氧化-還原狀態在水溶液中穩定並且可逆；經還原的電子傳遞介質不與氧反應；經還原的電子傳遞介質的氧化對PH不敏感；並且幾乎不與電化學幹擾物質(例如乙醯氨基酚(acetaminophene)、抗壞血酸、膽紅素、多巴胺、尿酸和龍膽酸)反應。
[0042]此外，可使用氧化還原酶以及多種水解酶和轉移酶作為所述酶，例如葡萄糖脫氫酶、穀氨酸草醯乙酸轉氨酶(GOT)和穀氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)。
[0043]所述氧化還原酶是選自以下的任何酶:黃素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶、吡咯並喹啉醌葡萄糖脫氫酶、穀氨酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶和膽紅素氧化酶。因此，當選擇氧化還原酶之一、選擇與其反應的樣品分析物並製備試劑組合物時，可提供用於檢測葡萄糖、膽固醇、乳酸(lactate)、穀氨酸(glutamate)和醇中的任意一種的生物傳感器。
[0044]如下文將描述的，可以看到，在本發明同時使用六胺氯化釕和萘酚綠B的實施例中，葡萄糖檢測性能顯著提高。
[0045]可通過樣品或待使用的氧化還原酶適當地確定電子傳遞介質。另外，可將包括萘酚綠B的兩種或更多種電子傳遞介質組合併使用。
[0046]電子傳遞介質的含量沒有特別的限制，而是可通過樣品的添加量等來適當地調節。優選地，電子傳遞介質被優選地製備成緩衝液，例如甘氨酸。
[0047]同時，以下反應式表示使用氧化還原酶和電子傳遞介質的電化學傳感器的測量原理。
[0048][反應式]
[0049]分析物+酶(氧化態)+電子傳遞介質(氧化態)=== > 反應所得物質+酶(氧化態)+電子傳遞介質(還原態)
[0050]在該反應式中，通過與樣品中的分析物反應而產生的還原態電子傳遞介質與樣品中分析物的濃度成正比。使用該比例，基於參考電極或輔助電極，向工作電極施加恆定電壓以使還原態的電子傳遞介質氧化。測量此時產生的氧化電流水平以量化樣品中的分析物。
[0051]如上所述，酶與多種待測量代謝物反應並被還原。然後，經還原的酶與電子傳遞介質反應並量化代謝物。
[0052]此外，根據本發明的方面，用於生物傳感器的試劑組合物還可包含表面活性劑、水溶性聚合物、脂肪酸、季銨鹽和酶穩定劑中的至少一種。
[0053]通過包含表面活性劑，顯著抑制和阻止了氧化還原酶固定至電極。因此，由於在電極附近的氧化還原酶，可提高從氧化型電子載體到還原型電子載體的轉化效率。換言之，可進一步增加與樣品溶液中底物濃度的相關性。可選擇性調節表面活性劑的量和形式以避免對酶的變性作用。
[0054]表面活性劑沒有特別的限制，只要不降低本發明的酶活性即可。例如，可適當地選擇和使用非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和天然表面活性劑中的至少一種。這些表面活性劑可單獨使用或以其混合物使用。一種優選的表面活性劑是聚氧乙烯醚。更優選地，可購買和使用叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(商標:Triton X-100)。相對於100重量份的緩衝液，試劑混合物中Triton X-100的濃度優選為0.01重量份至2重量份。
[0055]此外，添加劑中的水溶性聚合物是試劑組合物的聚合物支架，其穩定和分散酶。作為水溶性聚合物，可使用聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、全氟磺酸、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、羧甲基纖維素(CMC)、醋酸纖維素和聚醯胺中的至少一種。
[0056]儘管本說明書以示例描述了所述生物傳感器用於測量血糖以便於描述，但是與血糖測試應用類似，可以通過引入適於特定酶的電子傳遞介質，採用相同的方法來量化多種代謝物的濃度，例如，生物樣品，例如膽固醇、乳酸、肌酸酐、蛋白質、過氧化氫、醇、胺基酸；和酶，例如穀氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)和穀氨酸草醯乙酸轉氨酶(G0T)，以及環境樣品、農業和工業樣品或食物樣品中的多種有機物質或無機物質。
[0057]因此，應理解，通過改變本說明書中所述試劑組合物中包含的酶的種類，本發明可用於量化多種代謝物。例如，可使用血糖氧化酶、乳酸氧化酶、膽固醇氧化酶、穀氨酸氧化酶、辣根過氧化物酶、醇氧化酶等來量化膽固醇、乳酸、穀氨酸、過氧化氫和醇。優選使用選自以下的氧化酶:葡萄糖氧化酶(GOx)、葡萄糖脫氫酶(GDH)、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶、膽紅素氧化酶和葡萄糖脫氫酶。
[0058]接下來，將參照圖1詳細描述生物傳感器的一個實施方案，圖1為根據本發明的另一個方面的生物傳感器的分解透視圖。
[0059]根據本發明的另一個方面的生物傳感器可應用於常規的已知傳感器，例如甘油三酯傳感器和膽固醇傳感器。包含根據本發明的試劑組合物的生物傳感器主要由下基板100、分隔件200和上基板300構成。
[0060]下基板100是絕緣基板，其中在表面上設置有電極21至23中的至少一個，與樣品中的分析物反應的上述試劑組合物施加在所述電極上。
[0061]分隔件200形成在下基板100上，並且可接合在下基板100與上基板300之間。可在面向電極的側表面進一步設置樣品注入單元30，以使得將分析物樣品吸入並引入下基板100的電極21至23。
[0062]上基板300是絕緣基板，其面向下基板100，設置在分隔件200上，並且還包括空氣排放單元40，該空氣排放單元40配置為排放通過樣品注入單元30與分析物樣品一起吸入的空氣。
[0063]在這種情況下，為了提高樣品的吸入速率，空氣排放單元40可在與樣品注入單元30分開的層中形成為通道形狀。特別地，空氣排放單元40可優選地具有在垂直於樣品吸入方向的方向上形成的半圓柱形形狀。
[0064]更特別地，下基板100可使用由絕緣材料(例如聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚醯亞胺、丙烯酸樹脂、聚酯、PVC或聚碳酸酯)製成的薄板。下基板100可使用厚度為50至400 μ m的絕緣材料，更優選地，厚度為100至300 μ m的絕緣材料。
[0065]在下基板100的頂部形成與測量裝置(未示出)和電極系統20接觸的引線24至26，在所述電極系統20中印刷有與所述引線相連並且配置為檢測在吸入樣品中流動的電信號的電極21至23。這裡，所述電極可包括工作電極23、參考電極22和檢查電極21。引線24至26可通過諸如一般的絲網印刷的方法形成。此外，電極21至23可使用導電碳墨(碳膏)通過絲網印刷方法形成。
[0066]同時，為了使電極21至23相互絕緣，可用絕緣體(絕緣膏)部分地塗覆除了電極21至23的一些上表面以外的部分以形成絕緣層。可使用非導電絲網印刷墨或絕緣墨作為這樣的絕緣體。
[0067]如上所述，在部分地印刷有絕緣體的部分以外的部分中，電極21至23暴露的上表面塗覆有試劑組合物。所述試劑組合物包含與注入的樣品反應的酶和上述電子傳遞介質(電子受體)。試劑組合物被施加到電極上並固定於此，從而充分覆蓋電極21至23。此外，可將試劑組合物施加到電極21至23中的全部或至少一個電極上或者僅工作電極23上並使用。
[0068]當通過樣品注入單元30將包含分析物的樣品注入試劑組合物中時，樣品中包含的分析物與酶反應，分析物被氧化，並且相應地電子受體被還原。在酶反應完成後，通過與連接至電極21至23的引線24至26接觸的測量裝置(未示出)測量通過對還原的電子受體進行電化學氧化而獲得的氧化電流。因此，可以測量樣品中所含分析物的濃度。
[0069]分隔件200通過樣品注入單元30形成毛細管，所述樣品注入單元30通過接合上基板300與下基板100而形成。這使得能夠快速吸入分析物樣品。
[0070]分隔件200可由雙面帶(double-side tape)製成。由於毛細管現象,待測量樣品通過樣品注入單元30自動注入。由於樣品的引入，樣品注入單元30中的空氣通過形成在上基板300中的空氣排放單元40向外排放。
[0071]同時，根據本發明的電極21至23通過使用以下材料製作:導電聚合物、碳、ITO顆粒、金屬顆粒、石墨和經鉬處理的碳、銀、金、鈀或鉬組分。例如，使用由碳或經鉬處理的碳製備的墨或含鈀墨來將電極21至23印刷在下基板100上。此外，可使用金通過真空沉積在下基板100上形成電極21至23。
[0072]在下文中，將參照實施例和比較例詳細描述本發明的配置和所得效果。但是，提供這些實施例僅用於更具體地描述本發明，而本發明的範圍並不限於這些實施例。
[0073][實施例1]
[0074]試劑組合物的製備
[0075]製備ρΗ6.5的50mM ACES緩衝液(ACES:N- (2-乙醯氨基)_2_氨基乙磺酸)。將
0.6重量份的聚乙二醇放進100重量份的所製備緩衝液中並溶解。然後，相繼添加0.1重量份的表面活性劑叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(商標=Triton X-100)和1.4重量份的酶穩定劑(D_(+)_海藻糖二水合物)並溶解。
[0076]向溶液中相繼添加2.3重量份的六胺氯化釕(Ru(NH3)6Cl3)、0.9重量份的萘酚綠B和0.15重量份的黃素腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脫氫酶(FAD-GDH)並溶解，從而製備試劑組合物。
[0077]生物傳感器的製作
[0078]通過絲網印刷方法使用導電碳膏在聚酯下基板上形成工作電極、參考電極和檢查電極。使用烘箱將這些電極在120°C乾燥20分鐘，然後使用絲網印刷方法施加絕緣膏。
[0079]用Img試劑組合物塗覆工作電極並在烘箱中於40°C乾燥20分鐘。將分隔件附著至經乾燥的下基板。然後覆蓋上基板並壓制。
[0080][實施例2]
[0081]按照實施例1製備試劑組合物。除了萘酚綠B為1.8重量份外，其他組分的濃度相同。
[0082]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0083][實施例3]
[0084]按照實施例1製備試劑組合物。除了萘酚綠B為3.5重量份外，其他組分的濃度相同。
[0085]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0086][實施例4]
[0087]按照實施例1製備試劑組合物。除了萘酚綠B為6.6重量份外，其他組分的濃度相同。
[0088]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0089][比較例I]
[0090]按照實施例1製備試劑組合物。但是，將試劑組合物製備成六胺氯化釕的濃度為
1.5重量份，FAD-GDH為0.15重量份，並且不含萘酚綠B。
[0091]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0092][比較例2]
[0093]按照實施例1製備試劑組合物。但是，將試劑組合物製備成六胺氯化釕的濃度為
3.1重量份，FAD-GDH為0.15重量份，並且不合萘酚綠B。
[0094]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0095][比較例3]
[0096]按照實施例1製備試劑組合物。但是，將試劑組合物製備成六胺氯化釕的濃度為
4.6重量份，FAD-GDH為0.15重量份，並且不含萘酚綠B。
[0097]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0098][比較例4]
[0099]按照實施例1製備試劑組合物。但是，將試劑組合物製備成萘酚綠B的濃度為4.4重量份，FAD-GDH為0.15重量份，並且不含六胺氯化釕。
[0100]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0101][比較例5]
[0102]按照實施例1製備試劑組合物。但是，將試劑組合物製備成萘酚綠B的濃度為8.8重量份，FAD-GDH為0.15重量份，並且不含六胺氯化釕。
[0103]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0104][比較例6]
[0105]按照實施例1製備試劑組合物。但是，將試劑組合物製備成萘酚綠B的濃度為13.2重量份，FAD-GDH為0.15重量份，並且不含六胺氯化釕。
[0106]與實施例1相同地製作生物傳感器。
[0107][實驗實施例]
[0108]使用由實施例和比較例製作的生物傳感器測量葡萄糖標準溶液中的電流。這裡，葡萄糖標準溶液是指這樣的血液，其中由靜脈採集的血液具有42%的血細胞比容並且使用葡萄糖分析儀(製造商:YSI Inc.，型號名稱:YSI2300STAT Plus)具有多種葡萄糖濃度。
[0109]圖2是根據本發明的比較例I至3的葡萄糖測量電流變化曲線圖。在圖2中，Tl表示包含1.5重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的FAD-GDH的比較例I的實驗結果。T2表示包含3.1重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的FAD-GDH的比較例2的實驗結果。T3表示包含4.6重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的FAD-GDH的比較例3的實驗結果。
[0110]使用根據比較例I至3的生物傳感器進行實施例實驗。結果，確定了在試劑組合物中不合萘酚綠B的生物傳感器中，通過葡萄糖濃度測量的電流未逐漸增加並且不能確保線性。
[0111]圖3是根據本發明的比較例4至6的葡萄糖測量電流變化曲線圖。在圖3中，Tl表示包含4.4重量份的萘酚綠B和0.15重量份的FAD-GDH的比較例4的實驗結果。T2表示包含8.8重量份的萘酚綠B和0.15重量份的FAD-GDH的比較例5的實驗結果。T3表示包含13.2重量份的萘酚綠B和0.15重量份的FAD-GDH的比較例6的實驗結果。
[0112]使用根據比較例4至6的生物傳感器進行實施例實驗。結果，確定了在試劑組合物中不含六胺氯化釕的生物傳感器中，通過葡萄糖濃度測量的電流未逐漸增加並且不能確保線性。
[0113]圖4是根據本發明的實施例1至4的葡萄糖測量電流變化曲線圖。在圖4中，Tl表示包含0.9重量份的萘酚綠B、2.3重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的FAD-GDH的實施例I的實驗結果。T2表示包含1.8重量份的萘酚綠B、2.3重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的FAD-GDH的實施例2的實驗結果。T3表示包含3.5重量份的萘酚綠B、2.3重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的FAD-GDH的實施例3的實驗結果。最後，T4表示包含6.6重量份的萘酚綠B、2.3重量份的六胺氯化釕和0.15重量份的FAD-GDH的實施例4的實驗結果。
[0114]使用根據實施例1至4的生物傳感器進行實施例實驗。結果，總體而言，確定了通過葡萄糖濃度測量的電流隨著萘酚綠B濃度的增加而逐漸增加。此外，確定了線性隨著萘酚綠B濃度的增加而改善。特別地，確定了當萘酚綠B濃度為3.5重量份時，表現出最佳線性。
[0115]為了誘導適當的反應，相對於100重量份的緩衝液，根據本發明另一個方面的試劑組合物可優選地使用濃度為等於或大於0.1重量份並且等於或小於20重量份的萘酚綠B，更優選地，使用濃度為等於或大於I重量份並且等於或小於5重量份的萘酚綠B。這是因為濃度為小於5重量份的萘酚綠B可造成來自反應的輸出信號低，因此不利地使得無法確保線性，另一方面，濃度為大於20重量份的萘酚綠B可導致試劑組合物的溶解度劣化，這可造成無法確保線性和再現性。最優選的，相對於100重量份的緩衝液，試劑組合物可使用濃度等於3.5重量份的萘酚綠B。
[0116]同時，在根據本發明實施例的電化學生物傳感器中，可將工作電極、參考電極和檢查電極設置在下基板的平面上。但是，也可將工作電極、參考電極和檢查電極設置在不同表面(例如，上基板)並面向彼此。
[0117]根據本發明，可改善分析物的分析線性，並且由於可檢測少量分析物的濃度，使測量血糖所必需血液儘可能少。
[0118]由於根據本發明的生物傳感器的試劑組合物的萘酚綠B具有良好的溶解性，所以其易於工業化使用，並且也廉價。因此，可提供廉價的生物傳感器，其對於需要每天多次測量血糖的人非常有用。
[0119]但是，本發明的效果不限於上述效果。通過以下描述，本領域技術人員可清楚地理解本發明其他未提到的效果。
[0120]儘管在上文中具體地描述了本發明的詳細實施例，但是對於本領域技術人員明顯的是，可在本發明的範圍內進行多種修改和替代，並且可理解，這樣的修改和替代落在所附權利要求的範圍內。
【權利要求】
1.用於生物傳感器的試劑組合物， 其中所述試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質，其中所述至少兩種電子傳遞介質中包含萘酚綠B。
2.根據權利要求1所述的試劑組合物， 其中所述電子傳遞介質中還包含含金屬配合物。
3.根據權利要求2所述的試劑組合物， 其中所述含金屬配合物是釕配合物或鐵氰化物配合物。
4.根據權利要求3所述的試劑組合物， 其中所述釕配合物是選自以下的至少一種=Ru(NH3)6C13、[Ru(2,2/，2"-三聯吡啶)(I，10-菲咯啉)(OH2) ]2+、反式-[Ru (2，2'-聯吡啶)2 (OH2) (OH) ]2+、[ (2，2' _聯吡啶)2 (OH)RuORu (OH) (2，2' bpy)2]4+和[Ru (4，4'-聯吡啶)(NH3)5]2'
5.根據權利要求1所述的試劑組合物， 其中相對於100重量份的緩衝液，使用等於或大於0.1重量份並且等於或小於20重量份的所述萘酚綠B。
6.根據權利要求1所述的試劑組合物， 其中所述酶是任何以下的酶:氧化還原酶、脫氫酶、轉移酶或水解酶。
7.根據權利要求6所述的試劑組合物， 其中所述氧化還原酶是選自以下的至少一種:黃素腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶、煙醯胺腺嘌呤二核苷酸-葡萄糖脫氫酶、吡咯並喹啉醌葡萄糖脫氫酶、穀氨酸脫氫酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、膽固醇酯酶、乳酸氧化酶、抗壞血酸氧化酶、醇氧化酶、醇脫氫酶和膽紅素氧化酶。
8.根據權利要求1所述的試劑組合物， 其中所述試劑組合物還包含表面活性劑、水溶性聚合物、脂肪酸、季銨鹽和酶穩定劑中的至少一種。
9.根據權利要求8所述的試劑組合物， 其中所述表面活性劑是非離子表面活性劑、兩性表面活性劑、陽離子表面活性劑、陰離子表面活性劑和天然表面活性劑中的至少一種。
10.根據權利要求8所述的試劑組合物， 其中所述水溶性聚合物是聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、全氟磺酸、羥乙基纖維素(HEC)、羥丙基纖維素(HPC)、羧甲基纖維素(CMC)、醋酸纖維素和聚醯胺中的至少一種。
11.根據權利要求1至10中任一項所述的試劑組合物， 其中所述試劑組合物是用於葡萄糖生物傳感器的試劑組合物。
12.一種用於測量樣品中的分析物的生物傳感器，所述生物傳感器包含: 下基板，所述下基板在其表面上包含至少一個電極，所述電極上施加有與所述分析物反應的試劑組合物； 形成在所述下基板上的分隔件，所述分隔件在面向所述電極的表面上包含樣品注入單元，以使得所述樣品被吸入並引入到所述電極的位置；和 設置在所述分隔件上的上基板， 其中所述試劑組合物包含酶和至少兩種電子傳遞介質，其中所述至少兩種電子傳遞介質中包含萘酚綠B。
13.根據權利要求12所述的生物傳感器， 其中所述電子傳遞介質還包含含金屬配合物。
14.根據權利要求12所述的生物傳感器， 其中所述上基板還包含空氣排放單元，所述空氣排放單元配置為排放所述樣品中的空氣。
15.根據權利要求14所述的生物傳感器， 其中所述空氣排放單元具有在垂直於樣品吸入方向的方向上形成的半圓柱形形狀。
16.根據權利要求12所述的生物傳感器， 其中所述酶是任何以下的酶:氧化還原酶、脫氫酶、轉移酶或水解酶。
17.根據權利要求13所述的生物傳感器， 其中所述含金屬配合物是釕配合物或鐵氰化物配合物。
【文檔編號】G01N27/327GK104280431SQ201410312327
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年7月2日 優先權日:2013年7月2日
【發明者】全成一, 鄭成權, 林承珉, 李殷相, 金世澔, 石洪成, 金元東, 高載敏 申請人:因福皮亞有限公司