一種FOXhunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法

2023-06-22 20:29:16

專利名稱：一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法
技術領域：
本發明涉及蒙古柳FOX hunting農桿菌cDNA文庫的構建方法。
背景技術：
利用得到的大量擬南芥FL-cDNA (full-length cDNA)克隆，Ichikawa等人發展了
一種選擇性功能增加方式，系統闡明擬南芥基因功能-被稱為FOX hunting system(全
稱 Full-lengthcDNA Over-expressing gene hunting system)在 2006 年，首先作為一種技術被提出。這種方法通過在轉基因植物中過量表達單個或有限數量的FL-cDNA， 產生大量顯性突變，可以根據新的重要特徵，鑑定基因功能。這種技術的建立有重要的意義，為鑑定基因功能，幾種系統和工具都是產生功能缺失突變而發展起來。目前，擬南芥FOX植株，水稻FOX擬南芥植株和FOX水稻植株都可以用來鑑定和探索植物基因的功能，結合使用這幾種突變植株能更有效地分析基因的功能。因此，利用功能性技術，對植物的全長cDNA就可以進行基因功能分析。而現在，很多植物如大豆、小麥、柑橘和楊樹等植物的全長cDNA克隆被收集。長期以來鹽鹼草源地區生長的鄉土樹種蒙古柳(Salixmongolica)。由於與其它柳樹的居群不同,其生態學特性和表現型存在差異,植物的基因也具有多樣性的特點，蒙古柳是鹽鹼地寶貴的生物基因資源，蒙古柳全長cDNA文庫的研究還未見報導。

發明內容
本發明提供了一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法。本發明的一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法是按照以下步驟進行的一、採用異硫氰酸胍法提取蒙古柳的總RNA，然後採用試劑盒對提取的蒙古柳總RNA反轉錄成總cDNA ；二、將步驟一反轉錄的總cDNA連接到pGEM-T載體上，構建出pGEM_cDNA，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建了 pGEM-cDNA在大腸桿菌JM109中的文庫；三、將步驟二得到的pGEM-cDNA和pBI121載體，採用AsiSI和AscI酶分別進行雙酶切，然後將酶切後的目的片段與酶切後的PBI121載體進行連接，得到植物二元表達載體pBI121::cDNA ；四、將步驟三得到的植物二元表達載體pBI121: :cDNA,轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建出JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫，提取JM109菌株的pBI121: : cDNA 克隆文庫的 DNA ；五、將步驟四得到的JM109菌株的pBI121: : cDNA克隆文庫的DNA通過電擊轉化導入根癌農桿菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX hunting農桿菌cDNA文庫的構建。本發明包含以下有益效果本發明對蒙古柳中抗逆性基因進行研究，篩選出目的基因，利用分子生物學的手段，從基因表達特性及轉基因植物對逆境的應答性進行深入細緻的研究，以期獲得具有耐性的植物材料。本發明作為抗旱、耐鹽鹼基礎理論研究的一部分，將為植物耐性分子育種奠定理論基礎。研究的結果不但可以豐富植物的遺傳、生理方面的理論基礎，同時對沙化土地資源的高效利用、生態環境的建設等方面具有一定的作用。


圖I為具體實施方式
一中提取的蒙古柳嫩芽及根的總RNA的電泳圖；其中，I為根的總RNA的電泳圖，2為葉的總RNA的電泳圖；圖2為具體實施方式
一中蒙古柳嫩芽及根的總RNA反轉錄成總cDNA的PCR鑑定結果電泳圖；其中，I為總cDNA的電泳圖，2為λ DNA用HindIII酶切3小時後的電泳圖；圖3為具體實施方式
一中藍白斑篩選進行檢測結果；圖4為具體實施方式
一中選取白斑進行PCR鑑定電泳結果圖；其中，I為ADNA用HindIII酶切3小時後的電泳圖，2為陰性對照；·圖5為具體實施方式
一中選取白斑進行PCR鑑定電泳結果圖；圖6為具體實施方式
一中ρΒΙ121載體酶切檢測電泳圖；其中，I為λ DNA用HindIII酶切3小時後的電泳圖，2為ρΒΙ121載體酶切後的電泳圖；圖7為具體實施方式
一中蒙古柳cDNA表達載體的構建不意圖；圖8為具體實施方式
一中蒙古柳pBI121: :cDNA載體的JM109克隆文庫的PCR檢測結果電泳圖；其中I為λ DNA用Hind III酶切3小時後的電泳圖，2為陽性對照；圖9為具體實施方式
一中蒙古柳FOX hunting農桿菌cDNA植物表達文庫的PCR檢測結果電泳圖；其中，I為DM2000，2為蒙古柳FOXhunting農桿菌cDNA電泳圖。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式的一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法是按照以下步驟進行的一、採用異硫氰酸胍法提取蒙古柳的總RNA，然後採用試劑盒對提取的蒙古柳總RNA反轉錄成總cDNA ；二、將步驟一反轉錄的總cDNA連接到pGEM-T載體上，構建出pGEM_cDNA，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建了 pGEM-cDNA在大腸桿菌JM109中的文庫；三、將步驟二得到的pGEM-cDNA和pBI121載體，採用AsiSI和AscI酶(購自Fermentas公司)分別進行雙酶切，然後將酶切後的目的片段與酶切後的pBI121載體進行連接，得到植物二元表達載體PBI121: :cDNA ；四、將步驟三得到的植物二元表達載體pBI121: :cDNA,轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建出JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫，提取JM109菌株的pBI121: :cDNA 克隆文庫的 DNA ；五、將步驟四得到的JM109菌株的pBI121: :cDNA克隆文庫的DNA通過電擊轉化導入根癌農桿菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX hunting農桿菌cDNA文庫的構建。
具體是實施方式二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中所述的轉錄的總cDNA連接到pGEM-T載體的連接體系為
權利要求
1.一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法,其特徵在於FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建是按照以下步驟進行的 一、採用異硫氰酸胍法提取蒙古柳的總RNA，然後採用試劑盒對提取的蒙古柳總RNA反轉錄成總cDNA ； 二、將步驟一反轉錄的總cDNA連接到pGEM-T載體上，構建出pGEM_cDNA，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建了 pGEM-cDNA在大腸桿菌JM109中的文庫； 三、將步驟二得到的pGEM-cDNA和pBI121載體，採用AsiSI和AscI酶分別進行雙酶切，然後將酶切後的目的片段與酶切後的PBI121載體進行連接，得到植物二元表達載體pBI121::cDNA ； 四、將步驟三得到的植物二元表達載體PBI121::cDNA，轉化至大腸桿菌JM109感受態細胞中，構建出JM109菌株的pBI121: :cDNA克隆文庫，提取JM109菌株的pBI121: : cDNA克隆文庫的DNA ； 五、將步驟四得到的JM109菌株的pBI121::cDNA克隆文庫的DNA通過電擊轉化導入根癌農桿菌EHA105菌株中，即完成蒙古柳FOX hunting農桿菌cDNA文庫的構建。
2.根據權利要求I所述的一種FOXhunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法，其特徵在於步驟二中所述的轉錄的總cDNA連接到pGEM-T載體的連接體系為成分用量目的基因總cDNA片段10μ pGEM-T載體片段6pL10XT4 DNA Ligaase buffer2uLT4 DNA 連接_2pL 連接反應條件16°C水浴，12 14h。
3.根據權利要求I所述的一種FOXhunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法，其特徵在於步驟三中所述的AsiSI和AscI酶切體系為成分用量pBI121-T-cDNA20μ!_.IOX Buffer3tuL AsiSI1.5(uLAsd1.5『uLddtfcO4liL 反應條件37°C水浴，2 3h。
全文摘要
一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法，它涉及蒙古柳FOX hunting農桿菌cDNA文庫的構建方法。本發明提供了一種FOX hunting蒙古柳農桿菌cDNA文庫的構建方法。構建方法如下提取蒙古柳的總RNA，反轉錄成總cDNA；連接到pGEM-T載體上，轉化JM109感受態細胞中，構建了pGEM-cDNA；將pGEM-cDNA和pBI121載體，雙酶切後連接，得到pBI121::cDNA；再轉化至JM109感受態細胞中，構建出pBI121::cDNA克隆文庫；電擊轉化根癌農桿菌EHA105菌株中，即完成。本發明對沙化土地資源的高效利用、生態環境的建設有一定作用。
文檔編號C40B50/06GK102899726SQ201210447250
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月9日 優先權日2012年11月9日
發明者柳參奎, 南桂仙, 王連勇, 羅秋香, 張欣欣, 管清傑, 馬書榮, 金淑梅, 李瑩, 於聳 申請人:東北林業大學