取代的氮雜卟啉作為螢光標記的製作方法

2023-06-22 08:53:26

專利名稱：取代的氮雜卟啉作為螢光標記的製作方法
技術領域：
本申請涉及螢光照相術，螢光測定方法和螢光探針。
背景技術：
本文引用的出版物及其它參考資料在這裡引入作為參考。以下對本發明背景技術的描述目的在於幫助對本發明進行理解，但是並不等於承認其描述或構成了本發明的現有技術。
卟啉，酞菁及其它氮雜卟啉以及特定的其它含氮的大環芳香烴的近紅外吸收和發射有時候使得這些化合物可用作螢光標記的有前景的候選物。
酞菁，尤其基於它們強烈地近紅外吸收(摩爾消光係數約200,000)它們的高量子產率以及對常見金屬酞青色素退色的抗性，使得人們進行了許多的努力來利用它們作為螢光標記。然而，按此方式的早期研究並沒有產生完全合格的產品，很大程度上是因為酞菁異乎尋常地強烈傾向於相互結合，尤其是通過堆積面對面聚集，以及強烈地結合到各種其它分子表面(非特異性的結合)。
由於分子內堆積未取代的酞菁在有機的和水性的溶劑中具有非常低的溶解度。眾所周知，通過導入電荷基團，諸如磺酸酯可降低堆積的傾向。
而具有這種取代基的酞菁可能在水中以及電解質的水溶液中具有高溶解度，非特異性結合的傾向基本上仍持續。大部分螢光標記的科學意義集中在與生物材料諸如組織切片，細胞，細胞片段，蛋白，包括乙二醇-和脂-蛋白，肽，寡-和聚-糖，寡-和聚-核苷酸以及脂類有關的應用。可能通過目的特異性相互作用的部分屏蔽來幹擾在涉及這些材料的螢光分析中的結合非特異性的傾向。在治療藥物的分析中，可通過將酞菁染料連接到一或多種聚氧烴基，典型地為端甲氧基-聚(乙二醇)，(PEG)的將非特異性的結合以及堆積傾向降低到可忽略的水平。同時，這種基團的連接保持了理想的吸收和發射特性。相同的技術對各種其它的近紅外色素也是有效的。參見，美國專利5,403,928。
對免疫分析相關參數的測定已經取得了顯著的進步。例如，利用描述在Dandliker等，美國專利5,302,349，名稱為″Transient StateLuminescence Assay Apparatus″中的技術(在這裡全文引入作為參考，包括所有的附圖)，可以均一分析的形式實現對結合以及游離形式的組分的濃度進行測定，即不需要對結合的以及游離的形式進行分離。
儘管在螢光標記領域以及數據分析方面取得了顯著的和有希望的改進，但本領域仍需要其他具有必要的優點但也很容易製備並且具有更高化學穩定性的色素。其他人公開的密切相關的現有技術參見美國專利5,135,717，5,346,670和5,494,793。

發明內容
本發明詳細說明並描述了對於某些酞菁可被轉化成用於製備螢光探針的螢光染料的發現和應用。這些可通過提供具有合適的攜帶僅具有幾個原子的軸向配體的金屬原子的酞菁。這些變化大大地消除了分子堆積(面對面聚集)並非特異性結合於其它攜帶相同信號的電荷的分子表面。
發明簡述本發明基於如果平面分子的兩個這種基團之一存在於分子平面的一側，並且如果整個分子的淨電荷足夠地大，即使非常小的基團諸如-OH也可產生針對非特異性結合以及平面分子堆積的有效保護的出乎意料的結果。
因此，本發明的一個方面是通過與聚氧烴基結合而非通過兩個非常小的軸向配體(諸如-OH)可以實現所設計的酞菁及其它螢光染料所希望的效果，條件是染料上的淨電荷足夠多。在大多數情況下，淨電荷優選為負電荷，因為在生理pH範圍中大多數生物材料包括蛋白以及DNA也將攜帶負淨電荷。因此，我們發現某些磺化的二羥基矽二羧基酞菁，尤其是La Jolla藍-3(LJB-3)當用於標記抗體時將提供高活性以及特異性的結合物。LJB-3比攜帶軸向聚乙二醇(PEG)的染料/螢光團更容易製備，此外，LJB-3在化學性質上更穩定。

圖1顯示了(LJB-3)推測的結構。磺基的位置不確定，但是可以想像在任一未取代的苯環上。LJB-3的最大近紅外吸光度是在679nm處。
通過量測游離染料，即不是在完整螢光探針中的染料可以部分評價螢光團(螢光部分)的性能。這種檢驗中有意義的參數包括螢光強度和偏振/向異性，當螢光團暴露於諸如存在於血清中的不同離子強度的特異性離子或生物分子時這些參數通常改變。這些效果可以被認為是「溶劑效應」，並且可通過螢光團的分子之間相互作用的改變從而改變聚集狀態或者在螢光團分子之間以及溶劑組成的改變(非特異性結合，NSB)產生。
本發明的染料結構以及先前試圖使用酞菁(Pc′S)作為螢光探針的標記的染料結構之間的比較可以通過NSB的檢驗形式得以認識，在NSB的檢驗形式中向血清中添加游離的染料並測定所產生的偏振或向異性。如果發生非特異性結合將產生偏振增加，因為結合後分子量的增加引起轉動布朗運動速率的下降。
表1中，可以通過螢光強度(I)的改變，和/或水平穿過表進行的偏振的改變(mp，毫偏振單位)判斷任一染料的性能。無論溶劑組成如何，「理想的」螢光標記對於這些參數將具有相同的值。
正常人血清中與甘油中性能的比較可以提供有益的信息，因為在血清存在下由NSB將提供對可能的偏振變化損失的測定。對於所列舉的5種染料而言，甘油中和正常人血清中偏振之間的差異值分別為60.4，73.6，103，12，61和44.1。這些差異顯示Si作為中心原子顯著的有益效果並且還指出LJB-3為基團的最佳選擇。甘油中的強度除以正常人血清中的強度的比值也是有象徵性的。顯示在表中為1.46，1.27，1.51，2.91，4.82和0.42，再次顯示Si相比Al顯著的優越性以及LJB-3非常優秀的性能。
另外，LJB-3兼具羧基和磺酸酯基團並且可以多種方式被「激活」，即轉化為在生理pH以及室溫下與待標記的生物分子上的基團(通常氨基)自發反應從而共價連接的結構。我們使用了兩種用於標記抗體的活化試劑，即羰基二咪唑以及琥珀醯亞胺基四甲基脲四氟硼酸酯(STUT)。我們發現後者在容易處理以及結果的再現性方面都是優選的。這可能是由於當使用STUT時，中間體染料的UHS酯的較強的穩定性。另外，用STUT激活的最佳溶劑是DMSO。可以使用DMF但是可能會受不可避免的痕量胺的困擾。
對於給定應用螢光團的最明確的合格性試驗是將染料摻入完整的探針並測試探針。以上對游離染料的血清試驗可以作為有用的指導，但還不能完全代替對特異性探針的試驗。
表2和3顯示了利用LJB-3標記的抗-人IgG作為ANA(抗核抗體)的探針的說明性結果。可以通過FIU(陽性/陰性)(或FIU[+/-])值，即來自陽性樣品的信號與來自陰性對照(正常的)的比值測定性能的質量。7或更高的值是有用的；隨著技術的發展獲得了這些表中的數據；在常規應用中可以預見將一致地產生較高的FIU(+/-)值。
發明詳述一般討論本發明基於如果平面分子在兩個這種基團之一存在於分子平面在一側，並且淨電荷足夠多的話，即使非常小的基團諸如-OH也可在水溶液中產生針對非特異性結合以及平面分子堆積的有效保護的出乎意料的結果。
因此，本發明的一個方面是通過與聚氧烴基結合而非通過兩個非常小的軸向配體(諸如-OH)可以實現所設計的酞菁及其它螢光染料所希望的效果，條件是染料上的淨電荷足夠多。在大多數情況下，淨電荷優選為負電荷，因為在生理pH範圍中大多數生物材料包括蛋白以及DNA也將攜帶負淨電荷。因此，我們發現某些磺化的二羥基矽二羧基酞菁(尤其是LJB-3，圖1)對血清蛋白具有如PEG-結合的未磺化染料一樣低的非特異性結合。
此外，存在的一個優點在於不存在由PEG形成的膠束。
在10-4以及以上的染料濃度的PEG工程化染料的表現很像大分子，因為其通過設計用於阻止30K道爾頓以上或更大的分子通過的膜受到很大的限制。並且，染料在設計用於從小分子分離大分子的凝膠滲透層析的空隙體積中移動。相比之下，LJB-3的表現就像所希望的其分子量的分子一樣。
當染料暴露於例如稀釋的人血清LJB-3時，通過螢光偏振和強度改變測定的非特異性結合的表現與PEG結合的染料幾乎相同。在這方面，重要的是要注意到負電荷本身對非特異性結合的減少有顯著的影響，因為未磺化的二羥基二羥基二羧基矽酞菁顯示明顯的非特異性結合。羥基鋁酞菁三磺酸酯不僅對離子強度顯示強烈的敏感性而且具有強烈的非特異性結合。似乎酞菁分子在分子平面的兩側必須具有軸向的配體，但是如果淨電荷足夠多的話-OH基團足夠大到全部消除非特異性的結合。
本發明的另一個優點是由-OH或其它小的可溶性軸向配體連同高電荷工程化的染料在化學性質上更具活性(在標記反應中)，儘管被標記的分子，例如蛋白和寡核苷酸本身帶負電荷。這就意味著PEG配體參與分子的標記，儘管通常很容易進行半抗原及其它小分子的標記。
本發明在羥基鋁酞菁三磺酸酯的強烈非特異性結合方面本發明是非常出乎意料的，由此，可以設想具有較少負淨電荷的二羥基二羧基矽酞菁將比鋁染料顯示更強的非特異性結合。本發明部分上是基於顯示正好相反的發現。其它小軸向配體諸如-OCH3，-O-CH2OH，Cl，-Br和-F的效果也是有用的。OPO3H2-的特性也是顯著的並暗示了其它可能有用的配體諸如硼酸酯和硫酸酯。
許多其他的含氮大環可以用具有類似結果的基團14的原子金屬化。這種大環包括卟啉，氮雜卟啉，corroles，sapphyrins，pentaphyrins，porphycenes及其它具有廣泛的離域π電子系統的類似大環的衍生物以及結構變體。鑑於它們包括許多所希望的特性，大環特別優選的類型含有氮雜卟啉衍生物以及結構變體氮雜卟啉衍生物包括單，二以及三氮雜卟啉和prophyrazine。任一的這些大環可以任選具有稠合芳烴環。這種氮雜卟啉衍生物以及變體包括酞菁，苯並三氮雜卟啉以及naphthaloyanine及其衍生物和其氧雜，硫代，或氮雜結構變體。某些非-大環芳族結構，例如氧雜蒽衍生物也可以具有上述列舉的類型的必要的螢光特性(Daltrozzo等，美國專利6,552,199，4月，22，2003)。
因此本發明涉及標記組分，螢光探針，天然以及合成的治療藥物，抗原，半抗原，抗體，寡核苷酸，利用這種產物的雜交分析以及免疫測定以及這種產物的製造方法。根據本發明，提供了可檢測性標記的標記，組分，其包含結合於兩個或更多通常軸向的小的可溶性配體的螢光團部分，所述軸向被定義為由中心金屬原子形式的八面體幾何形狀的複合物，所述中心金屬原子優選減少或解決了溶劑敏感性以及非特異性結合的問題。
在分析中使用這種可檢測的標記或標記組分是有益的，因為這些標記在諸如血清的生物材料存在以及缺少的條件下具有大體上相同強度的平行以及垂直的螢光發射組分。因此，利用這些標記的測定法能夠檢測生物流體中或生物表面諸如組織樣品或培養細胞上低濃度的分析物，靶分析物或其類似物。術語「分析物」是指分析中的化合物或待測定的化合物，可以是天然存在受體或可以製備的任何一種化合物，為單或多表位的，抗原的或半抗原的單個或多種化合物，其至少共享通用的表位位點或受體。術語「靶分析物」是指分析中的化合物或待測定的化合物，可以是天然存在受體或者可以製備的任何一種化合物，為單或多表位的，抗原的或半抗原的，單個或多種化合物，其共享至少一個通用的表位或受體。靶分析物的「類似物」是指能與靶分析物競爭結合受體的化合物。術語「受體」是指能夠特異性識別或由靶分析物或其類似物識別的分子複合物。例如，抗體可以是抗原的受體。
這些標記組分可以用作標記分析物，抗原，抗體或者其它分子的標記。這些標記組分可以被任選地功能化以便包括使標記組分與分析物，抗原，抗體或者其它分子連接的連接臂。適於這個目的的多種連接臂描述在Kricka，J.J.；Ligand Binder Assays，Labels and AnalyticalStrategies；1551頁；Marcel Dekker，Inc.，New York，NY(1985)。利用傳統方法將標記組分連接於分析物，抗原，抗體或者其它分子。
在本發明的一個方面提供了可檢測性標記的標記組分，其包括(1)含有大體上呈平面分子結構的發光結構的螢光部分，優選具有至少約550nm的激發波長以及(2)連接的兩個或更多小的溶解性軸向配體以及(3)具有足夠多的負淨電荷。優選的螢光團，小的溶解性軸向配體以及二者的鍵合的實例詳細描述於此。此外，提供了證明軸向配體以及淨電荷在減少溶劑敏感性以及非特異性結合的有效性方面的證據。
術語「溶劑敏感性」是指取決於所使用的溶劑系統分子螢光特性方面的改變，最顯著的是指與有機溶劑(諸如DMF)相比在水溶液中螢光特性的差異。許多在諸如DMF的有機溶劑中表現出高螢光強度的螢光團在在水溶液中顯示出顯著降低的螢光強度。螢光強度與樣品濃度以及激發輻射的強度有關。特定染料的螢光強度可以與其特徵吸光度(消光係數)以及螢光量子效率以及環境因素有關。這些標記組分也顯示出加強的衰減時間，接近於其放射或者未淬滅的壽命。我們使用的術語「衰減時間」是指為了使受激分子的濃度從其起始濃度降低到l/e的值必須消耗的時間。有關壽命的術語的用法會有所改變，參見例如，Demos，J.N.，Excited State.Lifetime Measurements，Academic Press，紐約，N.Y..(1983)，10，35，44，158頁。
通過量測游離染料，即不是在完整螢光探針中的染料可以部分評價螢光團(螢光部分)的性能。這種檢驗中有意義的參數包括螢光強度和偏振/向異性，當螢光團暴露於諸如存在於血清中的不同離子強度的特異性離子或生物分子時這些參數通常改變。這些效果可以被認為是「溶劑效應」，並且可通過螢光團的分子之間相互作用的改變從而改變聚集狀態牛生物分子在螢光團分子之間以及溶劑組成的改變(非特異性結合，NSB)產生。
本發明染料結構以及先前的使用酞菁(Pc』S)作為螢光探針的標記的染料結構之間的比較可以通過上述NSB的模型得以認識，其中向血清中添加游離染料並測定了所產生的偏振或者向異性。如果發生非特異性結合就會產生偏振的增加，因為結合後分子量的增加引起轉動布朗運動速率的下降。
表1中，可以通過螢光強度(I)的改變，和/或水平穿過表進行的偏振的改變(mp，毫偏振單位)判斷任一染料的性能。無論溶劑組成如何，「理想的」螢光標記對這些參數的每一個具有相同的值。
正常人血清中與甘油中性能的比較可以提供有益的信息，因為在血清存在下由NSB將提供對可能的偏振變化損失的測定。對於所列舉的5種染料而言，甘油中和正常人血清中偏振之間的差異值分別為60.4，73.6，103，12，61和44.1。這些差異顯示Si作為中心原子顯著的有益效果並且還指出LJB-3為基團的最佳選擇。甘油中的強度除以正常人血清中的強度的比值也是有象徵性的。顯示在表中為1.46，1.27，1.51，2.91，4.82和0.42，再次顯示Si相比Al顯著的優越性以及LJB-3(結構顯示於圖1)非常優秀的性能。
另外，LJB-3兼具羧基和磺酸酯基團並且可以多種方式被「激活」，即轉化為在生理pH以及室溫下與待標記的生物分子上的基團(通常氨基)自發反應從而共價連接的結構。我們使用了兩種用於標記抗體的活化試劑，即羰基二咪唑以及琥珀醯亞胺基四甲基脲四氟硼酸酯(STUT)。我們發現後者在容易處理以及結果的再現性方面都是優選的。這可能是由於當使用STUT時，中間體染料的UHS酯的較強的穩定性。另外，用STUT激活的最佳溶劑是DMSO。可以使用DMF但是可能會受不可避免的痕量胺的困擾。
試驗結果對於給定應用螢光團的最明確的合格性試驗是將染料摻入完整的探針並測試探針。以上對游離染料的血清試驗可以作為有用的指導，但還不能完全代替對特異性探針的試驗。
表2和3顯示了利用LJB-3標記的抗-人IgG作為ANA(抗核抗體)的探針的說明性結果。可以通過FIU(陽性/陰性)(或FIU[+/-])值，即來自陽性樣品的信號與來自陰性對照(正常的)的比值測定性能的質量。7或更高的值是有用的；隨著技術的發展獲得了這些表中的數據；在常規應用中可以預見將一致地產生較高的FIU(+/-)值。
表1.
通過測定取代的酞菁對溶劑組成改變的敏感性確定螢光強度(I)和偏振(mp)的改變

縮寫mp103(偏振)；TDx緩衝液用於螢光偏振分析的商用緩衝液；Pc酞菁；BBS硼酸鹽緩衝鹽水(0.25M NaCl，0.0232M硼酸和0.00179M四硼酸鈉。pH最終用1M NaOH調節至8.0+/-0.05。當試驗血清時，將25μl的全血清添加到1ml的BBS(含有已經添加的25μl的染料)。注意不同螢光團的相對濃度是未知的，因此只有當在水平方向進行時螢光強度的比較才是有意義的。在水溶液中操作LJB-3的BBS可以用硼酸鹽緩衝液KCl(BBKCl)代替，通過混合33.1ml的0.70M硼酸，4.0ml的0.50M K2B4O7，75ml的4.0M KCl和水製備1升pH ca.8.1。
螢光測定在瞬態偏光螢光計(FAST-1，Hyperion，Inc.Miami，FL)中進行。
表2.LJB-3-標記的山羊抗-人IgG與患者抗核血清抗體(ANA)的特異性結合。
A染料製備由羰基二咪唑激活的LJB-3(1)

(1)每一標記中1mg的蛋白(Comassie Blue)。
(2)FIUANA檢驗中觀察到的螢光強度的比率；反差測量樣品/陰性對照。
(3)兩種不同的抗體製備D和J。
B染料製備由STUT*激活的LJB-3

*琥珀醯亞胺基四甲基脲四氟硼酸酯詳細的背景和範圍這些標記組分可用作用於摻入螢光探針的螢光標記。術語「螢光探針」是指含有螢光團部分的標記組分，直接或者經連接臂鍵合或者配位到分析中使用的分析物，抗原，半抗原，抗體或者其它分子，所述分析諸如為螢光免疫分析從而測定目的物質的存在和/或量。這些標記組分的一些可用作磷光標記，本發明的組分也可用作用於體內顯影的試劑的標記以及用作體內腫瘤治療中使用的試劑的標記。
因為這些標記組分尤其適用於利用生物流體樣品的分析，優選使用的是具有近紅外區激發和/或發射波長的螢光團，從而使來自其它樣品組分的周圍環境螢光的幹擾最小化。當使用的激發波長小於500nm時，諸如血清的一些樣品可以顯示出來自黃素，flavoproteiris，NADH等相當大的幹擾背景螢光。
對於某些應用而言，諸如螢光偏振免疫測定，優選的螢光團當為結合形式時也可以顯示出高水平的螢光偏振，優選大於約10％的可見偏振理論最大值。術語「結合的」是指在分子及其特異性結合伴侶酯鍵已經形成結合相互作用的條件。無疑，諸如螢光瞬態分析的應用，優選螢光團的特徵在於在約1毫微秒到約50毫微秒範圍內測定的螢光衰減時間，優選在約5到約20毫微秒的範圍內。對於其它應用，諸如磷光標記，可以使用甚至具有更長衰減時間的螢光團。
優選的小可溶的軸向配體包括-OH，-O-叔-丁基(可用於存在有機溶劑時)，-OCH2OH，-OCH2CH2OH，OCH2CHOHCH2OH，-OCH2CH2-OCH2CH2OH，-OCH2CH2-CH2-O-CH2-CH2CH2OH，-OPO3H2，-OB(OH)2，Cl，Br和F。
在優選的實施方案中，螢光團部分具有一個平面，多齒的大環配體配位於能夠與兩個小的可溶的軸向配體配位的中心原子。為用作螢光結合分析中的標記組分，合適的中心原子為那些可配位兩個軸向配體且其沒有充分高的原子序數來通過躍遷為三重態引起廣泛螢光猝火。對於中心原子而言，優選的成分包括矽，鍺以及錫，尤其優選的是矽和鍺。
本發明的這些可檢測標記或標記組分在免疫測定中的應用是有益的，因為這些標記在存在和缺少生物液體諸如血清時具有大體上相同的平行和垂直組分的螢光發射強度。因此，利用這些標記的測定方法能夠檢測生物液體中低濃度的靶分析物。
本發明的方法尤其適用於發明名稱為「螢光計檢測系統」的美國專利5,323,008中描述的改進的螢光檢測系統。
在利用本發明的螢光標記的競爭性抑制分析方法中，目的在於提供一種通過將含有靶分析物的待測樣品與已知量的添加的靶分析物或其類似物接觸來測定靶分析物存在量的方法，所述的靶分析物或其類似物連接於包括由螢光部分組成的可檢測標記組分的螢光探針，其中螢光部分包括結合於兩個小的可溶的軸向配體的發光平面分子結構，一個位於平面分子結構的任一側且具有足夠的負淨電荷，將混合物與能夠特異性識別目標結構的受體接觸並且測定結合於受體或者游離的螢光探針的量。未知樣品中分析物的量可由空白樣品以及含有已知量的靶分析物的讀數來推斷。
在另一方面，本發明提供了進行「夾心」或「二-位點」免疫測定的方法，包括步驟(a)將含有靶分析物的待測樣品與能夠特異性識別目標的受體接觸來形成靶分析物和第一受體的複合物，第一受體用具有螢光團部分的螢光探針標記，其中螢光團部分具有一個與兩個小的可溶的軸向配體結合的發光的基本上呈平面的分子結構，可溶的軸向配體中的一個位於平面分子結構的任一側面上同時具有足夠高的負淨電荷；(b)將複合物與能夠特異性識別目標-分析物或第一受體的第二受體接觸，第二受體結合於固體載體，來形成第一標記受體，目標-分析物和結合於固體載體的第二受體的複合物；和(c)測定標記的與固體載體結合的第一受體的量或測定未反應的標記的第一受體的量。
在另一個實施方案中，分析可包括額外的步驟使在未知樣品中測定的標記第一受體的量與在不含靶分析物的對照樣品中測定的標記的第一受體的量相關聯，或與在含有已知的靶分析物的量的樣品中測定的標記的第一受體的量相關聯。
在另一個方面，本發明提供了可用於測定靶分析物的夾層式螢光免疫測定方法，其中可使用能夠被分析物獨立地識別而不互相干擾的兩種不同受體。各受體用不同的染料標記。例如，一個受體是用分別具有最大680nm和690nm的吸收和發射的第一染料標記的受體，且其它受體用分別具有最大695和705nm的吸收和發射的第二染料標記。可利用穩態或瞬態測定來檢測和定量分析分析物。在兩種情況下，對於所給的實例而言，激發應在680nm處並且檢測應在705nm處。這種類型的分析基於能量轉移並且具有一致性的優點。
在優選的實施方案中，本發明的標記和探針最有益地用於通過譜近紅外區的瞬態，光偏振螢光監控的均一混合和讀數分析中。這些組合形式產生了非常迅速的方法，其可以容易地大量進行並且容易自動操作來產生讀數。這些分析具有固有的特徵，因為通過近紅外波長(低偶發的螢光)和瞬態技術(避免瑞利和拉曼散射)提供的低背景幹擾，使得這些分析具有精確性和準確性。
本發明目的在於提供對生物液體的免疫測定，生物液體包括血清，血漿，全血，尿液和完整細胞，後者，例如，作為懸浮液或置於固體表面上用於螢光顯微術。在測定全血時，通常在通過賴氨酸試劑諸如硬脂醯-溶血卵磷脂，棕櫚醯溶血卵磷脂或十四醯溶血卵磷脂分析之前溶解紅血球是有益的。
在一個實施方案中，靶分析物是藥物或藥物的代謝產物藥物可以是類固醇，激素，抗生素，免疫抑制劑，止喘藥，抗腫瘤藥，抗心律失常藥，抗驚厥藥，治風溼藥，抗抑鬱藥或強心苷。這些藥物的實例包括地高辛，毛地黃毒苷，茶鹼，苯巴比妥，甲狀腺素，N-acetulprocainamide，麥蘇林，氨丁卡黴素，慶大黴素，netilmicin，託普黴素，醯胺咪嗪，乙琥胺，丙戊酸，達舒平，利多卡因，普魯卡因醯胺，奎尼丁，氨甲喋呤，阿米替林，mortriptyline，丙咪嗪，去鬱敏，萬古黴素和環孢素。
在另一個實施方案中，靶分析物是肽生物分子或其片段。這些肽生物分子包括，例如，肽類激素諸如促黃體生成激素，促卵泡激素，人絨毛膜促性腺激素，促甲狀腺激素，血管緊張素I，血管緊張素II，催乳激素胰島素，腫瘤標記物諸如癌胚抗原或病毒諸如風疹病毒。
本發明的方法提供了測定由約10-5M到約10-13M濃度的靶分析物的方式，並且尤其在約10-9M到約10-12M的濃度範圍內。這些測定對樣品或受體製劑中的偶發螢光的量以及對螢光發射的強度是非常敏感的。通常，可以肯定地說，將波長移成近紅外以及利用瞬態檢測是有益的，但是各種樣品存在雜質的差異要求在分析過程中優化每一種的分析。
本發明的主要目的是提供具有大大加強的可靠性以及便利性的改進的基於螢光的分析。本發明的另一目的是提供快速以及精確測定的方法，常常在幾分鐘內解決問題。本發明的一個目的是提供能夠測定非常低濃度的螢光標記或標誌的方法。本發明的一個目的是提供因為快速和準確，相對低成本以及能夠使用未修飾的生物樣品諸如全血所以可用於臨床的方法。這些目的通過如下手段得以實現1)優化螢光標誌的光學特性，2)檢測系統的高靈敏性以及穩定性，3)使用除去瑞利以及拉曼散射的瞬態檢測，4)使分析均一消除分離以及提供簡單的混合物以及讀出過程以及5)使設備以及樣品大小小型化。
本發明還提供了通過將螢光團部分與活性形式的可溶的軸向配體反應合成標誌組分的方法。本發明還表徵了具有本發明的標誌組分的螢光探針，所述標誌組分與特異性結合對或類似物的靶分析物的一個成員相連。術語「特異性結合對」是指兩個不同的分子(或成分)，其中一個分子具有表面上或腔中的區域，其特異性識別以及結合於其它分子(或包括其它分子的分子複合物)的特定的空間以及極性構成。
本發明的螢光染料可應用於DNA技術的若干領域以及研究。大體上，這些應用是那些其中必須標記單鏈DNA以便能夠在加工或檢驗中示蹤以及觀察的應用。例如，在DNA序列測定的雙脫氧測序法中，引物分子(互補於模板的3』末端的短的部分的短序列DNA)被末端標記(在所述引物的5』末端上)。具有4個核苷酸三磷酸的DNA聚合酶用於向模板的5』端延伸引物序列的3』端產生互補於模板的新鏈。反應進行很遠之前，將反應混合物分成4個相等的部分，每一部分分別用4(A，T，G或C)種二脫氧核苷酸三磷酸處理隨機終止鏈延伸以及由此產生新的不同長度序列的混合物，所述不同長度的序列終止於在所使用的二脫氧核苷酸三磷酸的相同的鹼基(A，T，G或C)。通過根據鏈長進行分離的PAGE電泳分離新的不同長度的鏈的混合物，所述PAGE電泳可以通過Southern印跡進行觀察，在Southern印跡中通過「印跡」將條帶譜轉移到硝化纖維膜上用於觀察。
在其它使用Southern印跡的情況中，通常通過高pH對DNA進行變性因此是單鏈的。在任一這些情況，與攜帶本發明的螢光標記的互補探針雜交提供了從Southern印跡觀察DNA的高靈敏性以及特異性的方式。DNA指紋分析是另一個預計越來越重要的領域。在一個指紋方法中，測試探針(標記的單鏈序列)與來自待鑑定樣品的限制酶降解的DNA的Southern印跡中的單鏈材料雜交。在所應用的這些方法中，螢光標記提供了與目測結合的高靈敏性。
本發明螢光染料的獨特特性可產生完全新型的對微量DNA的分析。這些分析將利用具有數字讀數的瞬態螢光偏振(TSFP)。這些分析的突出的優點是它們可以簡單的混合和通過微升等級的讀數分析來進行而不需必須分離。用於檢測和識別DNA的標準分析如下1.收集可能含有待測DNA的樣品。
2.通過PCR(聚合酶鏈式反應)擴增樣品。
3.將用本發明的螢光染料標記的單鏈DNA添加到擴增混合物中並隨時間進行TSPF(也許幾分鐘)。如果互補於標記DNA探針的DNA存在於試驗樣品中，則將發生雜交並且偏振將隨時間而增加。
本發明的目的也在於提供新的染料-寡核苷酸結合物以及它們的合成和使用方法。使用這些結合物或探針的方法可能涉及核酸雜交，核酸擴增以及核酸測序的方法。染料-寡核苷酸共軛物的染料部分是本發明的螢光標記。這些標記可能具有各種與DNA或RNA結合的功能性基團。這些功能性基團包括羧基，氨基和N-羥基琥珀醯亞胺酯(NHS酯)。
「寡核苷酸」是指相對短鏈的核苷酸殘基。典型地，本發明使用的寡核苷酸具有5到50個核苷酸的長度。用於本發明方法寡核苷酸探針包括DNA，RNA或任意其他種類可與核酸序列雜交的序列的多核苷酸。可以理解這樣的核酸序列可包括鹼基類似物以及自然存在的鹼基胞嘧啶，腺嘌呤，鳥嘌呤，胸腺嘧啶和尿嘧啶。這樣的鹼基類似物包括次黃嘌呤，2.6-，二氨基嘌呤和8-azguanine。探針可以是雙鏈的或單鏈的形式，但優選為單鏈形式。它們可通過直接合成，聚合酶介導的延伸反應或通過克隆或任意其他方便的方法來製備。「連接的」是指通過與兩個部分連接的中間分子進行的化學結合。
可利用縮合反應導致例如形成醯胺，酯，腙，縮氨基脲，縮氨基硫脲，尿素和硫脲鍵來實現將寡核苷酸或多核苷酸與標記相連接。例如，接頭可以氨基，優選初級氨基終止。其他的接頭可以羧基終止。
在另一個方面，本發明提供了製備特定的染料-共軛的寡核苷酸的方法。在一個實施方案中，這樣的方法包括步驟(a)將具有以氨基終止的結合接頭的寡核苷酸與可檢測標記的標記組分的N-羥基琥珀醯亞胺酯或咪唑化物(imidazolide)反應，其中標記組分包括一個含有與兩個小的可溶的軸向配體結合實質上發射螢光的平面分子結構的螢光團部分，一個位於平面分子結構的各側面並具有足夠的額外的負電荷以降低兩者的聚集和非特異性結合，來形成共軛物；以及由未反應的寡核苷酸或多核苷酸以及由未反應的染料分離步驟(a)中形成的共軛物。可利用二胺或氨基醇來完成接頭與寡核苷酸的連接。優選地，可檢測的標記組分包括隔離的(caged)二羧基矽酞菁染料。
或者，可通過下述反應；來製備染料-共軛物寡核苷酸在羥基苯並三唑和寡核苷酸或多核苷酸存在下，將標記組分與碳二亞胺反應來形成共軛物以及由反應混合物的其他組分分離產生的共軛物。
在另一個方面，本發明提供了檢測樣品中靶核酸序列的方法，該方法包括步驟將樣品核酸與具有用本發明的螢光標記標記的寡核苷酸接觸，所述的寡核苷酸能夠與所述的靶核酸序列在均質溶液中雜交，以及通過瞬態(或穩態)偏振螢光檢測此種雜交的存在或量。
在另一個方面，本發明的目的在於提供一種檢測或定量測定靶核酸的方法，其中靶核酸是核酸擴增的產物。核酸擴增方法聚合酶鏈式反應(PCR)，連接酶鏈式反應(LCR)，自主序列複製(3SR)以及基於轉錄的擴增系統(TAS)。
當與時間-相關的瞬態檢測系統一起使用時，本發明的方法是尤其有用的，如Studholme等，發明名稱為「螢光檢測系統」的美國專利5,323,008所描述的，該系統的特徵在於瞬態檢測實現了直接閱讀樣品的時間依賴的偏振作用。該系統利用了可以非常高的頻率例如兆赫調節的雷射二極體，並且顯示出高的輸出功率。典型地，雷射「接通」時間大約是2-3納秒。使用以單光子計數模式運行的光電倍增管檢測溶液的光子。與雷射脈衝時間比較，測定了光子現象以及光子現象的相對時間。通過存儲個體的光子現象次數，產生作為時間函數的光子的頻率的柱狀圖。
在另一個方面，本發明提供了一種用於監控核酸擴增過程的動力學，和/或定量測定目標樣品中核酸的方法。例如，在PCR擴增過程中，由已被加帽並用本發明的螢光染料標記的寡核苷酸組成的探針可直接添加到PCR反應中。「加帽」是指3′末端已與二脫氧核苷酸三磷酸反應。因此螢光隨時間變化的瞬態檢測可用於跟蹤反應的發展。
在每個冷卻階段，可動態跟蹤與擴增產物的雜交。因為擴增產物的濃度增加，探針與擴增產物的結合率也增加以及定量測定擴增產物的濃度。循環數相關的信息定量顯示了擴增前樣品中原先存在的DNA的量。
發明的另一個方面是對螢光計的任何構思、變化或修改的寬泛的應用範圍。在下文中的特定類型裝置的實例中對適用性的範圍進行了較好的說明。在非吸收性介質中，光波穿越由較低折射率的第二介質B包圍的介質A時，如果入射角大於臨界角則光波在介質A的邊緣全部內反射。然而，全反射光的穿透邊緣短的距離並且在那裡可以產生物理作用諸如激發位於鄰近A與B之間接觸面的螢光分子。
這些作用能夠同質，基於螢光的分析其中特異性反應發生在固定於介質A表面上的分子上且因此可發生在激發螢光唯一位置的接觸面處。普通玻璃或塑料板充當入射光的光波導管並且作為特異性受體的載體預先放置在表面上的已知位置處。此方法已被命名為「瞬逝光螢光免疫分析」(Herron等美國專利5,512,492)。
有益地，本發明包括利用基於含有N的大環(下面所列舉的類型)的螢光染料的非常大的Strokes位移的特徵，其中大環通常具有近UV激發區域以及在光譜的近紅外區發射。這些染料適用於穩態或瞬態方式的免疫/受體分析。激發源包括水銀弧光，氮雷射器和氮雷射器泵激的染料雷射器。或者，這些相同的染料可在近紅外用二極體雷射器激發來實現用脈衝式激發和瞬態檢測得到的優異結果。放射源的選擇取決於對於所討論的特定染料而言的吸收譜帶的位置，優選的激發和檢測方式，是否穩態或瞬態以及是否依賴於空間需要。
這些在化學作用中的特徵的內含以及為「瞬態光螢光免疫分析″而設計的裝置應具有非常低的背景以及高的信號水平且因此有助於-高含量敏感性。
本發明上面描述的概述是非限制性的，且本發明的其他和優點可從下面的優選方案以及權利要求的描述中很容易看出。
優選標記組分的吸光度和偏振特性這些包括中心原子(例如，矽)與兩個小的可溶的軸向配體結合的標記組分可通過測定瞬態螢光來表徵。在這些測定中，在約3倍標記組分衰減時間的時間內，監控極化的或者平行或垂直於激發脈衝的極化方向的兩個組分的強度。這些曲線反映消光係數，量子產率，衰減時間以及偏振態並且提供關於標記組分的化學和物理狀態的敏感性指示。例如，如果激發態被減活或轉變為三重態，則總體強度降低了並且衰減時間縮短了。如果分子的轉動布朗運動被通過增加粘度或者通過結合於大分子而改變，則平行於垂直部分的強度的比率增加了。
本發明的某些標記組分顯示，在約5％的實驗誤差範圍內，在DMF(有機溶劑)中與在SAP(鹽疊氮化物磷酸酯，水化的中性緩衝液)中具有相同的強度，衰減時間和偏振。在某種程度，與其它的標記組分製劑共用這些特性。本發明標記組分的與眾不同的和重要的特性是對血清中組分的敏感性(以及缺少結合於)，其通過缺少任意顯著的血清對螢光的極化組分的強度，衰減時間或相對值的測定作用而被證明。這些特性對於用於利用生物材料的應用諸如分析的標記組分是至關重要的。
優選標記組分的製備根據本發明的製備優選標記組分的一種方法，按照常規的反應方案在配體交換反應中將具有羥基-或滷化物基團的適當的螢光團部分作為軸向配體與增溶部分的活性形式反應Mcl--CA-(X)2+2(SM) Mcl-CA-(SM)2+2X其中Mcl表示大環配體，CA為中心原子，X為取代的配體以及SM為增溶部分。如需要，這些反應可在溶劑中進行。適當的溶劑包括喹啉，THF，DMF，咪唑(當溶於其他所列舉的溶劑之一中時)等等。適當的反應溫度可取決於大環原材料以及增溶基的特性來變化。反應通常在大約2分鐘到大約24小時內完成。反應混合物可以方便地通過回流通過例如沙浴的方式來加熱。為方便起見，反應可以在環境壓力下進行。確信此反應分兩步驟進行，每次用一個聚氧烴基配位作為軸向配體。
當在螢光免疫測定中用作螢光時，這些標記組分可連接於特異性結合對(「標記的結合對」)的一個成員或此成員的類似物。術語「結合對」是指能夠或特異性識別或被特異性分子或分子複合物識別的分子或分子複合物。標記組分可直接地結合或連接或通過連接臂結合或連接。
實用性本發明的標記組分可用作螢光標記用於螢光探針和用於螢光結合分析以及用作活體內顯影和活體內腫瘤治療的標記。
這些標記組分可有利地用作傳統螢光結合分析中的螢光標記，包括螢光偏振免疫測定分析。當如此使用時，這些標記組分可連接於特異性結合對(「標記的結合對」)的一個成員或此成員的類似物。標記組分可直接地結合或連接或通過連接臂結合或連接。
這些標記結合對用於各種形式的分析，例如涉及分析物或分析物結合對競爭的分析(如果使用了標記分析物或分析物-類似物)並且可用於同源或異源分析。
考慮到它們在水溶液中有益的避免了聚集和缺少溶劑敏感性(表明不可檢測的聚集)以及缺少與血清組分及其它生物學大分子非特異性的結合，這些標記尤其適用於分析檢測含有生物液體諸如血清的樣品中的分析物。因此，這些標記組分可用作檢測溶液中分析物的螢光探針的標記，其中溶液中血清組分的非特異性結合會嚴重地影響分析的敏感性，影響其準確性和精確性。
或者，這些標記組分可用作活體內顯影的試劑。當用作顯影劑時，將這些標記組分連接到標記結合部分的特異性結合對的一個成員上。標記結合對被導入到動物中。如果存在特異性結合對的其他成員，標記結合部分會與其結合併且可測定和定位識別通過標記組分產生的信號。
這些標記組分可同時用於活體內腫瘤治療。例如，光動力學治療包括使用標記組分作為光敏感性藥物。將標記組分(螢光標記)連接到可特異性識別的結合部分並結合於腫瘤細胞的組分。
本發明提供了核酸探針以及製備與使用該探針的方法。新核酸探針的使用方法包括現在已知的或隨後發展的不同核酸雜交序列技術，以及已知的或隨後發展的各種核酸擴增技術。本發明的探針(在這裡也稱為結合物)和方法使得在同源雜交分析中實現了1fmole的靈敏度；這個靈敏度相當於通過電流同源雜交測定技術獲得的靈敏度。如上所述，然而，目前的異源分析具有一些缺點，其是由分析中涉及的許多步驟導致的，包括增加的汙染危險和實施分析要求增加的次數。對於本領域的技術人員而言，通過參見在這裡提供的實施例很容易理解本發明組合物和方法的其他優點。
實施例為有助於本發明，下列實施例包括了描述一系列實驗結果的實施例。下列關於本發明的實施例不應被理解為是對本發明的特異性限制，本發明現在已知的或隨後發展的在本領域技術人員理解範圍內的變化應被理解為落在本發明在這裡描述的以及在後面的權利要求的範圍內。
實施例1由1，2，4，5-四氰基苯(TCNB)合成四二亞氨基均苯四甲酸(tetradiiminopyromellitic)酸二醯亞胺。
將3-頸，11細頸瓶中的TCNB，20.0g(0.112摩爾)在真空中乾燥約1hr。長頸瓶配置緩慢的高轉矩，聚四氟乙烯葉片攪拌器，用於在氨水中起泡或添加液體的進口，以及一個水冷式冷凝器。用氮氣衝洗整個裝置後，添加400ml的甲醇，在室溫開始攪拌並且慢慢地使氨水起泡。
氨水吸收是非常有效的並且幾分鐘後懸浮液變成澄清的淺綠色溶液。幾分鐘後(伴隨恆定添加氨水)溶液變的渾濁且溫度微微升高。由開始添加氨水40分鐘後，反應混合物變得難以攪動並在攪拌下添加200ml的甲醇並且繼續添加氨水。此時通過懸浮液的表面缺少氣泡浮起可表明氨水吸收仍然非常的有效。100分鐘後必須添加另外175ml的甲醇來進行攪拌。125min後，大量氨水開始從冷凝器溢出，並在持續攪拌和加熱下將反應混合物置於45℃的水浴中並添加氨水另外240分鐘。冷卻後，將反應混合物在4℃儲存24小時。然後通過Whatman #_42紙吸收過濾並真空乾燥。產率23.2g(0.109moles)。
實施例2雙-氯代(2；3二羧基酞菁)矽(IV)的合成將二亞氨基異二氫吲哚(30.0g；0.207摩爾)和四二亞氨基均苯四甲酸二醯亞胺(10.5g；0.050摩爾)一起研磨並在1升的3頸長頸瓶中真空乾燥。長頸瓶裝有聚四氟乙烯葉片混合器，隔膜，溫度計和具有矽膠乾燥管的回流冷凝器。用乾燥氮氣衝洗裝有攪拌反應物的裝置，並且在氮氣中添加600ml喹啉並在氮氣流中混合30分鐘。獲得了均一的液體懸浮液。其後，在5分鐘時間內通過隔膜慢慢添加60ml的四氯化矽。溶液顏色變深並在不加熱情況下繼續攪拌15分鐘。
然後，連續地攪拌，將預熱到195℃的油浴增加到使長頸瓶沉浸到其容量以上的水平的位置。5分鐘後，油浴溫度降低到175攝氏度並且在15分鐘後穩定在185-190攝氏度並維持另外60分鐘。油浴然後下降並且使反應混合物冷卻大約15分鐘。然後通過氮氣流除去通過溼潤的pH試紙在冷凝器出口檢測到的未反應的四氯化矽。通風大約45分鐘後，將現在為100℃的浴器繼續慢慢加熱到大約130℃以促進四氯化矽的去除，當僅僅喹啉煙明顯時，在額外70分鐘後進行上述測定時顯示四氯化矽被完全除去。
然後除去油浴並且當反應混合物冷卻到大約80℃時在攪拌下添加424ml水和424ml濃鹽酸的混合物。熱被放出且最終的混合物是酸性的。將反應產物在室溫下放置過夜。第二天攪拌下添加另外的424水和424ml濃鹽酸，並且將混合物在室溫下澄清過夜。
然後通過Buchner漏鬥(24cm紙)過濾反應混合物，用水衝洗並且在遮光板中空氣乾燥隔夜。將溼潤的過濾濾餅在一升的丙酮中攪拌並過濾。將衝洗物質在遮光板中乾燥2天時間。在巖缽中用丙酮研磨乾燥物質(50g)並且攪拌混合物，過濾和真空乾燥後留下47.9g的黑色精細分離的固體。
實施例3雙-氯代(2；3-二羧基酞菁)矽(IV)，(二羧基二氯代染料)的水解。
利用長莖漏鬥將濃硫酸(98ml)置入250ml的圓底燒瓶中以避免潤溼長頸瓶的頸部。磁力攪拌下通過較短莖的漏鬥添加16.3g的二羧基二氯代染料。添加延續大約一小時時間來在添加固體前實現分散染料的塊。將乾燥管連接於長頸瓶且在油浴中加熱混合物並在50℃維持24小時。
從油浴中移開反應燒瓶並在冰中冷卻。小心地添加小部分的水(75ml)並且不冷卻，在80℃油浴中攪拌加熱混合物20小時。冷卻後，將混合物傾入一升燒杯中的冰中並攪拌。
在室溫下2000×g離心混合物30分鐘。將沉澱物懸浮在水(大約250ml)中並再次離心。再次重複衝洗，收集沉澱物並懸浮在300ml 1MK2CO3中。在覆蓋表玻璃的燒杯中攪拌加熱混合物。在10分鐘內，溫度達到90℃並且繼續在大約93℃繼續加熱50分鐘。用濃HCl酸化仍然很熱的混合物並允許冷卻以及在室溫下放置2天。
然後通過11cm帶有Whatman#_42紙的Buchner漏鬥收集固體，過濾花費大約1小時。通過用3×100ml的水衝洗漏鬥上的固體並且在遮光板中空氣乾燥。然後打碎固體並且在真空中通過P2O5和KOH乾燥。產量13.3g(87％)。
實施例4通過矽土吸附色譜法純化雙-羥基(2，3二羧基酞菁)矽IV(二羧基染料)。
將實施例3製備的粗二羧基染料，3.0g置於250ml瓶中，向其中添加100ml包含2％(v/v)乙基二異丙基胺(DIEA)的甲醇並且攪拌混合物30分鐘。此後添加43g矽土(EM Science)並且手工振蕩混合物來形成黑色漿糊。20分鐘後，添加具有2％DIEA的100ml MeOH，將瓶子反轉幾次並且攪拌內容物20分鐘。通過添加EtOH和MeOH與DIEA調節溶劑特性改變了所提取的染料的成分並實現了單一組分的提取。然後通過燒結玻璃漏鬥(微孔性，6.5cm直徑)在減壓下過濾固體。為防止MeOH的巨大損失，通過連接到部分排氣的櫃中保持減壓。過夜過濾後，用2×50ml的MeOH+DIEA衝洗殘餘物大約30hr。將濾液(230ml)置於旋轉蒸發器中濃縮至接近乾燥。將殘餘物溶於14ml MeOH+DIEA，將溶液均分並置入兩個40ml的尖底離心管中。
用200ul濃縮的HCl酸化各管中的內容物，並添加水至幾乎裝滿管。通過反轉混合內容物並搖動數次，以及約650×g離心30分鐘。丟棄褐色清液層並且用0.01M HCl衝洗沉澱物三次。將沉澱物轉入100圓底燒瓶並通過循環蒸發乾燥，然後通過H2SO4和KOH在真空中乾燥。乾重是304mg(純淨的二羧基染料)。
實施例5通過氯磺酸磺化純化的二羧基染料。
稱取161mg的純淨二羧基染料(實施例4)置入50ml具有磁力混合器的長頸燒瓶中。室溫在N2下添加3.4ml的ClSO3H。連接具有N2氣瓶的小空氣冷凝器並且在110℃油浴中加熱長頸瓶和內容物大約3.7小時，在該時間點取出μl樣品用於分析。然後繼續在110℃加熱另外3.3小時，停止加熱並取出第二個樣品。向兩個樣品中添加冰並且分別用390mg的水稀釋。然後向各樣品中添加2ml 1M的NaHCO3並且通過測定用2ml的中性緩衝液烯釋10μl的烯釋樣品來測定各樣品的吸光度。兩樣品的Amax為690nm，3.7小時樣品的讀數為0.650以及7小時樣品的讀數為0.490顯示在最後3.3小時加熱時間內有大約25％的染料被破壞。或者，可通過在ClSO3H中70℃加熱純化的二羧基染料36小時進行磺化。
以小部分向燒杯中的冰上添加主要的反應混合物；並以約700×g離心冷混合物30分鐘。丟棄非常微弱顏色的上層液體。將沉澱物懸浮在30ml的冰水中，與水一起轉入到250nm錐形瓶中，用大約40ml的1M KHCO3使其鹼性化並在室溫下攪拌過夜。將反應混合物轉入燒杯中，用濃縮的HCl酸化並且在室溫下攪拌6小時以及在室溫下儲存48小時。
以約700×g離心混合物；保留有色的上清液並將沉澱物溶於1MNaHCO3中以及攪拌2小時。將暗綠色溶液通過Sep Pak(2g大小，Rainin25)並將酸化後的濾液與離心獲得的上清液合併。總體積約為400ml。深藍色酸性溶液吸附在Sep Pak上，通過3N HCl衝洗柱並用MeOH洗脫。用MeOH和3N HCl衝洗後的Sep Pak可以反覆使用。通過循環蒸發和通過H2SO4和KOH在真空中乾燥含有染料的MeOH洗脫物。產量158mg。通過矽土色譜法純化這些物質產生La Jolla Blue-3(LJB-3)。
結果顯示於表1和2中，且表明了通過螢光強度和偏振尺寸來評價的三種染料的非特異性結合和溶劑敏感性，關於強度，特性要求為溶劑組分與高螢光產量無關。另一方面，偏振理想地應在低粘度的介質中保持低並且在粘性溶劑例如甘油中是儘可能的高。
表1表明酞菁三磺酸鋁的螢光強度是極其溶劑-敏感性的。不可比較地，二羥二羧基矽酞菁磺酸酯顯示出與在緩衝液，緩衝液加血清或單獨甘油中的螢光產量幾乎相同的顯著提高的特性。通過和二羥-二羧基-矽-酞菁(沒有磺化基團)比較這些提高可被注意到應取決於磺化，其中二羥-二羧基-矽-酞菁本身與鋁化合物相比對血清和溶劑具有較小的敏感性。
表2更強烈地表明僅僅存在中心矽原子導致當與鋁作為中心原子比較時對環境的敏感性降低了。這些差異很可能由於矽具有兩個軸向配體並可以因此「保護」染料的平面結構不受溶劑效應的影響，因為「保護基團」存在於分子平面的各側面上。鋁僅僅存在一個軸向配體且因此分子平面的一側易受溶劑效應的影響。在圖2中，由這些相互作用的結果可清楚地看出鋁染料的偏振有非常大的增加，幾乎增加到通過將染料置於甘油中可得到的最大值(其表明如果自轉幾乎終止則對偏振有相應的限制)。
結論上述關於本發明的示例性應用不應被為對本發明範圍的限制。現在已知的或以後發展的落入本領域技術人員理解的範圍中的本發明的這些變化，應被理解為落在下文中權利要求的本發明的範圍內。
說明書中提及的所有專利和出版物是本發明所屬領域技術人員的水平的表現。所有的專利和出版物在這裡引入作為參考，其與各個體出版物被特異性和分別地引入作為參考是相同的。
本發明在這裡說明性地適當的描述可在缺乏任意元件或一些元件的情況下來實施，局限性沒有在這裡特異性地公開。因此，例如，在這裡的各實例中任意術語「含有」，「基本上包含」和「包含」可被任何其它兩個術語替換。已使用的術語與措辭用作說明性的術語但並非限制，且並非意欲在使用這些術語與措辭時排除所顯示的和描述的特徵或其部分的任意等價物，但是應能理解各種修飾落在本發明權利要求所述的範圍內。因此，應能理解儘管本發明已通過優選的實施方案和任選的特徵特定地公開，在這裡公開的概念的修飾和變化可被本領域技術人員利用，且這些修飾和變化被認為落在所附權利要求所限定的本發明的範圍內。
權利要求
1.具有中心金屬原子的大環螢光配體，所述原子具有兩個軸向配體在大環的每一側各有一個，所述軸向配體獨立地選自烷氧基，滷化物，羥基，硼酸酯，硫酸酯或磷酸酯，所述大環具有一或多個苯並基團並且作為苯環上的環取代基的兩個鄰羧基或者一個羧基連同一個其它的不是羧基但是在pH 5或以上的水溶液中帶負電荷的基團，以及作為在大環的任意其它可能位置的其它的環取代基的一或多個不是羧基但是在pH 5或以上的水溶液中帶負電荷的基團。
2.權利要求1的大環螢光配體，其中大環是酞菁，中心金屬原子是Si或Ge，軸向配體是羥基，環取代基是兩個在一個環上的鄰-羧基，以及在其它環中之一上的一個磺基。
3.標記組分，含有結合於兩個增溶基的發光的、大體上呈平面的部分，根據需要一個增溶基連同所述大體上呈平面部分的取代基位於平面部分的一側來控制標誌組分的淨電荷以及將標誌組分結合於其它分子。
4.權利要求3的標誌組分，其中發光的、大體上呈平面的部分是具有1到4個苯並基團的三氮雜卟啉。
5.權利要求3的標誌組分，其中發光的、大體上呈平面的部分是具有1到4個苯並基團的二氮雜卟啉。
6.根據權利要求3的標誌組分，其中發光的、大體上呈平面的部分是具有1到4個苯並基團的單氮雜卟啉。
7.螢光探針，含有權利要求4，5或6的結合於諸如抗原，半抗原，抗體，寡肽或寡核苷酸或天然或合成藥物的生物分子的發光部分。
8.權利要求7的螢光探針，具有諸如適於通過測定瞬態螢光偏振/向異性進行的分析中的螢光強度，偏振以及衰減時間的特性。
9.標誌組分，根據需要由結合於兩個增溶基的發光的、大體上呈平面的部分連同所述大體上呈平面的部分的取代基構成來控制標誌組分的淨電荷以及將標誌組分與其它分子結合，所述兩個增溶基之一位於平面部分的一側。
10.具有中心金屬原子的大環螢光配體，所述原子具有兩個軸向配體在大環的每一側各有一個，所述軸向配體獨立地選自烷氧基，滷化物，羥基，硼酸酯，硫酸酯或磷酸酯，所述大環為具有一或多個攜帶能夠結合以及控制淨電荷的取代基的單氮雜卟啉。
11.具有中心金屬原子的大環螢光配體，所述原子具有兩個軸向配體在大環的每一側各有一個，所述軸向配體獨立地選自烷氧基，滷化物，羥基，硼酸酯，硫酸酯或磷酸酯，所述大環是具有能夠結合以及控制淨電荷的取代基的咕啉，sapphyrin，porphycene或者naphthalocyanine衍生物。
12.具有中心金屬原子的大環螢光配體，所述原子具有兩個軸向配體在大環的每一側各有一個，所述軸向配體獨立地選自烷氧基，滷化物，羥基，硼酸酯，硫酸酯或磷酸酯，所述大環是具有能夠結合以及控制淨電荷的取代基的27-苯基四苯並三氮雜卟啉或27-(對-甲基苯基)四苯並三氮雜卟啉衍生物。
13.基於螢光的分析，利用本文公開的螢光標誌或螢光探針。
14.勻質混合物以及包括利用在本文公開的螢光標誌或探針的核酸雜交的讀數分析。
15.標誌組分，其中螢光部分選自(1)醌型染料(2)陰丹士林染料(3)1，4-二氨基蒽醌-2，3-二羧醯胺(4)四氨基蒽醌(5)吖嗪染料(6)吡喃翁或硫代吡喃翁染料以及(7)萘醌甲基化物。
16.產生抗非特異性結合以及平面分子堆積的有效保護的方法，包括a)提供至少兩個小的軸向配體，b)將一個或多個所述配體置於由所述分子限定的分子平面的對側，c)確保整個分子的淨電荷足以產生所述的保護。
17.權利要求16的方法，其中所述軸向配體由-OH組成。
18.權利要求16的方法，其中所述配體選自-OH，-O-叔丁基，-OCH2OH，-OCH2CH2OH，OCH2CHOHCH2OH，-OCH2CH2-OCH2CH2OH，-OCH2CH2-CH2-O-CH2CH2OH，-OPO3H2，-OB(OH)2，Cl，Br以及F。
全文摘要
本發明涉及標記組分，螢光探針，寡核苷酸，雜交分析和利用這種產物進行的免疫測定，以及製備這種產物的方法。根據本發明，所提供的可檢測性標記的標記組分包含與兩個小的增溶基結合的螢光部分，一個在分子平面的各側面上，所述螢光部分具有調控淨電荷的取代基以便減少或消除溶劑敏感性和非特異性結合的問題。
文檔編號C07H21/04GK101035800SQ200580019590
公開日2007年9月12日 申請日期2005年5月18日 優先權日2004年6月14日
發明者沃爾特·B·丹利克, 徐茂麟, 威廉·P·小墨菲 申請人:漢約爾格·黑雷特