一個控制植物根系發育的基因及其編碼產物與應用的製作方法

2023-06-25 10:53:16

專利名稱：一個控制植物根系發育的基因及其編碼產物與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一個控制植物根系發育的基因及其編碼產物與應用，特別是涉及一個與水稻根系發育有關的基因及其編碼產物與應用背景技術農作物的生長與發育都需要依賴根系從土壤中吸收水分和無機鹽養分。因此，根的發育對於農作物的產量起著至關重要的作用。水稻的根系，可根據它們發生的位置和發育階段分為兩類，一類是胚生根，一類是胚後發育的根。胚生根由胚根萌發後發育而來，它有兩種形式，一條初生根和幾條種子根。胚後發育的根，也有兩種類型，一類是從植株莖節產生的不定根，另一類是在所有類型根上，都產生的側生根。
植物中很多基因受生長素的調控，例如AUX/IAA家族，SAUR(small auxinup-regulated RNA)家族和GH3家族(Hagen et al.，1984，Planta 162，147-153；McClureet al.，1989，Science 243，91-93；Abel and Theologis，1996，Proc Natl Acad SciUSA.91326-30)。這些家族中的有些成員除了可以被生長素專一誘導外還受其它激素如激動素、乙烯和環境因子如重金屬離子、高溫所誘導(Gray et al.，1998，Nature，414，271-276)。很多受生長素調控的基因的啟動子序列中都有一段共同序列—生長素反應元件AuRE(Auxin Response Element)5』-TGTCTC-3』，這個序列被證實是生長素反應因子ARF(auxin response factor)結合所必需的(Guilfoyle et al.，1998，PlantPhysiol.118，341-347；Liu et al.，1994，Plant Cell.6，645-57；Ulmasov etal.，1999，Plant J 19，309-319)。很多被生長素誘導的基因參與調控根的生長發育。例如受生長素快速誘導的AUX/IAA基因家族成員SHY2/IAA3、SLR1/IAA14、IAA28、MSG2/IAA19等，如果它們發生突變都會導致側生根減少或缺失(Reed 2001，Trends PlantSci.6，420-425)。相反有些基因如AUX1、TIR1或者MAC1，它們的超表達則會促進側生根的形成(Marchant et al.，2002，Plant Cell.14，589-597.；Gray et al.，1999，Genes Dev.3，1678-1691；Xie et al.，2000，Genes Dev.14，3024-3036)。雖然生長素的信號轉導途徑在雙子葉和單子葉植物中具有較高的保守性，但與雙子葉植物相比，單子葉植物根發育調控機理的研究相對滯後。儘管在玉米中有與根發育相關的突變體(Hetz et al.，1996，Plant J.10，845-857)，但遺憾的是這些突變體相對應的基因並沒有克隆出來。而在水稻中，和根發育相關的基因研究則更少。

發明內容
本發明的目的是提供一種與水稻根系發育有關的基因及其編碼產物。
一種與水稻根系發育有關的基因OsRAA1(Oryza sativa Root ArchitectureAssociated 1)，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
一種由上述基因OsRAA1編碼的蛋白質，具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列或將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
本發明序列1的DNA序列由330鹼基組成，編碼序列表中由109個胺基酸殘基組成的蛋白質序列2。
含有本發明基因OsRAA1的表達載體及細胞系也在本發明的保護範圍之內。將序列1基因的cDNA構建在Ubiqutin啟動子下遊，得到表達載體(其圖譜如圖1所示)，利用電激等方法即會得到含有該表達載體的農桿菌菌株。
利用Northern雜交、RNA原位雜交、報告基因的組化染色等技術，分析了本發明基因的表達模式。藉助農桿菌介導的轉化，分析了該基因在組成型超表達時對植株根系發育的影響。研究結果表明，本發明與水稻根系發育有關的基因在根尖細胞表達，尤其在根尖分生組織的皮層和中柱鞘有很強表達，同時OsRAA1的轉錄物在側根中也有分布。Northern雜交表明該基因可被生長素誘導表達，轉基因植物表型分析發現該基因控制水稻根系的生長發育，對於培養優良的作物品種特別是水稻品種具有重要的理論及實際意義。


圖1為Ubii∷OsRAA1的構建圖譜。
圖2為對照和轉基因植株根系的比較。
具體實施例方式
在本發明的下述實施例中，所用的實驗材料均為粳稻中花10號(Oryza sativa L.cvZhonghua 10)和粳稻中花11號(Oryza sativa L.cv Zhonghua 11)。
實施例1、與水稻根系發育有關基因序列的克隆利用RNA提取分離試劑盒(Trizol GibcoBRL)分離水稻根中總RNA，其具體方法是收集水稻材料100mg，立即置於液氮中研磨，加入1ml Trizol試劑，充分混勻；室溫放置5min；加入0.2ml新鮮氯仿，劇烈振搖15s，室溫溫育3min；4℃，12000g離心15min；上清水相轉移到一個新的1.5ml離心管中，加入0.5ml異丙醇沉澱RNA；RNA沉澱用1ml75％乙醇洗滌後溶於適量DEPC處理過的水中，-70℃保存備用。
根據生物信息學提供的序列資料設計以下引物5』端引物T GCACTG CAGAGT TTG AGA GAG ATC TAA GAG ATG，(其中劃線序列為Pst I位點)；3』端引物ATGCGGA TCCAAT TTA GGC GTC GAC GAC GCG GAA G，(其中劃線序列為BamH I位點)。
通過RT-PCR擴增得到OsRAA1的cDNA序列，具體方法是依據Plant RT-PCR Kit2.01(TaKaRa，Japan)的用戶手冊進行。1-2μg總RNA(大約1-2μl)，和Kit的各種反轉錄試劑混合(MgCl24μl；10×RNA PCR Buffer 2μl；RNase Inhibitor 0.5μl；RNasefree Water 8.5μl； dNTP Mixture 2μl；Reverse Transcriptase 1μl；OligodT-Adaptor 1μl)。混勻後，42℃ 30min；99℃ 5min；5℃ 5min，完成反轉錄反應。吸取2μl反轉錄產物，作為模板進行PCR反應94℃ 2min後進入擴增程序94℃ 1min、62℃ 1min、72℃ 1min，30個循環後，72℃ 7min。擴增得到的OsRAA1cDNA序列自起始密碼子到終止密碼子總長330鹼基，編碼109個胺基酸，推測分子量12kD，等電點9.45。
實施例2、OsRAA1基因的表達模式Northern雜交表明OsRAA1 mRNA在水稻根和穗狀花序中特異表達，在幼莖和幼葉中沒有信號。
利用地高辛標記反義RNA為探針進行組織原位雜交實驗，結果表明OsRAA1基因在根尖細胞表達，而且在根尖分生組織的皮層和根尖中柱鞘有很強表達，相反，在成熟區的皮層沒有明顯可檢測雜交信號，同時OsRAA1的轉錄物也存在於側根。
用OsRAA1啟動子驅動的β-葡糖醛酸苷酶報告基因(GUS)植物轉化載體，利用農桿菌侵染的方法轉化水稻，發現轉基因植物根的GUS染色陽性部位與前面原位雜交結果相同。
1、Northern雜交將各種材料的總RNA分別測定濃度後，取等量的各個樣品在0.7％的瓊脂糖凝膠上進行電泳至溴酚藍遷移到凝膠的2/3處，將凝膠轉移至一個培養皿內，用滅菌的DEPC水淋洗3-4次，浸泡於數倍體積的20×SSC中，溫和搖動45min；通過毛吸作用轉移24小時，使RNA帶吸附在尼龍膜上，120℃烤膜30分鐘。將尼龍膜放入雜交管，經65℃預雜交2-3hr後，加入經純化、變性的32P-標記的OsRAA1探針，65℃雜交過夜(17小時以上)，倒出雜交液，用2×SSC+0.1％SDS和1×SSC+0.1％SDS，65℃，各洗膜10min；用保鮮膜包裹尼龍膜後，用X-光膠片進行放射自顯影；-80℃曝光3-7天後，按常規洗片，顯示雜交帶的位置。
2、原位雜交
利用DIG T7/SP6 Labeling kit(Roche)，通過體外轉錄的方法標記OsRAA1 mRNA的正義和反義探針。
水稻組織的石蠟切片材料經FAA固定後分別經系列乙醇脫水30min；再經過系列二甲苯-乙醇的混合物透明、浸蠟、包埋後，製備7μm厚切片，粘附於沒有RNase汙染的載玻片上。將粘好材料的片子分別經過100％二甲苯2×20min、以及2/3二甲苯-1/3乙醇、1/3二甲苯-2/3乙醇、100％、100％、90％、70％、50％、30％、10％乙醇、ddH2O、ddH2O，每步2min；轉入37℃預熱的，含1-5μg/ml蛋白酶K(Roche)的蛋白酶K buffer中，37℃處理30min；用DEPC處理後滅活的dd H2O洗3次；將片子放入剛剛混合好的乙醯化溶液(0.25％乙酸酐(Sigma)、100mM pH8.0的三乙醇胺(Sigma))中，5min；2×SSC處理2×5min；10％、30％、50％、70％、90％、100％、100％乙醇每步處理2min；42℃晾乾片子，每張載玻片上加100-200μl雜交液，用parafilm膜輕輕覆蓋，在42℃溼室中雜交過夜；4×SSC漂洗4×5-10min；轉入37℃預熱的，含25μg/ml RNase A(Sigma)的RNase buffer(500mM NaCl、1mM EDTA、10mM Tris-HCl pH7.5)中，37℃處理30min；RNase buffer 37℃漂洗3×15min；800ml 2×SSC漂洗2×30min；800ml 0.1×SSC漂洗30min；轉入1×PBT，平衡5min；1/20×Blocking solution(用1×PBT稀釋)封閉30-60min；1×PBT，平衡1min；加入Antibody(Roche)solution，在溼室中放置30-120min；250ml 1×PBT，漂洗2×20min；換成TNM50室溫平衡5min；在載玻片上加顯色液(BCIP∶NBT∶稀釋液＝1∶1∶50)，暗中顯色；顯色合適後，如前所述梯度脫水；然後依次1/3二甲苯-2/3乙醇、2/3二甲苯-1/3乙醇、100％二甲苯、100％二甲苯每步1-2min透明；封片觀察。
實施例4、OsRAA1基因的超表達表型觀察水稻OsRAA1基因正義及反義RNA植物表達載體的構建將測序驗證的RT-pCR片段用Pst I和BamH I酶解後連接到pBlueSK質粒上，再用Kpn I和SacI切下目的片段，連接到pUN1301質粒的Kpn I和Sac I位點之間，構建成為由玉米泛素蛋白啟動子驅動的OsRAA1正義植物表達載體。通過農桿菌轉化水稻，得到轉基因種子。轉基因水稻的種子，經表面消毒後，放置在含有50mg/l潮黴素的1/2 MS培養基上培養(將所有的NO3-離子，用NH4+取代，造成Cl-比正常1/2 MS有所增加，為了增加培養基透明度，凝水劑為Gerite(Sigma)。10小時光照，14小時黑暗。
9天後統計不定根數目，結果如圖2所示，其中A是萌發12天幼苗根系，B是抽穗後根系，圖A和圖B中，位於右側的是轉基因植物，位於左側的是相同栽培條件下的對照。從圖中可以看出，轉基因植物比對照植物有更多的不定根，每棵轉基因植物平均比對照多兩條以上的根，而且轉基因植物的根比對照約長0.5cm。
序列表16022101211330212DNA213稻屬水稻(Oryza sativa)4001atgtcagggg tttgggtgtt caagaacggg gtggtgagat tggtggagaa50gcagcaggcg acggcgggga cggcggtggc gggagggagg aggaaggcgc100tggtgcacac gccgagcggg caggtggtgt cgtcgtacgc ggcgctggag150gcgcggctga cggcgctcgg gtgggagcgc tactacgagg acccctccct200cttccagttc cacaagcgtg gctccctcga cctcatctcc ctccccgccg250acttctccgc cttctcctcc gtccacatgt acgacatcgt cgtcaagaac300cgcgactcct tccgcgtcgt cgacgcctaa 3302102211109212PRT213稻屬水稻(Oryza sativa)4002Met Ser Gly Val Trp Val Phe Lys Asn Gly Val Val Arg Leu Val15 10 15Glu Lys Gln Gln Ala Thr Ala Gly Thr Ala Val Ala Gly Gly Arg20 25 30Arg Lys Ala Leu Val His Thr Pro Ser Gly Gln Val Val Ser Ser35 40 45Tyr Ala Ala Leu Glu Ala Arg Leu Thr Ala Leu Gly Trp Glu Arg50 55 60Tyr Tyr Glu Asp Pro Ser Leu Phe Gln Phe His Lys Arg Gly Ser65 70 75Leu Asp Leu Ile Ser Leu Pro Ala Asp Phe Ser Ala Phe Ser Ser80 85 90Val His Met Tyr Asp Ile Val Val Lys Asn ArgAsp Ser Phe Arg95 100105Val Val Asp Ala109
權利要求
1.一種控制植物根系發育的基因OaRAA1，它是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。
2.根據權利要求1所述的基因，其特徵在於所述與水稻根系發育有關的基因OsRAA1，具有序列表中序列1的DNA序列。
3.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於該基因的讀碼框為自3』端第1988到第2316位鹼基。
4.一種由權利要求1所述的基因OsRAA1編碼的蛋白質，它具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列或將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。
5.根據權利要求4所述的蛋白質，其特徵在於它具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列。
6.含有權利要求1所述基因的表達載體。
7.含有權利要求1所述基因的細胞系。
8.權利要求1所述的基因在水稻育種中的應用。
全文摘要
本發明公開了一個與水稻根系發育有關的基因及其編碼產物與應用。與水稻根系發育有關的基因OsRAA1是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有80％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。由上述基因OsRAA1編碼的蛋白質，具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列或將序列2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與序列2的胺基酸殘基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白質。該基因可被生長素誘導表達，並能控制水稻根系的生長發育，對於培養優良的作物品種具有重要的理論及實際意義。
文檔編號C07K14/415GK1483821SQ0213075
公開日2004年3月24日 申請日期2002年9月20日 優先權日2002年9月20日
發明者種康, 葛磊, 徐雲遠, 陳惠 , 趙原, 許明麗, 許智宏, 譚克輝, 種 康 申請人:中國科學院植物研究所