微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶的方法
2023-06-25 08:08:41 1
專利名稱：微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學等領域，具體涉及一種低溫生 澱粉糖化酶微生物發酵生產方法。該發明生產的低溫生澱粉糖化酶主要應用於糧食加工、 食品工業、釀造、發酵、紡織工業、醫藥行業以及其它澱粉糖化酶應用行業。可以提高原料的 利用率、轉化率和生產率，降低生產成本，改善並提高產品質量。
背景技術：
生澱粉糖化酶是指能將不經過蒸煮糊化的生澱粉直接水解成葡萄糖的酶類，其作 用特點是能夠將澱粉糖化傳統工藝中的糊化、液化、糖化三步合併為一步(王歲樓，食品與 發酵工業，1988)。生澱粉糖化酶作為生物製劑，已經廣泛應用於糧食加工、食品工業、釀 造、發酵、紡織工業、醫藥行業以及其它澱粉糖化酶應用行業。國內外對生澱粉糖化酶進行 了大量的工作，目前應用的生澱粉糖化酶主要為中溫和高溫生澱粉糖化酶，研究主要集中 在中溫生澱粉糖化酶高效菌株選育、發酵條件優化等(Haiyan Sun, et al. Appl Biochem Biotechnol，2009)。有關低溫生澱粉糖化酶的研究及其產業化、規模化生產和應用還未見 報導。低溫生澱粉糖化酶與高溫、中溫生澱粉糖化酶相比具有很大的應用優勢，因為低溫 生澱粉糖化酶在低溫條件下具有高酶活力及高催化效率；可減少加工工藝，縮短加工過程 的時間並省卻昂貴的加熱或冷卻費用；在節能方面有相當大的優勢；經過溫和的熱處理可 使低溫酶的活力喪失；低溫或適溫處理有助於提高產品品質和質量(朱非等，微生物學報， 2002)，低溫生澱粉糖化酶上述特性有助於其推廣和應用。低溫生澱粉糖化酶的應用將對傳 統的糧食加工、食品、釀造、發酵、紡織品、醫藥等領域產生深遠的影響，利用微生物發酵生 產的低溫生澱粉糖化酶，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量添加於生料發酵、食品加工和多孔 澱粉生產等領域中，在8 20°C處理0. 5 1. 5h，可以提高原料的轉化率13. 5% 22. 6%， 降低了生產成本，改善並提高產品質量。可以從根本上擺脫中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備 和工藝。低溫生澱粉糖化酶將為人類擺脫髮展中所面臨的資源、能源危機以及環境汙染等 問題提供現實的機遇。低溫生澱粉糖化酶具有非常廣闊的開發潛力和應用前景。
發明內容
本發明的目的是提供一種微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶的方法，該方法主要 是微生物經過低溫馴化後，在14 20°C液體發酵生產低溫生澱粉糖化酶的方法，這種生產 方法獲得的低溫生澱粉糖化酶粗酶液活性可以達到140U/mL，如再經過分離和純化，可以得 到不同濃度和純度的酶製劑。當該酶製劑活性為1000U/mL或1000U/g，0. 1%。 0. 5%。的量 應用於生料發酵、食品加工和多孔澱粉生產等領域中，在8 20°C處理0. 5 1.證，可以提 高原料的轉化率13. 5% 22.6%。該酶製劑應用操作簡單、方便、快捷、成本低。可以從根 本上避免中溫、高溫酶的加熱、冷卻設備和工藝。本發明所述的一種微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶的方法具體包括以下步 驟
(1)將產生生澱粉糖化酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將低溫馴化後的生澱粉糖化酶產生菌在14 20°C逐級擴大培養， 製備成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入產酶培養基 中，在14 20°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。本發明中使用的菌種來源於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (CGMCC)，初期活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。生澱粉糖化酶產生菌(例 如，CGMCC菌種編號:1. 2323τ或1. 447或1. 504或3. 2790等)，菌株先活化，再經過逐級低 溫馴化，進行低溫生澱粉糖化酶發酵生產時按本發明方法進行培養。低溫馴化後的菌株斜 面在4°C環境中可保存2個月，用25 45%甘油製成的菌懸液在零下80°C條件下可以長期 保藏。
具體實施例方式實施例一(1)、培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基生澱粉0. 5 5. 0g，蛋白腖0. 1 2. 0g，牛肉膏0. 1
2.0g, NH4NO3O. 5 5. 0g, K2HPO4O. 5 5. 0g, MgSO4. 7Η20 0. 1 2. 0g, FeSO4. 7Η20 0. 01 0. 5g，KCl 0. 1 2. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。其 中生澱粉在105°C下乾熱滅菌2h，然後在常溫下無菌操作加入。③液體種子培養基蛋白腖5. 0 20. Og,酵母膏5. 0 20. Og,葡萄糖0. 5 2. 0g, K2HPO4L 0 5. Og,自來水1. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產酶培養基玉米生澱粉30. 0 100. 0g，牛肉膏10. 0 20. 0g，NaCl 3. 0 5. 0g，FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 2g, K2HP043. 0 5. 0g，MgSO4 · 7Η20 0· 2 2. 0g,自來水 1. 0L, pH值6. 0,121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生玉米澱粉在105°C下乾熱滅菌池，然後在常溫 下無菌操作加入。(2)將產生生澱粉糖化酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC) 提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的生澱粉糖化酶產生菌在14 16°C培養48 72h， 按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積3 5%的接種量接入10L的產酶培養基中，在14 16°C培養120 144h時，即微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 製備成不同活性、純度和劑型的低溫生澱粉糖化酶製劑。實施例二 (1)、培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基生澱粉0. 5 5. 0g，蛋白腖0. 1 2. 0g，牛肉膏0. 1
2.0g, NH4NO3O. 5 5. 0g, K2HPO4O. 5 5. 0g, MgSO4. 7Η20 0. 1 2. 0g, FeSO4. 7Η20 0. 01
0.5g，KCl 0. 1 2. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。其 中生澱粉在105°C下乾熱滅菌2h，然後在常溫下無菌操作加入。③液體種子培養基蛋白腖5. 0 20. Og,酵母膏5. 0 20. Og,葡萄糖0. 5 2. 0g, K2HPO4L 0 5. Og,自來水1. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產酶培養基玉米生澱粉30. 0 100. 0g，牛肉膏10. 0 20. 0g，NaCl 3. 0 5. 0g，FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 2g, K2HP043. 0 5. 0g，MgSO4 · 7Η20 0· 2 2. 0g,自來水 1. 0L, pH值6. 0,121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生玉米澱粉在105°C下乾熱滅菌池，然後在常溫 下無菌操作加入。(2)將產生生澱粉糖化酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC) 提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的生澱粉糖化酶產生菌在16 18°C培養48 72h， 按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積5 7%的接種量接入50L的產酶培養 基中，在16 18°C培養96 120h時，即微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 製備成不同活性、純度和劑型的低溫生澱粉糖化酶製劑。實施例三(1)、培養基製備①菌種活化培養基蛋白腖10. 0g，牛肉膏3. 0g, NaCl 5. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水
1.0L, pH 值 7. 0，121°C 高壓蒸氣滅菌 30min。②菌種低溫馴化培養基生澱粉0. 5 5. 0g，蛋白腖0. 1 2. 0g，牛肉膏0. 1
2.0g, NH4NO3O. 5 5. 0g, K2HPO4O. 5 5. 0g, MgSO4. 7Η20 0. 1 2. 0g, FeSO4. 7Η20 0. 01 0. 5g，KCl 0. 1 2. 0g，瓊脂20. 0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。其 中生澱粉在105°C下乾熱滅菌2h，然後在常溫下無菌操作加入。
③液體種子培養基蛋白腖5. 0 20. Og,酵母膏5. 0 20. Og,葡萄糖0. 5 2. 0g, K2HPO4L 0 5. Og,自來水1. 0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。④產酶培養基玉米生澱粉30. 0 100. 0g，牛肉膏10. 0 20. 0g，NaCl 3. 0 5. 0g，FeSO4 · 7Η20 0. 01 0. 2g, K2HP043. 0 5. 0g，MgSO4 · 7Η20 0· 2 2. Og,自來水 1. 0L, pH值6. 0,121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生玉米澱粉在105°C下乾熱滅菌池，然後在常溫 下無菌操作加入。(2)將產生生澱粉糖化酶的菌種，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC) 提供的菌株說明進行初始活化；(3)將(2)活化好的菌種逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(4)按常規方法將低溫馴化後的生澱粉糖化酶產生菌在18 20°C培養48 72h， 按5%的接種量進行逐級擴大培養，製備成液體一級種子和二級種子；(5)將(4)製備的二級種子按發酵液體積7 9%的接種量接入100L的產酶培養 基中，在18 20°C培養72 96h時，即微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶結束；(6)將(5)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶 液；(7)根據不同需要和使用對象不同，將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化， 製備成不同活性、純度和劑型的低溫生澱粉糖化酶製劑。實施例四按實施例一、二和三方法生產的低溫生澱粉糖化酶製劑，平均酶活性為1000U/mL， 將活性為1000U/mL或1000U/g的低溫生澱粉糖化酶製劑，按原料重量0. 1%。 0. 5%。的量 添加於生料發酵、食品加工和多孔澱粉生產等領域中，在8 20°C處理0. 5 1.證，可以提 高原料的利用率、轉化率和生產率，降低生產成本，改善並提高產品質量。低溫生澱粉糖化 酶應用部分實驗結果見下表。
權利要求
1.一種微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶的方法，其包括以下步驟(1)將產生生澱粉糖化酶的微生物逐級低溫馴化，馴化溫度由高到低， 250C- 220C- 200C- 181614°C，使其在低溫環境中生長良好；(2)按常規方法將低溫馴化後的生澱粉糖化酶產生菌在14 20°C逐級擴大培養，製備 成液體一級種子和二級種子；(3)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3 9%接種量接入液體發酵培養基 中，在14 20°C培養72 144h時，即微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶結束；(4)將(3)的發酵液在4，000 8，OOOrpm離心收集液體，收集到的液體即為粗酶液；(5)根據不同需要和使用對象不同，將(4)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備 成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其中菌種低溫馴化培養基、液體種子培養基、產酶培養 基分別為(1)菌種低溫馴化培養基生澱粉0.5 5.0g，蛋白腖0. 1 2. 0g，牛肉膏0. 1 2. Og, NH4NO3 0. 5 5. 0g，K2HPO4 0. 5 5. 0g，MgSO4. 7Η20 0· 1 2. 0g，FeSO4. 7H20 0· 01 0. 5g, KCl 0. 1 2.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生 澱粉在105°C下乾熱滅菌池，然後在常溫下無菌操作加入。(2)液體種子培養基蛋白腖5.0 20. Og,酵母膏5. 0 20. Og,葡萄糖0. 5 2. Og, K2HPO4 1.0 5.0g，自來水1.0L，pH值自然，121°C高壓蒸氣滅菌30min。(3)產酶培養基玉米生澱粉30.0 100. 0g，牛肉膏10. 0 20. 0g, NaCl 3. 0 5. Og, FeSO4 · 7H20 0. 01 0. 2g, K2HPO4 3. 0 5. 0g, MgSO4 · 7Η20 0. 2 2. Og,自來水 1. 0L, pH 值6. 0,121°C高壓蒸氣滅菌30min。其中生玉米澱粉在105°C下乾熱滅菌池，然後在常溫下 無菌操作加入。
全文摘要
本發明所述的一種微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶的方法是將產生生澱粉糖化酶的微生物逐級低溫馴化，使其在低溫環境中生長良好；將低溫馴化後的生澱粉糖化酶產生菌在14～20℃逐級擴大培養，按發酵液體積的3～9％接種量接入液體發酵培養基中，在14～20℃培養72～144h時，即微生物發酵生產低溫生澱粉糖化酶結束；發酵液在4,000～8,000rpm離心收集液體，收集的液體即為粗酶液；根據不同需要和使用對象不同，將粗酶液進一步濃縮、分離純化，製備成不同活性、純度和劑型的酶製劑。
文檔編號C12N9/24GK102093989SQ201010162658
公開日2011年6月15日 申請日期2010年4月9日 優先權日2009年12月11日
發明者馮旭明, 孫子羽, 張慶芳, 遲乃玉 申請人:大連大學