一種藻類來源的植酸酶phyn2及其基因和應用的製作方法

2023-06-25 09:16:06 1

專利名稱：一種藻類來源的植酸酶phyn2及其基因和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種藻類來源的植酸酶PHYN2及其基因、包含該基因的重組載體和應用。
背景技術：
植酸酶是一類能水解植酸的酶類。它能將植酸磷降解為肌醇和磷酸。單胃畜禽和淡水魚類飼料中都需要使用植酸酶，但它們對植酸酶的性質有不同的要求。對單胃畜禽而言，植酸酶的主要作用場所是單胃動物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性條件下要有較高的酶活性，即酶反應的最適pH值為酸性的植酸酶。對於淡水養殖的主要魚類一鯉科魚類，因為它們無胃，只有PH值呈中性(pH6.5 8.0)的腸道，因而在魚類飼料中必需使用在中性PH值條件下有高活性的植酸酶。目前商品化生產的用於單胃畜禽的植酸酶在中性pH值環境下基本沒有酶活性，因而不能用於鯉科魚類飼料。植酸酶廣泛存在於微生物中，如枯草芽孢桿菌、假單孢桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌、酵母及麴黴等。藻類生物數量龐大，且其生物特性呈現多樣化，利用藻類可以生產許多稀有的天然活性物質，如色素、抗生素、抗病毒和真菌類藥物、抗癌藥物，以及微藻脂肪酸、多糖、維生素和留醇等，因此利用藻類獲得新型植酸酶也將是其開發應用的重要領域之一。據了解，到目前為止，還沒有來源於藻類的植酸酶基因的表達及性質研究的報導。從整個植酸磷的循環模式來看，植酸磷可從陸地環境轉移進入水體環境中，特別是在養殖業密集的區域，由於大量植物性日糧中的植酸，在單胃動物消化道中沒有被水解，而隨著糞便被排洩到體外，這些高植酸含量的糞便直接進入農田，但大部分植物並不能直接利用植酸，這些植酸會隨著雨水流入附近的水域，而水域中的藻類可以利用植酸磷作為磷源，迅速生長造成赤潮和水體富營養化。所以，我們推測養殖業密集的區域的水體環境發生赤潮和富營養化，與藻類能直接利用植酸有一定的關係。

發明內容
本發明的目的是提供一種藻類來源的植酸酶。本發明的再一目的是提供上述藻類來源的植酸酶的基因。本發明的再一目的是提供包括上述植酸酶基因的重組載體。本發明的再一目的是提供上述植酸酶基因的重組菌株。根據本發明的含藻類來源植酸酶的重組菌株，所述植酸酶的胺基酸序列如SEQIDN0.1，其保藏編號為CGMCC N0.3496。根據本發明的含藻類來源植酸酶的重組菌株，所述植酸酶的胺基酸序列如SEQIDN0.2，其保藏編號為CGMCC N0.3494。根據本發明的含藻類來源植酸酶的重組菌株，所述植酸酶的胺基酸序列如SEQIDN0.3，其保藏編號為CGMCC N0.3495。本發明的再一目的是提供製備上述植酸酶的方法。
本發明的再一目的是提供上述植酸酶的用途。根據本發明的藻類來源的植酸酶，為中性、其結構域為β_摺疊桶狀。根據本發明的藻類來源的植酸酶，其中，所述藻類藍藻，優選所述藍藻為點狀念珠藻、無類囊體藍藻、或念珠藻。根據本發明的藻類來源的植酸酶，其中，所述植酸酶的胺基酸序列如SEQ IDN0.1、SEQ ID N0.2、或 SEQ ID N0.3 所示。本發明提供了編碼上述藻類來源的植酸酶的基因，其中，所述植酸酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、或 SEQ ID N0.6 所示。本發明還提供了包含上述植酸酶基因的重組載體。本發明還提供了包含上述植酸酶基因的重組菌株。根據本發明的製備上述植酸酶的方法包括以下步驟:I)構建上述包含植酸酶基因的重組載體；2)轉化宿主菌，並表達；3)分離純化得到所述植酸酶。根據本發明的藻類來源的植酸酶可以用於魚類飼料。

本發明首次對藻類來源的植酸酶基因進行了表達及酶學性質的研究，並證明了來源於藻類(如點狀念珠藻N.punctiforme和無類囊體藍藻G.violaceus)的植酸酶基因都能夠在大腸桿菌表達系統中成功表達。表達得到的重組蛋白都能對植酸具有較好的水解作用，說明本發明獲得的藻類來源的植酸酶基因都是具有植酸水解功能的基因。酶學性質的分析，表明該植酸酶結構域具有典型的BPP (beta-摺疊桶狀植酸酶)植酸酶的特性，在中性條件下具有較高的催化活性，Ca2+對其的活性和熱穩定性都具有重要影響，最適反應Ca2+濃度為1.5mM，最適反應pH為6.0，最適反應溫度為45° C。從以上結果，我們可以推測出藻類來源的植酸酶為中性植酸酶，可以用於水產動物的飼養。


圖1 植酸酶結構域 PhyNl-pd(圖 Ι-a)、植酸酶 PhyNl(圖 l_b)、PhyG(圖 l_c)、PhyN2(圖Ι-d)在大腸桿菌中表達及純化的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白質Marker ；1:PhyNl-pd ；2:PhyNl ；2:PhyG ;3:PhyN2。圖2重組植酸酶的最適Ca2+濃度，圖2a:PhyNl-pd ；圖2b =PhyNl ；圖2c =PhyG ；圖2d:PhyN20圖3 重組植酸酶的最適 pH，圖 3a:PhyNl-pd ；圖 3b =PhyNl ；圖 3c =PhyG ;圖 3d:PhyN20圖4重組植酸酶的最適反應溫度，圖4a:PhyNl-pd ；圖4b =PhyNl ；圖4c =PhyG ；圖4d:PhyN20圖5重組植酸酶的熱穩定性，圖5a:PhyNl-pd ；圖5b =PhyNl ；圖5c =PhyG ;圖5d:PhyN2。根據本發明的含藻類來源植酸酶的重組菌株:大腸埃希氏菌phyNl(Escherichiacoli phyNl),所述植酸酶的胺基酸序列如SEQ ID N0.1,其保藏編號為CGMCCN0.3496，保藏於中國微生物菌種保藏委員會普通微生物中心(北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，100101)，保藏日期2009年12月3日。根據本發明的含藻類來源植酸酶的重組菌株:大腸埃希氏菌phyG(Escherichiacoli phyG)，所述植酸酶的胺基酸序列如SEQ ID N0.2，其保藏編號為CGMCCN0.3494。根據本發明的含藻類來源植酸酶的重組菌株:大腸埃希氏菌phyN2(Escherichiacoli phyN2)，所述植酸酶的胺基酸序列如SEQ ID N0.3，其保藏編號為CGMCCN0.3495。
具體實施例方式實驗條件:1、菌株及載體:點狀念珠藻Nostocpunctiforme美國標準菌種收藏所ATCC29133,無類囊體藍藻Gloeobacter violaceus美國標準菌種收藏所ATCC 29082,及念珠藻Nostoc sp.美國標準菌種收藏所ATCC 27893為公知菌株。大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)、表達載體pET-22b (+)(購自 Novagen 公司)。2、酶類及其他生化試劑:內切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。PNPGal、植酸鈉等底物購自Sigma公司，其它都為國產試劑。3.培養基:大腸桿菌培養基為LB (1%蛋白腖、0.5%酵母提取物、l%NaCl，pH7.0)。本發明中所用到 重組遺傳學技術均為本領域中的常規技術。在以下實施例中未作詳細介紹的技術，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關章節或部分來進行，包括:Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3版.2001) ；Kriegler, GeneTransfer and Expression:A Laboratory Manual(1990)；和 Current ProtocolsinMolecular Biology (Au sub el 等人編，1994)。實施例1點狀念珠藻Nostoc punctiforme ATCC 29133的培養及其基因組DNA的提取用250mL三角瓶裝IOOmL BGl I培養基(IOOmL中含有NaN03150mg, KH2P044mg, MgSO4.7H20 7.5mg, CaCl23.6mg,梓檬酸 0.6mg,梓檬酸鐵銨 0.6mg,EDTA0.lmg, Na2C032mg, H3B03286ng, MnCl2.4H20 181ng, ZnSO4.7H20 22.2ng, CuSO4.5H207.4ng, MoO3 1.5ng),接種0.1g溼藻泥，40001ux連續光照，溫度為24°C，反覆式搖床培養20天，紗布過濾，並用濾紙吸乾多餘水分用作DNA提取的材料。培養獲得藻泥重懸於Iml 0.25mol/l的EDTA緩衝液中(pH8.0), 37°C溫育30min，加入0.1ml 10%的N-十二烷基肌氨酸鈉(sarkosyl)溶液，繼續溫育15min，離心收集細胞沉澱，重懸於0.4ml重蒸水中，加入0.1ml溶菌酶(10mg/ml), 37°C溫育2小時，再加入0.1ml10%SDS溶液並輕輕晃動至樣品澄清，加入等體積的苯酚抽提，再用苯酚/氯仿混合液抽提，最後用氯仿抽提2次。加入2倍體積的預冷乙醇沉澱DNA，離心後溶於TE緩衝液，用於基因的克隆。實施例2點狀念珠藻Nostoc punctiforme ATCC 29133植酸酶編碼基因的克隆使用Pfam 蛋白質家族網站(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/)的β-摺疊桶植酸酶家族的所有植酸酶序列進行比對分析，可以發現在BPP植酸酶中存在兩個相對比較保守的區域:D-A-[A/T/E]-D-D-P-A-[I/L/V]-W 和 N_N-[V/I]-D_[I/L/V] -R- [Y/D/Q]。在BBP植酸酶中，前一個保守區域是鈣離子的結合位點，後一個保守區域在BBP植酸酶序列是催化活性中心，這兩個區域在BPP植酸酶中非常保守。利用CODEHAPprimer設計的基本原理，根據這兩個保守區域設計一組簡併引物。在保證特異性擴增植酸酶基因的前提下，為了使引物能夠與潛在的更多植酸酶基因配對結合，將設計的簡併引物利用 Harvard Medical School 的 MS-BLAST(http://genetics, bwh.harvard, edu/msblast/)進行BLAST比對分析，然後根據比對結果優化引物序列使之能與更多的植酸酶基因配對結合。最終設計確定了 BPP植酸酶的簡併引物BPP-F，5' -GACGCCGAYGAYCCNGCNITNTGG-3'和 BPP-R, 5' -CAGGSCGCANRTCIACRTTRTT-3'。(Y 代表 C 或 T ;R 代表 A 或 G ;S 代表C或G ;N代表A，C，G或T ; I代表A，C，G或T)。以念珠藻基因組DNA為模板，利用降落PCR的方法來擴增目標植酸酶基因片段對引物的可行性進行驗證。反應體系包括:
權利要求
1.一種藻類來源的植酸酶PHYN2，所述植酸酶的胺基酸序列如SEQ ID N0.3。
2.一種藻類來源的植酸酶基因phyN2，其特徵在於，編碼權利要求1所述的植酸酶。
3.根據權利要求1所述的植酸酶基因phyN2，其特徵在於，所述植酸酶基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
4.一種含藻類來源植酸酶的重組菌株，其特徵在於，所述植酸酶的胺基酸序列如SEQID N0.3，其保藏編號為 CGMCC N0.3495。
5.根據權利要求1所述植酸酶PH YN2用於水解植酸的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種藻類來源的植酸酶及其基因、包含該基因的重組載體和應用。根據本發明的藻類來源的植酸酶，其中，所述藻類藍藻，優選所述藍藻為點狀念珠藻、無類囊體藍藻、或念珠藻。本發明首次對藻類來源的植酸酶基因進行了表達及酶學性質的研究，並證明了來源於藻類的植酸酶基因都能夠在大腸桿菌表達系統中成功表達。表達得到的重組蛋白都能對植酸具有較好的水解作用，說明本發明獲得的藻類來源的植酸酶基因都是具有植酸水解功能的基因。
文檔編號C12R1/19GK103114081SQ20121044123
公開日2013年5月22日 申請日期2009年12月15日 優先權日2009年12月15日
發明者姚斌, 黃火清, 楊培龍, 羅會穎, 石鵬君, 袁鐵錚, 王亞茹, 柏映國, 孟昆, 史秀雲 申請人:中國農業科學院飼料研究所