包含水包油乳液佐劑的疫苗的製作方法

2023-06-25 02:37:06 1

專利名稱：：包含水包油乳液佐劑的疫苗的製作方法
技術領域：
：本發明涉及改善的疫苗和免疫原性組合物及其在藥物中的用途。本發明尤其涉及包含水包油乳液佐劑的疫苗或者免疫原性製劑及其在藥物中的用途，尤其是其在增強對各種抗原的免疫應答方面的用途，並涉及製備方法，其中所述水包油乳液包含母育酚、可代謝油和乳化劑。
背景技術：
：始終需要具有改善的免疫原性的新組合物或者疫苗。作為一種策略，佐劑已經被用於嘗試和改善對任意給定抗原產生的免疫應答和/或降低宿主中的反應原性/毒性。水包油乳液實質上是本領域公知的，已經被建議用作佐劑組合物(EP399843;WO95/17210)。WO95/17210公開了包含2到10%角鯊烯，2到10。/oa生育盼和0.3到3%Tween80的水包油乳液，以及其單獨的或者與QS21和/或3D-MPL組合的用途。W099/12565公開了包含可代謝油、皂苷和甾醇的水包油乳液組合物。所述水包油乳液還包含3D-MPL。W099/11241公開了包含可代謝油和皂苷的水包油乳液，其中油和急苷以1:1到200:1之間的比例存在。仍然需要改善的疫苗和免疫原性組合物，以便提供合適的免疫應答並且在宿主中是較低反應原性的。發明陳述本發明人發現，可以使用包含更低量的水包油乳液各組分的疫苗或者免疫原性組合物，並且仍然保持抗所述組合物內抗原或者抗原組合物的類似免疫應答。這具有以下優點保持針對抗原的免疫原性水平，並且降低宿主受體內的反應原性。因此，在本發明的第一個方面，提供包含抗原或者抗原組合物和6佐劑組合物的免疫原性組合物，所述佐劑組合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代謝油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化劑，每人劑量。在本發明的另一方面，提供包含抗原或者抗原組合物和佐劑組合物的疫苗組合物，所述佐劑組合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代謝油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化劑，每人劑量。在本發明的另一方面，提供疫苗或者免疫原性組合物在製備用於預防感染和/或疾病的免疫原性組合物中的用途，所述疫苗或者免疫原性組合物包含抗原或者抗原組合物和佐劑組合物，所述佐劑組合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代謝油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化劑。在另一方面，提供用於預防由病原體引起的感染或者疾病的方法或者如上文所述的用途，所述病原體是作為所述免疫原性組合物中抗原來源的病原體的變體。在另一個實施方案中，提供用於預防由病原體引起的感染或者疾病的方法或者如上文所述的用途，所述病原體包含一種抗原，所述抗原是免疫原性組合物中所述抗原的變體。附圖簡述圖i:臨床試驗不同時間點(用於免疫原性的ATP群組)抗HA抗體的幾何平均滴度(GMT)。圖2:臨床試驗第o天和21天(用於免疫原性的ATP群組)具有95%置信區間的HI抗體滴度的血清保護率(SPR)。圖3:臨床試驗第21天(用於免疫原性的ATP群組)具有95%置信區間的HI抗體滴度的血清轉化率(SCR)。圖4:臨床試驗第21天(用於免疫原性的ATP群組)具有95%置信區間的HI抗體滴度的血清轉化因子(SCF)。圖5:小鼠研究用異種亞型株(劑量範圍AS03)初免(primed)的BALB/c小鼠的血細胞凝集抑制試驗(GMT+/-IC95)。圖5A:抗-A/新喀裡多尼亞(NewCaledoma)/20/99HI滴度；圖5B:抗-A/巴拿馬(Panama)/2007/99HI滴度。圖5C:抗-B/山東(Shandong)/7/97HI滴度。圖6:小鼠研究用異種亞型株(劑量範圍AS03)初免的C57BI/67小鼠的血細胞凝集抑制試驗(GMT+/-IC95)。圖7:小鼠研究用異種亞型抹(劑量範圍AS03)初免的C57BI/6小鼠的細胞免疫應答(CD4+T細胞)。圖8:小鼠研究C57BI/6小鼠PBMC中的細胞免疫應答(CD4十T細胞)，所述小鼠用異種亞型林初免，並用劑量範圍AS03佐劑化的低劑量抗原(0.5pg)免疫。圖9:小鼠研究兩種不同抗原劑量1.5pg(A、C和E)或者0.38pg(B,D和F)免疫後第14天，H5Nl-特異性血清IgELISA滴度(A和B)以及抗H5N1IgGl(C和D)和IgG2b(E和F)同型應答(GMT+/-IC95)。圖10:小鼠研究兩種不同抗原劑量1.5pg(A)或者0.38pg(B)免疫後第21天的血凝抑制試驗(GMT+AIC95)。圖11:小鼠研究用劑量範圍AS03佐劑化的不同劑量H5N1疫苗(1.5或者0.38pg)免疫的未免疫C57BI/6小鼠的細胞免疫應答(CD4十T細胞)(A)1.5^gHAAg(抗原)或者(B)0.38pgHAAg(抗原)。圖12:豬研究用同源林(劑量範圍AS03)初免的豬的血細胞凝集抑制試驗(GMT+/-IC95)。發明詳述本發明人旨在術語"包括"、"包含"和"含有，，在本文各種情況下任選分別用術語"由...組成"替換。本文關於本發明"疫苗組合物"的實施方案也適用於關於本發明"免疫原性組合物"的實施方案，反之亦然。在本發明的一個實施方案中，提供了包含抗原或者抗原組合物和佐劑組合物的疫苗或者免疫原性組合物，所述佐劑組合物包含水包油乳液，其中所迷水包油乳液包含0.5-10mg可代謝油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化劑，每人劑量。在本發明的另一個實施方案中，提供包含抗原或者抗原組合物和佐劑組合物的疫苗或者免疫原性組合物，所述佐劑組合物包含水包油乳液，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代謝油(諸如角鯊烯)、0.5-11mg母育酚(諸如a-生育酚)和0.4-4mg乳化劑(諸如聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯)，每人劑量。水包油乳液組分本發明的佐劑組合物包含水包油乳液佐劑，優選的所述乳液包含量為0.5-10mg的可代謝油、量為0.5-11mg的母育酚以及量為0.4-4mg的乳化劑，並具有油滴，油滴的至少70%(以強度計)具有小於1pm的直徑。為了使任意水包油組合物適合給人施用，乳液系統的油相必須包含可代謝油。術語可代謝油的含義是本領域公知的。可代謝可以被定義為"能夠通過代謝被轉化"(Dorland'sIllustratedMedicalDictionary,W.B.SandersCompany,第25版(1974))。所述油可以是任意植物油，魚油，動物油或者合成油，它們對受體是無毒的，能夠通過代謝被轉化。堅果、種子和穀物是常用的植物油來源。合成油也是本發明的一部分，可以包括商品化供應的油諸如NEOBEE⑧等。尤其合適的可代謝油是角鯊烯。角鯊烯(2,6,10,15，19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是一種不飽和油，大量存在於鯊魚肝油中，少量存在於橄欖油、麥胚芽油、米糠油和酵母中，是用於本發明特別優選的油。角鯊烯是可代謝油，緣於以下事實其是膽固醇生物合成的中間體(Merckindex,第10版，編目流水號8619)。適宜地，可代謝油以下述量存在於佐劑組合物0.5-10mg,優選的1-10、2-10、3-9、4-8、5-7或者5-6mg(例如2-3、5-6或者9-10mg),尤其是5.35mg或者2.14mg。在本發明另一個實施方案中，可代謝油以下述量存在於疫苗(或者免疫原性)組合物0.5-10mg,優選的1-10、2-10、3-9、4-8、5-7或者5-6mg(例如2-3、5-6或者9-10mg),尤其是5.35mg或者2.14mg。疫苗或者免疫原性組合物中可代謝油的量可以被表示為總組合物的百分比。適宜地，可代i射油以下述量存在油佔組合物總體積的0.5%到2%,優選0.25-2%,或者0.25-1.75%,或者0.5-1.65%,或者0.6-1.5%,或者0.8-1.4%或者1-1.25%(v/v)。在另一個具體實施方案中，可代謝油以疫苗(或者免疫原性)組合物總體積的大約1.25。/。的最終量存在。在另一個具體實施方案中，可代謝油以組合物總體積的大約0.25%(v/v)的最終量存在。為了更清楚，可以通過下列換算因子將以v/v表示的濃度轉換為以w/v表示的濃度5%(v/v)角鯊烯濃度等同於4.28%(w/v)角鯊烯濃度。水包油乳液包含母育酚。母育酚是本領域公知的，描述於EP0382271。適宜地，母育酚是a-生育酚或者其衍生物，諸如a-生育盼琥珀酸酯(亦稱為維生素E琥珀酸酯)。適宜地，所述母育酚以下述量存在於佐劑組合物0.5-11mg，優選的1-11、2-10、3-9、4-8、5-7、5-6(例如10-11、5-6,2.5-3.5或者1-3mg)。在一個具體實施方案中，母育酚以5.94mg或者2.38mg的量存在。在另一個實施方案中，所述母育酚適宜地以下述量存在於疫苗(或者免疫原性)組合物0.5-11mg,優選的1-11、2-10、3-9、4-8、5-6(例如10-11、5-6,2.5-3.5或者l-3mg)。在一個具體實施方案中，母育酚以5.94mg或者2.38mg的量存在。母育酚的量可以被表示為疫苗或者免疫原性組合物總體積的百分比。適宜地，母育酚以免疫原性組合物總體積的0.25%到2。/。(v/v)存在於疫苗組合物，優選地，母育酚佔總體積的0.25-2%,包括0.25-2%,或者0.25-1.75%,或者0.5-1.65%,或者0.6-1.5%,或者0.8-1.4%或者1-1.25%(v/v)。優選地，母育酚以疫苗(或者免疫原性)組合物總體積的0.2%到2%(v/v)的量存在，更優選以0.5ml劑量體積的1.25%(v/v)的量存在。在一個具體實施方案中，母育酚以疫苗或者免疫原性組合物總體積的大約1.25%的最終量存在。在另一個具體實施方案中，母育盼以總體積0.25%(v/v)的最終量存在，或者以0.5ml劑量體積的1.25%(v/v)的最終量存在，或者以0.7ml劑量體積的0.9。/。(v/v)的最終量存在.，或者以0.5ml劑量的0.5y。(v/v)的最終量存在，或者以0.7ml疫苗或者免疫原性劑量的0.35-0.37%、優選0.36%的最終量存在。為了更清楚，可以通過下列換算因子將以v/v表示的濃度轉換為以w/v表示的濃度5%(v/v)oc-生育酚濃度等同於4.8%(w/v)a-生育酚濃度。水包油乳液還包含乳化劑。乳化劑可以適宜的是聚氧乙烯脫水山梨醇單油酸酯。在一個具體實施方案中，乳化劑可以選自Polysorbate80或者Tween80。所述乳化劑適宜地以0.1-5、0.2-5、0.3-4、0.4-3或者2-3mg(例如0.4-1.2、2-3或者4-5mg)乳化劑的量存在於佐劑組合物。在一個具體實施方案中，乳化劑以0.97mg或者2.425mg的量存在。此外，所述乳化劑適宜地以0.1-5,0,2-5、0.3-4、0.4-3或者2-3mg(例如0.4-1.2、2-3或者4-5mg)乳化劑的量存在於疫苗或者免疫原性組合物。在一個具體實施方案中，乳化劑以0.97mg或者2.425mg的量存在。乳化劑的量可以被表示為疫苗或者免疫原性組合物總體積的百分比。適宜地，所述乳化劑以組合物總體積0.125-0.8%(v/v)的量存在於疫苗(或者免疫原性)組合物，優選以總體積的0.08-.05%,或者0.1-0.7%,或者0.2-0.6%,或者0.25-0.55%,或者0.3-0.52%或者0.4-0.5%(v/v)的量存在。在一個具體實施方案中，所述乳化劑以疫苗或者免疫原性組合物總體積的1%、0.5%或者0.2。/。(v/v)的量存在。為了更清楚，可以通過下列換算因子將以v/v表示的濃度轉換為以w/v表示的濃度1.8%(v/v)Polysorbate80濃度等同於1.91%(w/v)Polysorbate80濃度。在一個具體實施方案中，0.5ml疫苗或者免疫原性劑量體積包含0.45%(v/v)Tween80，0.7ml劑量體積包含0.315%(v/v)Tween80。在另一個具體實施方案中，0.5ml劑量包含0.18%(v/v)乳化劑，0.7ml疫苗或者免疫原性組合物劑量包含0.126%(v/v)乳化劑。術語"人劑量，，表示採用適用於人的體積的劑量。通常該劑量在0.25到1.5ml之間。在一個實施方案中，人劑量是0.5ml。在另一個實施方案中，人劑量大於0.5ml，例如0.6、0.7、0.8、0.9或者1ml。在另一個實施方案中，人劑量在1ml到1.5ml之間。在另一個實施方案中，尤其是當免疫原性組合物用於兒科群體時，人劑量可以小於0.5ml,諸如0.25到0.5ml之間。本發明的特徵在於，免疫原性組合物內佐劑的每種或者全部單項組分的水平低於先前認為有效的水平，並且通常如上文所述。尤其合適的組合物包含下列量的下列佐劑組分，採用0.5ml的人劑量終體積ii表1tableseeoriginaldocumentpage12本發明還提供包含上文指定量的上文指定單項組分的佐劑組合物，例如但不唯一的如表1所示。通常這種佐劑組合物將採用適合人劑量的體積。當佐劑採用與抗原組合物液態形式組合的液態形式時，所述佐劑組合物將採用適合人劑量的體積，該體積是人劑量預期終體積的一部分，諸如人劑量預期終體積的一半，例如對於0.7ml的預期人劑量來說是350(xl體積，或者對於0.5ml的預期人劑量來說是250體積。當與抗原組合物組合時，所述佐劑組合物被稀釋以提供疫苗的最終人劑量。這種劑量的終體積顯然是不同的，這取決於佐劑組合物初始體積以及向佐劑組合物中添加的抗原組合物的體積。在選擇性實施方案中，使用液體佐劑重建凍幹的抗原組合物。在該實施方案中，所述佐劑組合物的適合人劑量的體積與人劑量的終體積近似相等。將所述液體佐劑組合物添加到包含凍幹抗原組合物的小瓶中。最終人劑量可以在0.5到1.5ml之間變化。法包括將包含母育酚的油相與表面活性劑諸如PBS/TWEEN80溶液混合，然後利用勻漿器均化，本領域技術人員清楚包括將混合物兩次通過注射器針頭的方法將適用於均化小體積的液體。同樣，本領域技術人員可以使用微射流機(M110SMicroflmdics機，最多50次通過，最大6巴的輸入壓力持續2分鐘(輸出壓力大約850巴))的乳化步驟來產生更小或者更大體積的乳液。可以通過常規實驗包括測量生成的乳液進行改變，直到獲得具有所需直徑的油滴的製劑。在水包油乳液中，油和乳化劑應當在水性載體中。水性載體可以是，例如磷酸鹽緩衝液。優選地，本發明的水包油乳液系統具有亞微米範圍的小油滴粒度。適宜地，油滴的直徑大小在120到750nm範圍內，更優選的在120到600nm範圍內。最優選的，水包油乳液包含油滴，其至少70%(以強度計)的直徑低於500nm，更優選的80%(以強度計)的直徑低於300nm,更優選至少卯％(以強度計)的直徑在120到200nm範圍內。本發明的油滴粒度，即直徑，以強度給出。存在數種以強度測定油滴直徑大小的方法。使用粒度分析裝置測量強度，適宜地通過諸如MalvernZetasizer4000或者優選的MalvernZetasizer3000HS的動態光散射。詳細步驟在實施例II.2中給出。第一種可能性是通過動態光散射(PCS-Photon相關光譜法)測定z平均直徑ZAD;該方法額外給出了多分散指數(PDI),ZAD和PDI這二者均用累積量算法計算。這些值不需要顆粒折射率的信息。第二種方法是通過Contin或者NNLS的另一種算法，或者自動化"Malvern"算法(由粒度分析裝置提供的默認算法)測定整體粒度分布來計算油滴直徑。多數情況下，由於複雜組合物的顆粒折射率是未知的，所以只考慮強度分布，如果有需要，只考慮來源於該分布的強度平均值。任選免疫刺激劑在本發明的另一個實施方案中，提供包含抗原或者抗原組合物和佐劑組合物的疫苗或者免疫原性組合物，所述佐劑組合物包含水包油乳液和任選一種或者多種其他免疫刺激劑，其中所述水包油乳液包含0.5-10mg可代謝油、0.5-11mg母育酚和0.4-4mg乳化劑。在一個實施方案中，佐劑組合物包含本文所述的油水乳液。在另一個實施方案中，佐劑組合物還可以包含一種或者多種其他佐劑或者免疫刺激劑。在另一個實施方案中，佐劑組合物任選包含除QS21和/或MPL之外的一種或者多種其他佐劑或者免疫刺激劑。任選其他佐劑選自皂普，脂質A或者其衍生物，免疫刺激性寡核苷酸，烷基氨基葡糖苷磷酸酯，金屬鹽，toll-樣受體激動劑或者其組合。優選的所述佐劑是Toll樣受體激動劑，尤其是Toll樣受體2，3,4,7,8或者9的激動劑，或者皂苷。進一步優選的，所述佐劑系統包含來自上文列表的兩種或更多種佐劑。組合優選的包含皂苷(尤其是13QS21)佐劑和/或Toll樣受體4激動劑諸如3D-MPL,或者Toll樣受體9激動劑諸如包含CpG的免疫刺激性寡核苷酸。其他優選的組合包含皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4激動劑諸如皂苷(尤其是QS21)和Toll樣受體4配體諸如3D-MPL或者烷基氨基葡糖苷磷酸酯。在一個實施方案中，其他佐劑是Toll樣受體(TLR)4配體，優選的是激動劑諸如脂質A衍生物，尤其是單磷酸脂A,或者更尤其是3脫醯單磷醯脂質A(3D-MPL)。3D-MPL購自GlaxoSmithKlineBiologicalsNorthAmerica,商標為MPL，其主要促進具有IFN-g(Thl)表型的CD4+T細胞應答。其可以按照GB2220211A公開的方法製備。在化學上，其是具有3、4、5或者6條醯化鏈的3-脫醯單磷醯脂質A。優選的，在本發明的組合物中使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL具有的粒度使其可以通過0.22|tim濾器過濾除菌。這種製劑描述於國際專利申請號WO94/21292。脂質A的合成衍生物是已知的，並且被認為是TLR4激動劑，包括但不限於OM174(2-脫氧-6-o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二烷醯氧基十四烷醯基氨基]_4-0-膦醯基-P-0-吡喃葡糖基]-2-[(11)-3-羥基四癸醯基氨基]-01-0-吡喃葡糖基二氬磷酸酯)，(WO95/14026)OM294DP(3S,9R)-3-[(R)-十二烷醯氧基十四烷醯基氨基]-4-氧代-5-氮雜-9(11)-[(11)-3-羥基十四烷醯基氨基]癸-1，10-二醇,1，10-雙(二氫磷酸酯)(WO99/64301和WO00/0462)OM197MP-AcDP(3S-,9R)-3-[(R)-十二烷醯氧基十四烷醯基氨基]_4-氧代-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四烷醯基氨基]癸-l,10-二醇，l-二氫磷酸酯10-(6-氨基己酸酯)(WO01/46127)可以使用的其他TLR4配體是烷基氨基葡糖苷磷酸酯(AGP),諸如WO9850399或者US6303347公開的那些(製備AGP的步驟也被公開)，或者如US6764840公開的藥學上可接受的AGP鹽。一些AGP是TLR4激動劑，而一些AGP是TLR4拮抗劑。這二者被認為均可用作佐劑。其他合適的能夠通過TLR-4引起信號轉導反應的TLR-4配體(Sabroe等人，JI2003pl630-5)是，諸如，來自革蘭氏陰性菌的脂多糖及其衍生物，或者其片段，尤其是LPS的無毒衍生物(諸如3D-MPL)。其他合適的TLR激動劑是熱休克蛋白(HSP)10、60、65、70、75或者90;表面活性蛋白A,透明質酸寡糖，硫酸乙醯肝素片段，纖維連接蛋白片段，纖維蛋白原肽和b-防衛素-2，胞壁醯二肽(MDP)或者呼吸道合胞病毒的F蛋白。在一個實施方案中，TLR激動劑是HSP60、70或者90。Toll-樣受體(TLR)是I型跨膜受體，在昆蟲和人之間是進化保守的。到目前為止已經確定了lO種TLRs(TLRs1-10)(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。TLR家族的成員具有相似的胞外和胞內結構域；已經證明它們的胞外結構域具有富含亮氨酸的重複序列，它們的胞內結構域類似於白介素-1受體(IL-1R)的胞內區。TLR細胞在免疫細胞和其他細胞(包括血管上皮細胞，脂肪細胞，心肌細胞和腸上皮細胞)之間的表達是有差異的。TLR的胞內結構域可以與接頭蛋白Myd88相互作用，而Myd88在其胞質區具有IL-1R結構域，導致細胞因子的NF-kB激活；TLR激活通過這種Myd88途徑影響細胞因子釋放。TLR主要在諸如抗原遞呈細胞的細胞類型(例如樹突狀細胞，巨噬細胞等等)中表達。通過TLR刺激的樹突狀細胞激活導致樹突狀細胞的成熟，以及炎性細胞因子諸如IL-12的生成。到目前為止進行的研究已經發現TLRs識別不同類型的激動劑，儘管一些激動劑是數種TLR共有的。TLR激動劑主要來自細菌或者病毒，包括分子諸如鞭毛蛋白或者細菌脂多糖(LPS)。"TLR激動劑"表示作為直接配體，或者間接通過內源或者外源配體的產生，能夠通過TLR信號轉導途徑引起信號轉導反應的組分(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。在另一個實施方案中，TLR分子的其他天然或者合成激動劑被用作任選其他免疫刺激劑。這些可以包括，但不限於TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激動劑。在本發明的一個實施方案中，使用能夠通過TLR-1引起信號轉導反應的TLR激動劑(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。適宜地，能夠通過TLR-1引起信號轉導反應的TLR激動劑選自三醯脂肽(LPs);酚可溶性調控蛋白；結核分枝桿菌LP;S-(2,3-雙(棕櫚醯基氧基)-(2-RS)-丙基)-N-椋櫚醯基-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH,三鹽酸化(Pani3Cys)LP,其模擬細菌脂蛋白的乙醯化氨基末端以及博氏疏螺旋體的OspALP。在另一個實施方案中，使用能夠通過TLR-2引起信號轉導反應的TLR激動劑(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。適宜地，能夠通過TLR-2引起信號轉導反應的TLR激動劑是以下物質的一種或者多種來自結核分枝桿菌(Mtuberculosis)、博氏疏螺旋體(Bburgdorferi),梅毒螺旋體(Tpallidum)的脂蛋白、肽聚糖、細菌脂肽；來自包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的種屬的肽聚糖；脂磷壁酸，甘露糖醛酸，奈瑟氏菌孔蛋白，細菌菌毛，耶爾森氏菌毒性因子CMV病毒粒子，嚢蟲血細胞凝集素和酵母的酵母聚糖。在一個選擇性的實施方案中，使用能夠通過TLR-3引起信號轉導反應的TLR激動劑(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。適宜地，能夠通過TLR-3引起信號轉導反應的TLR激動劑是雙鏈RNA(dsRNA),聚肌胞苷酸(PolyIC),與病毒感染有關的分子核酸模式。在一個選擇性的實施方案中，使用能夠通過TLR-5引起信號轉導反應的TLR激動劑(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。適宜地，能夠通過TLR-5引起信號轉導反應的TLR激動劑是細菌鞭毛蛋白。在一個選擇性的實施方案中，使用能夠通過TLR-6引起信號轉導反應的TLR激動劑(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。適宜地，能夠通過TLR-6引起信號轉導反應的TLR激動劑是分枝桿菌脂蛋白，二醯化LP和酚可溶性調控蛋白。其他的TLR6激動劑描述於WO2003043572。在一個選擇性的實施方案中，使用能夠通過TLR-7引起信號轉導反應的TLR激動劑(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。適宜地，能夠通過TLR-7引起信號轉導反應的TLR激動劑是單鏈RNA(ssRNA)，loxonbine,在N7和C8位的鳥苷類似物，或者咪唑並喹啉化合物，或者其衍生物。在一個實施方案中，TLR激動劑是咪喹莫特。其他的TLR7激動劑描述於WO02085905。在一個選擇性的實施方案中，使用能夠通過TLR-8引起信號轉導反應的TLR激動劑(Sabroe等人，JI2003pl630-5)。適宜地，能夠通過TLR-8引起信號轉導反應的TLR激動劑是單鏈RNA(ssRNA),具有抗病毒活性的咪唑並喹啉分子，諸如瑞喹莫德(R848);瑞喹莫德還能夠被TLR-7識別。其他可以使用的TLR-8激動劑包括在WO2004071459中描述的那些。還可以使用免疫刺激性寡核苷酸或者任意其他Toll-樣受體(TLR)9激動劑。用於本發明佐劑或者疫苗或者免疫原性組合物的優選寡核苷酸是包含CpG的寡核苷酸，優選的包含兩個或者更多個二核苷酸CpG模體，所述CpG模體被至少3個，更優選的被至少6個或者更多個核苷酸分離。CpG模體是指胞嘧啶核苷酸後跟著鳥苷酸。本發明的CpG寡核苷酸通常是脫氧核苦酸。在一個優選實施方案中，寡核苷酸中的核普酸間鍵是二硫代磷酸酯鍵，或者更優選的硫代磷酸酯鍵，但是磷酸二酯和其他核苷酸間鍵也屬於本發明的範圍。本發明的範圍還包括具有混合核苷酸間鍵合的寡核普酸。用於產生硫代磷酸酯寡核苷酸或者二硫代磷酸酯的方法描述於US5,666,153、US5,278，302和WO95/26204。優選寡核普酸的實例具有下列序列。所述序列優選的包含硫代磷酸酯修飾的核苷酸間鍵合OLIGO1(SEQIDN0:1):TCCATGACGTTCCTGACGTT(CpG1826)OLIGO2(SEQIDNO:2):TCTCCCAGCGTGCGCCAT(CpG1758)OLIGO3(SEQIDNO:3):ACCGATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGOLIGO4(SEQIDNO:4):TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(CpG2006)OLIGO5(SEQIDNO:5):TCCATGACGTTCCTGATGCT(CpG1668)OLIGO6(SEQIDNO:6):TCGACGTTTTCGGCGCGCGCCG(CpG5456)另外的CpG寡核苷酸可以包含上述優選的序列，在其上具有不連續的缺失或者添加。本發明使用的CpG寡核苷酸可以利用本領域任意已知的方法(例如參見EP468520)合成。方便地，可以利用自動合成儀來合成這種寡核苷酸。因此，在另一個實施方案中，佐劑組合物還包含增加的免疫刺激劑，所述免疫刺激劑選自TLR-1激動劑，TLR-2激動劑、TLR-3激動劑、TLR-4激動劑、TLR-5激動劑、TLR-6激動劑、TLR-7激動劑、TLR-8激動劑、TLR-9激動劑或者其組合。另一種優選的用於本發明的免疫刺激劑是QuilA及其衍生物。QuilA是從南美洲樹木QuilajaSaponariaMolina分離的皂苷製劑，Dalsgaard等人在1974年("Saponinadjuvants"，Archiv.furdiegesamteVirusforschung，Vol.44，SpringerVerlag,Berlin,p243-254)第一次描述了其具有佐劑活性。通過HPLC已經分離出QuilA的純化片段，其保留了佐劑活性但沒有與QmlA有關的毒性(EPO362278)，例如QS7和QS21(亦稱為QA7和QA21)。QS-21是源自QuillajasaponariaMolina樹皮的天然皂普，誘導CD8+細胞毒性T細胞(CTLs)、Thl細胞以及顯著的IgG2a抗體應答，其在本發明範圍內是優選的皂苷。QS21的具體製劑已經被描述，尤其優選的是這些製劑還包含甾醇(W096/33739)。當包括角鯊烯和皂普(任選的QS21)時，有利的是在所述製劑中還包含甾醇(任選的膽固醇)，因為這可以降低乳液中油的總水平。這可以導致製備成本的降低，接種總舒適度的改善，以及所獲免疫應答的定性和定量改進，諸如提高的IFN-y生成。因此，本發明的佐劑系統通常包含的可代謝油皂普比例(w/w)的範圍為200:1到300:1,另外本發明還可以使用"低油"形式，任選範圍是1:1到200:1,任選的20:1到100:1,或者基本上48:1，這種疫苗保留了所有組分的有益佐劑性質，並且反應原性模式降低很多。因此，一些實施方案的角鯊烯:QS21比例(w/w)範圍是1:1到250:1,或者20:1到200:1,或者20:1到100:1,或者基本上48:1。任選的甾醇(例如膽固醇)也被包括，以本文描述的皂苷甾醇的比例存在。抗原和抗原組合物疫苗或者免疫原性製劑將包含能夠引發抗人或者動物病原體的免疫應答的抗原或者抗原組合物。適宜地，所述抗原或者抗原組合物來源於下列中的一種或者多種HIV-1(諸如gag或者其片段，諸如p24、tat、nef、gpl20或者gpl60或者這些中任一的片段)、人皰疹病毒、諸如gD或者其衍生物或者立即早期蛋白，諸如來自HSV1或者HSV2的ICP27,巨細胞病毒((尤其是人)(諸如gB或者其衍生物)，輪狀病毒(包括減毒活病毒)、EpsteinBarr病毒(諸如gp350或者其衍生物)、水痘帶狀皰疹病毒(諸如gpl、II和IE63)、或者來自肝炎病毒諸如B型肝炎病毒(例如B型肝炎表面抗原或者其衍生物)、曱型肝炎病毒、C型肝炎病毒和戊型肝炎病毒、或者來自其他病毒病原體，諸如副粘病毒呼吸道合胞病毒(諸如F、N、M和G蛋白或者其衍生物)、SARS病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳頭瘤病毒(例如HPV6、11、16、18)、黃病毒(例如黃熱病毒、登革熱病毒、蜱傳腦炎病毒、日本腦炎病毒)或者流感病毒(完整的18活病毒或者失活病毒，在卵中或者MDCK細胞中生長的裂解流感病毒，或者完整流感病毒顆粒(如R.Gluck,Vaccine,1992，10，915-920所述)或者其純化蛋白或者重組蛋白，諸如HA、NP、NA或者M蛋白，或者其組合)、或者源自細菌性病原體諸如奈瑟氏菌(A^&化na^p),包括淋病奈瑟氏菌(Mg，orr/ze")和腦膜炎奈瑟氏菌(Mwem"g,"6fo)(例如莢膜糖類及其偶聯物，轉鐵蛋白結合蛋白，乳鐵蛋白結合蛋白、PiIC、粘附素)；化膿鏈球菌(S./;^ge""、)(例如M蛋白或者其片段，C5A蛋白酶，脂磷壁酸)、無乳鏈球菌(S.flg"/""z'"e)、變異鏈球菌(S.mwto朋)；杜氏嗜血菌(//.Jwc"》，z);莫拉氏菌(Morax:e〃as//),包4舌粘月莫莫才正氏菌(A/cato/r/z"/k)，也稱、為粘月菱炎布蘭'漢氏5求菌(7^"//wwe〃"ca,"T/7a//s)(例如高分子量和低分子量的粘附素和侵襲素)；博德特氏菌(6ora^e〃a^p)，包括百日咳博德特氏菌(5.(例如pertactin、百日咳毒素或者其衍生物、絲狀血凝素、腺苷酸環化酶、菌毛)、副百日咳博德特氏菌(5./arapeWw^/力和支氣管炎博德特氏菌(B.6ro"c/^e/〃'c");分枝^幹菌(A^coZa"en'wws//x),包4舌結鬥亥分鬥支才幹菌(A^fw6en:w/cw's)(例3口ESAT6、抗原85A、-B或者-C)、牛分枝桿菌(vW:/ww力、麻風分枝桿菌(M/印rae)、鳥分枝桿菌(Mav/wm)、副結核分枝桿菌(M;7(3ra/^6en:'w/as、"、)、恥祐分枝桿菌(M.swegma"力；軍團菌(Z/eg/o"e〃aat/),包才舌寸曼月市軍團菌(丄./恥wwo;/n7");埃希氏菌(z^c/zen'c/z/a^p),包括腸產毒性大腸桿菌(enterotoxic五.co/;)(例如定居因子、熱不穩定毒素或者其衍生物、熱穩定毒素或者其衍生物)、腸出血性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌(例如志賀毒素樣毒素或者其衍生物)；弧菌(Fz力no^7p),包括霍亂弧菌(Kc/w/era)(例如霍亂毒素或者其衍生物)；志賀氏菌(S/zige//av;7),包括索氏志賀氏菌(S.、痢疾志貧氏菌(S.c/>^e"fen'ae)、弗氏志貧氏菌(51.^/7e;cwer/z');耶爾森氏菌(Yersiniaspp),包括小腸結腸炎耶爾森氏菌(Ke"化raco/z"ca)(例如Yop蛋白)、鼠疫耶爾森氏菌(K、々￡結核病耶爾森氏菌(K/^ewt/ofw6ercw/ow'力；彎曲桿菌(Cam/^/o^"er^^)，包括空腸彎曲桿菌(C.7e，m)(例如毒素、粘附素粘附素和侵襲素)和大腸彎曲桿菌(C.co//);沙門氏菌(Salmonellaspp),包括傷寒沙門氏菌(S.(y/^/')、副傷寒沙門氏菌(S./^ra(y—/)、豬霍亂沙門氏菌(S.c'/w/era"、、腸炎沙門氏菌(X;李斯特氏菌(Listenaspp.),包括單核細胞增生李斯特氏菌(L.wo"ocjKoge"e力；螺桿菌(//￡/^0^"^^;7)，包括幽門螺桿菌(i7./y/on')(例如脲酶、過氧化氫酶、空泡毒素)；假單胞菌(屍wwJomomw^;),包括銅綠假單胞菌(屍葡萄球菌(Staphylococcusspp.),包括金黃色葡萄球菌(S.、表皮葡萄球菌(51.—(ier脂'血v);腸球菌(5V^eracocc附^;.),包括糞腸球菌(e.faecalis)、尿腸球菌(E./"ec/wm);梭菌(C7oWnWzwms//.),包括破傷風梭菌(C.tetani)(例如破傷風毒素及其衍生物)、肉毒梭菌(C.6ww/,"ww)(例如肉毒毒素及其衍生物)、艱難梭菌(C.d欲k',/e)(例如梭菌毒素A或者B及其衍生物)；芽胞桿菌(Z^c/7/iM、^;.),包括炭疽芽胞桿菌(S.6wArac&)(例如肉毒毒素及其書T生物)；才奉才幹菌(Co^ywe6a"e〃'wm包括白喉棒桿菌(C.A/7似/^n"e)(例如白喉毒素及其衍生物)；疏螺》走體(Bo"e/,'a's/p.),包4舌布氏疏螺》炎體C8.Z)wrgt/or/e〃')(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、格氏疏螺旋體(S.g"nm7)(例如OspA、OspC、DbpA、DbpB)、阿氏疏螺旋體(5.e/o"em"^/.)，包括蒼白密螺旋體(/:/^〃Www)(例如稀有外膜蛋白)、齒垢密螺旋體(7:tfe0co/a)、豬痢疾密螺旋體(7:/z"辦w"/em/e);或者來源於寄生物，諸如疾原蟲(屍/仏，ot/,'wwv/7.),包括惡性瘧原蟲(屍./a/c7jtarww);弓開j蟲(7bjco//(Xs'm"sp/.),包4舌鼠弓開》蟲(Kgow&7)(侈'H口SAG2、SAG3、Tg34);內變形蟲(Ewmmoe^^;.),包括痢疾內變形蟲A,'Wo/少/,'c");巴貝蟲(Ba6ew6/ATp.)，包括果氏巴貝蟲(S.錐蟲(7yy/朋c^owa5"//.),包括克香氏錐蟲(rcrwz/);賈第蟲(GV"r&"^/7.),包括表吮賈第蟲(G/aw結a);利什曼蟲(/^/2mam'a包括碩大利什曼蟲(jL月申嚢蟲(屍wewwoc;AS"/7^s//.)，包4舌卡氏月申嚢蟲(屍.毛滴蟲(7Wc/zow<9"oa'//.),包括陰道毛滴蟲(7!v(2g/'"a/;'力；血吸蟲OSc'/z&oWoma^/7.),包括曼氏血吸蟲(S.w"似om)，或者源自酵母諸如々支絲酵母(C"W,c/"^/7.),包括白色假絲酵母(C"/6,c"m');隱球酵母20(CV，ococcw"第),包括新型隱球酵母(C.weq/br層—。含變應原特異性以及i應原非特異性的抗、原,、、、、'結核分枝桿菌(M"6ercw/ow力的其他優選特異性抗原是例如TbRal2、TbH9、TbRa35、Tb38-1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2和hTCCl(WO99/51748)。針對結核分枝桿菌的蛋白還包括融合蛋白及其變體，其中結核分枝桿菌的至少兩個，優選的三個多肽被融合成更大的蛋白。優選的融合體包括Ral2-TbH9-Ra35、Erdl4-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erdl4-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erdl4-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI(WO99/51748)。衣原體最優選的抗原包括例如高分子量蛋白(HMW)(WO99/17741)、ORF3(EP366412)和推定的膜蛋白(Pmps)。疫苗製劑的其他衣原體抗原可以選自WO99/28475描述的組。優選的細菌疫苗包含來自鏈球菌(&^otococcww/)的抗原，包括肺炎鏈球菌(51./wewwo"me)(例如PsaA、PspA、鏈球菌溶血素、膽鹼結合蛋白)和蛋白抗原肺炎鏈球菌溶血素(BiochemBiophysActa，1989,67,1007;Rubins等人.,MicrobialPathogenesis,25，337-342)，和其突變的脫毒衍生物(WO90/06951;WO99/03884)。其他優選的細菌疫苗包含源自嗜血桿菌(Z/aewo/^〃w,s'w/.)的抗原，包括B型流感嗜血桿菌(//.,"y/we"zae)，不定型的嗜血桿菌，例如OMP26,高分子量粘附素、P5、P6、蛋白D和脂蛋白D、以及絲束蛋白和絲束蛋白衍生的肽(US5，843,464)或者其多重拷貝變體或者融合蛋白。B型肝炎表面抗原的衍生物是本領域公知的，並且尤其包括，在歐洲專利申請EP-A-414374;EP-A-0304578和EP198-474中描述的PreSl、PreS2S抗原。在一個優選的方面，本發明的疫苗製劑包含HIV-1抗原，gpl20,尤其是在CHO細胞中表達時。在另一個實施方案中，本發明的疫苗製劑包含如上文所述的gD2t。在本發明的一個優選實施方案中，包含所述佐劑的疫苗包含源自人乳頭瘤病毒(HPV)的抗原，HPV被認為造成生殖器疣(HPV6或者HPV11等)，並且HPV病毒還造成子宮頸癌(HPV16、HPV18等)。生殖器疣的預防或者治療疫苗的尤其優選形式包含L1蛋白，和包含選自HPV蛋白E1、E2、E5、E6、E7、Ll和L2的一種或者多種抗原的融合蛋白。融合蛋白最優選的形式是WO96/26277公開的L2E7,和WO99/10375公開的蛋白D(l/3)-E7。優選的HPV子宮頸感染或者癌症的預防或者治療疫苗，組合物可以包含HPV16或者18抗原。尤其優選的HPV16抗原包含早期蛋白E6或者E7,其與蛋白D載體融合，形成來自HPV16的蛋白D-E6或者E7融合體HPV16,或者其組合；或者E6或者E7與L2的組合(WO96/26277)。或者，HPV16或者18早期蛋白E6和E7可以單分子形式存在，優選的為蛋白D-E6/E7融合體。這種疫苗任選包含HPV18的E6和E7蛋白的任一種或兩種，優選的為蛋白D-E6或者蛋白D-E7融合蛋白或者蛋白DE6/E7融合蛋白的形式。本發明的疫苗可以另外包含來自其他HPV毒林的抗原，優選的來自毒林HPV31或者33。本發明的疫苗或者免疫原性組合物還包含源自可導致瘧疾的寄生物的抗原，例如，來自惡性痴原蟲的抗原，包括環孢子蛋白(CS蛋白)、RTS、S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1和TRAP。RTS是一種雜合蛋白，含有惡性痴原蟲環孢子(cs)蛋白的基本上全部c端部分，該部分經B型肝炎表面抗原preS2部分的4個胺基酸連接到B型肝炎病毒的抗原表面。其完整結構在國際專利申請號PCT/EP92/02591中公開，發明者E·J·哈農,W·R·小巴羅申請人:葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司