用於研究基於細胞的相互作用的微流體平臺的製作方法

2023-06-24 20:51:46 3

本發明涉及用於在三維(3d)微環境中培養細胞的微流體技術，且更具體地(但不僅僅)涉及微流體塑料裝置。

背景技術：

微流體技術能夠使用戶在更具生理性的三維(3d)微環境中培養細胞，並提供高解析度實時成像、多流通細胞類型、以及對於流量和梯度的控制的能力。國際專利申請號pct/us2009/039434描述三維微流體平臺及其使用方法。用於製造這些現有技術裝置的材料是聚二甲基矽氧烷(pdms)，其為一種光學清晰且氣體可滲透的可模製矽樹脂。pdms常用於通過軟光刻工藝進行快速成型以生產微流體裝置。然而，pdms對於基於細胞的應用而言不是理想的材料，其原因在labchip(2012,12,1224–1237)中由beebe等人詳細論述。簡要而言，一些缺點包括：

·pdms材料是易受疏水性化合物的體吸收的可滲透材料——研究疏水性藥物/蛋白質的生物測定將受到影響，這是因為，其有效濃度將會由於體吸收而降低。

·pdms易於蒸發——pdms水蒸氣滲透性在微流體裝置中是缺點，其中所用的培養基的量較小。蒸發可導致滲透壓偏移並影響細胞行為。

·pdms將恢復其疏水性——pdms通常為疏水性的，並以等離子體處理以增大表面親水性。親水性表面有利於特定的微流體處理，如表面功能化和微通道填充。然而，等離子體處理的pdms表面由於聚合物鏈從主體向表面擴散而恢復其疏水性。用戶於是不得不在使用前重複等離子體處理；除了不便之外，許多用戶可能無法訪問等離子體室。

·pdms不適於大批量製造——pdms由於其冗長的固化和處理時間而使其製作周期時間長得難以接受。

本發明的開發的出發點在於：提供一種塑料材料製成的三維微流體平臺，其不易受現有技術的pdms制裝置的問題的影響。本發明的微流體平臺也可以包含改進其功能性的多個其他有利特徵。

在此專利文件中引用的現有技術文獻僅用於例示目的，而並非承認這樣的現有技術是新加坡或其他地區的公知常識的一部分。

技術實現要素：

根據本發明的一個方面，提供一種微流體平臺，用於研究基於細胞的相互作用，該平臺包括：

片基，其由具有適當光學性質的合適的塑料材料製成，該片基具有與用於容納培養基的微流體通道流體連通的多個埠，培養基中保持有細胞。

優選地，片基通過工程塑料材料製成，該工程塑料材料能夠被注射成型而且是光學清晰的。典型地，塑料材料選自包括以下材料的組：聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、環烯烴共聚物(coc)、環烯烴聚合物(cop)。

優選地，平臺進一步包括：氣體可滲透層片，其結合到片基的底表面。

優選地，氣體可滲透層片由具有低體密度的聚合物製成。典型地，低體密度的聚合物選自包括以下材料的組：聚甲基戊烯(pmp)和聚(1-三甲矽基-1-丙炔)(ptmsp)，或者選自聚甲基化的聚合物(如聚甲基化的聚二苯乙炔)，或者選自通過其他方式實現充分氣體滲透性的聚合物。典型地，層片通過熱層壓、溶劑結合、粘結(利用溼性或乾性粘結劑)、或者通過其他方式而結合到片基，取決於相應地用於片基和層片的具體材料。優選地，氣體可滲透層片是光學清晰的。

典型地，片基具有以線性陣列布置的細長構造的多個微流體通道，每個微流體通道大致平行於相鄰的通道。優選地，每個微流體通道具有一對埠，在每端分別設置一個埠。優選地，埠均開通到片基的上表面上。優選地，微流體通道成對布置，且在成對的微流體通道之間設置有第三微流體通道，該第三通道被布置以允許在成對的微流體通道與第三微流體通道之間的受控的流體連通。典型地，第三微流體通道填充有水凝膠或其他細胞外基質。優選地，所有微流體通道形成在片基的底表面中，氣體可滲透層片結合到片基的底表面以封閉通道。

有利地，片基形成有多個儲部，這些儲部模製在片基的上表面中而且不與埠流體連通，其中，在使用時，每個儲部適於保持無菌水、水凝膠、或其他物質，以在裝置周圍產生潮溼環境。

典型地，片基具有整體上細長、矩形的構造，各埠沿片基的相應的縱向邊緣布置。

根據本發明的另一方面，提供一種製造微流體平臺的方法，該微流體平臺用於研究基於細胞的相互作用，該方法包括以下步驟：

通過具有適當光學性質的合適的塑料材料而模製片基，該片基具有與用於容納培養基的微流體通道流體連通的多個埠，該培養基中保持有細胞。

優選地，模製片基的步驟涉及：使用光學清晰的工程塑料材料進行注射成型。典型地，塑料材料選自包括以下材料的組：聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、環烯烴共聚物(coc)、環烯烴聚合物(cop)。

典型地，該方法進一步包括以下步驟：將氣體可滲透層片結合到片基的底表面。

優選地，氣體可滲透層片是光學清晰的，由具有低體密度的聚合物製成。典型地，低體密度的聚合物選自包括以下材料的組：聚甲基戊烯(pmp)和聚(1-三甲矽基-1-丙炔)(ptmsp)，聚甲基化的聚合物(如聚甲基化的聚二苯乙炔)，或者通過其他方式實現充分氣體滲透性的聚合物。

典型地，將所述層片結合到片基的步驟涉及：通過熱層壓而將層片層壓到片基。可替代地，將所述層片結合到片基的步驟涉及：溶劑結合、粘結結合(利用溼性或乾性粘結劑)、或者其他結合方式，取決於相應地用於片基和層片的具體材料。

根據本發明的進一步的方面，提供一種微流體平臺，用於研究基於細胞的相互作用，該平臺包括：

片基，其具有與用於容納流體培養基的微流體通道流體連通的多個埠，在流體培養基中保持有細胞，每個埠具有用於將埠與微流體通道連接的內部入口和鄰近於該入口的用於容納小儲量的培養基的槽，其中，在使用時，培養基能夠經由槽而不是直接經由內部入口從微流體通道吸出。

在一個實施例中，入口設置在埠的居中處，槽具有圍繞入口的環形構造。

典型地，槽的底部具有半圓形截面。

優選地，微流體平臺的埠被設計為模塊式附接接口。

有利地，埠適於接納通用模塊式魯爾連接器以將標準魯爾配件(如管連接器和注射泵)附接到微流體平臺。

有利地，多個微流體晶片能夠被接納和保持在單個微板保持器中。優選地，該保持器包括：設置在其上表面中而且不與晶片流體連通的多個內儲部，其中，在使用時，每個儲部適於保持無菌水、水凝膠、或其他物質，以在晶片周圍產生潮溼環境。

在本專利文件的全文中，除非在上下文中另有所需，否則用詞「包括」或其變體(例如包含或具有)將被理解為暗示所述整數或整數組，但不排斥任何其他的整數或整數組。類似地，用詞「優選地」或其變體(如優選的)將被理解為暗示所述整數或整數組是所希望的，但對於實施本發明並非必需。

附圖說明

通過以下對參照附圖的僅利用示例給出的多個具體實施例的詳細描述，本發明的特性將被更好地理解，在附圖中：

圖1a是根據本發明的微流體平臺的第一實施例的等距視圖；

圖1b是圖1a所示微流體平臺的平面圖；

圖2是圖1所示微流體平臺的截面圖，其中顯示出片基和氣體可滲透層片的優選布置；

圖3是現有技術的微流體平臺的截面圖，其中顯示出傳統埠的構造；

圖4是根據本發明的微流體平臺的截面圖，其中顯示出改進的埠的優選構造；

圖5例示出優選的模塊式魯爾連接器，其可用於根據本發明的微流體平臺；

圖6例示出模塊式魯爾連接器連接到根據本發明的微流體平臺中的埠；

圖7是微板保持器的一個實施例的平面圖，微板保持器用於保持最多三個根據本發明的微流體平臺；

圖8是圖1所示微流體平臺的頂側和下側的等距視圖，其例示出設置於其中的內儲部的位置；

圖9例示出設置在圖7所示微板保持器中的內儲部的位置；

圖10是圖1所示微流體平臺中的微流體通道的優選實施例的放大底部；以及

圖11是通過圖10中的線a-a的微流體通道的放大截面圖。

具體實施方式

根據本發明的用於研究基於細胞的相互作用的微流體平臺10的優選實施例如圖1和圖2中所示，包括：片基(chipbase)12，其由具有適當光學性質的合適的塑料材料製成。片基12具有與用於容納培養基17的微流體通道16流體連通的多個埠14，在培養基17中保持有細胞。

典型地，片基12具有以線性陣列布置的細長構造的多個微流體通道16，每個微流體通道16大致平行於相鄰的通道，如可在圖10和圖11中最清楚所見。每個微流體通道16具有分別設置在每端的第一和第二埠14，如可在圖4中最清楚所見。優選地，埠14均開通到片基12的上表面上。典型地，片基12具有整體上細長、矩形的構造，各埠14沿片基的相應的縱向邊緣布置。片基12的典型尺度是：75mm長、25mm寬、6mm深。微流體通道16典型地為250微米深。

優選地，微流體通道16成對(16a、16b)布置，在成對的微流體通道之間設置有第三微流體通道16c，如圖10和圖11中所示。第三通道16c被布置為允許在成對的微流體通道16a、16b與第三微流體通道16c之間的受控的流體連通。典型地，第三微流體通道16c填充有水凝膠18或其他細胞外基質。

優選地，片基12通過工程塑料材料製成，工程塑料材料能夠被注射成型並且是光學清晰(opticallyclear)的。典型地，塑料材料選自包括(但不限於)以下材料的組：聚碳酸酯(pc)、聚苯乙烯(ps)、聚乙烯(pe)、環烯烴共聚物(coc)、環烯烴聚合物(cop)。

塑料(如聚碳酸酯、聚苯乙烯等)過去已用於大批量製造細胞培養裝置。傳統的細胞培養裝置是具有大的空氣頭空間(airheadspace)和介質容量的瓶或井，因而氣體交互易於實現。不過，微流體裝置包括處於密封通道中的小容積，則氣體交換變為限制性因素，這是因為大多數塑料不能使氣體透過。這種限制可通過將塑料片基14與氣體可滲透層片20組合而克服。

優選地，氣體可滲透層片20是光學清晰的，由具有低體密度的聚合物製成。典型地，低體密度的聚合物選自包括以下材料的組：聚甲基戊烯(pmp)和聚(1-三甲矽基-1-丙炔)(ptmsp)，或者選自聚甲基化的聚合物(如聚甲基化的聚二苯乙炔)，或者選自通過其他方式實現充分氣體滲透性的聚合物。優選地，所有微流體通道16形成在片基12的底表面中，而氣體可滲透層片20結合到片基12的底表面以封閉如圖2和圖11中所示的通道16。典型地，層片20通過熱層壓、溶劑結合、粘結(利用溼性或乾性粘結劑粘結)、或者通過其他方式而結合到片基12，取決於相應地用於片基12和層片20的具體材料。

還可以完全通過氣體可滲透的聚合物製造片基12。這樣可具有的優點是：提供更簡單的層片處理，這是因為，層片20和片基12於是將具有相同的材料性質。不過，在氧可用性上可能沒有顯著增益，這是因為，氧不得不擴散通過厚的片基(數釐米的量級)，而不是薄的層片(幾十至幾百微米的量級)。專門的氣體可滲透的塑料也可能具有使其不適合於注射成型的材料性質。出於這些原因，在優選實施例中，片基12由標準的能夠被注射成型的塑料製造，並且裝置層壓有薄的氣體可滲透的層片。

本發明的微流體平臺或晶片(chip)10能夠複製培養系統中的細胞的體內行為。所述微流體平臺或晶片10的應用可包括(但不限於)：

·用於學術和工業研發的研究工具

·用於製藥公司的藥品探索工具

·用於調整對個體患者的臨床治療的輔助性工具

易用性對於學術研發客戶群而言是關鍵特點。除了pdms晶片製造不方便以外，用戶面對的其他使用困難包括：

每天更換培養基——微流體裝置在每個通道(典型地幾十微升)內具有小的培養基容量。這意味著：培養基的營養成分將被培養細胞迅速耗盡，培養基必須每天更換。由於用戶不得不為多個小裝置更換培養基，因而處理需要簡單、快速、防錯。培養基通常通過附接到真空抽吸部的移液管尖端從微流體通道吸出。常發生的錯誤是：施加過大真空力所致的過度吸出，這樣導致細胞與培養基一起被抽吸出通道，從而導致細胞損失/死亡。

適應性：研究者按照不同設定而評估試驗適應性，例如通過將其他裝置和設備連接到培養系統以修改培養條件。當前用戶不得不塑造其自身的連接器，這可能是不方便的和不可靠的。

處理：用戶希望優化利用其培育器中有限空間的微流體晶片。晶片還需要輸送到組織培養罩和輸送到各種顯微平臺，而不會溢灑或汙染。裝置自動化處理(例如通過機械平臺實現)受限於特定形式因素，如微滴定板。

蒸發控制——微流體裝置具有小培養基容量，因而蒸發損失將導致培養基滲透壓的顯著改變，引起不利的培養條件。用戶不得不在培育器內設定溼度室以抵禦蒸發。

多個創新點已包含在微流體平臺或晶片10的優選實施例中，以克服上述的使用困難。這些另外的創新點現在將詳細描述。

a.快速更換培養基而不過度吸出

現有技術的微流體埠的設計是圓柱形的，直接導入通道中(見圖3)。在培養基更換過程中的真空抽吸可導致細胞被抽吸到通道外。改進的埠設計涉及：形成內槽，其深於內部入口(見圖4)。每個埠14具有：將埠14與微流體通道16連接的內部入口22；鄰近於入口22的用於容納小儲量的培養基流體的槽24，其中，在使用時，培養基能夠經由槽24而不是直接經由內部入口22從微流體通道16吸出。

在所示實施例中，入口22設置在埠14的居中處，槽24具有按照同心圓圍繞入口的環形構造(如圖4的截面中所示)。可替代地，槽24可以具有不同構造，不過仍鄰近於入口22安置。典型地，槽的底部具有半圓形截面。

通過安置在槽24中的玻璃/移液管尖端26施加真空(如圖4中所示)導致培養基流體移除，當槽中的培養基完全移除時停止。由於內部入口22的更高高度，因而通道中的培養基和細胞將不受真空吸出的影響，無論移液管尖端在槽24中保持多久。新鮮培養基可然後在通道16的一側上添加到埠(上遊埠)，並被允許流動通過通道，從而替換舊的培養基。由於微流體系統中表面張力影響，因而可能需要將少量新鮮培養基添加到下遊埠，使得下遊入口處的表面張力可被克服以允許入流。

b.通過模塊式魯爾連接器和接口的適應性

晶片通道埠14優選地被設計為模塊式附接接口。aim通用魯爾鎖定連接器30(如圖5中所示)能夠使用戶將標準魯爾配件(例如用於附接管連接器和注射泵)附接到微流體晶片10。由aim開發的進一步的附件可直接連接到埠14或者經由通用連接器連接。圖5顯示出多個模塊式連接器30連接到微流體平臺10的相應埠14。圖5顯示出用於魯爾滑動和魯爾鎖定連接結構的連接器(左)、和附接到魯爾滑動和魯爾鎖定注射器的連接器(右)。

其他製造者的現有技術的方法基於直接構建到晶片上的分立部件。連接器部件從晶片突出並默認被包括在晶片中。這種本發明的模塊式的設計具有兩個重要優點：

(i)微流體晶片10可通過單一材料高效地製成為單一部件——不是所有的用戶都希望連接到其他裝置。這些用戶將會具有使用基本晶片10本身的選項。其他的需要連接到其他裝置的用戶具有使用模塊式魯爾連接器的不同的選項。這種設計方式在經濟上對於製造者和使用者而言都更合理，這是因為，核心的平臺(即，晶片)將更易於製造，而用戶群將獲得更低的價格基礎，但又具有更多選擇。

(ii)埠具有雙重作用——埠用作儲部，能夠實現用戶進行快速的培養基更換，而不需要連接器。需要連接到注射泵等的其他用戶將使用埠作為連接接口。應注意，後一用戶群將通過使用所連接的裝置(例如泵)而更換培養基，因而不需要培養基快速更換功能。這種方式優化了晶片上的有限空間。還能夠使進一步的附件通過匹配於埠槽和入口的接口而直接附接到晶片本身上，而不需要其他製造者現今使用的額外部件。

c.通過兼容sbs/ansi的微板保持器改進處理

有利地，多個微流體晶片10可被接納和保持在單個的微板保持器40中，如圖7和圖9中所示。微板保持器40的所示實施例包括：盤42，其具有側壁和大致平面形的基底；和被設置為與盤連接的多個隔間46。盤42中的每個隔間46適於在其中接納微流體晶片10。在所示實施例中，盤42被設計為其中接納最多三個流體晶片10。優選地，保持器40進一步包括：蓋44，其被接納在盤的上方以將微流體晶片10封閉其中。有利地，蓋44大致透明。有利地，多個保持器40也是可堆疊的。

標準形狀因子(如顯微鏡載玻片和微量滴定板)在生物和藥物研究工業中普遍存在。晶片和保持器均被設計為符合這些現有標準而使得裝置適用於現有工作流中。保持器還將適用於標準顯微平臺上，並可堆疊以使細胞培養培育器中的工作空間最大化。保持器被設計為定位晶片通道埠14以符合微滴定板的sbs/ansi標準，從而使其將與自動化板填充/處理系統兼容。使用這樣的系統填充微板中的井，並需要填充位置準確定位。這種設計方式的進一步的優點是：適合在學術實驗室中人工操作的裝置也可用於工業自動化設施中。

d.通過晶片和保持器設計的溼度控制

微流體系統的用戶常不得不將其裝置安置在溼度室中以限制蒸發。有利地，晶片10和保持器40均具有內置的儲部(見圖8和圖9)，儲部可填充有無菌水、水凝膠(例如瓊脂糖、聚丙烯醯胺等)、或其他物質，以在裝置周圍(或者保持器內)產生潮溼環境。這種方式不需要設定單獨的溼度室。其還當將裝置傳送到成像平臺上時有利於容易處理和保持溼度條件，這是因為加溼功能內置在晶片和保持器本身中。

如圖8中最清楚可見，片基12形成有被模製在其上表面中的多個儲部50。儲部50不與埠14流體連通。在使用時，每個儲部可用於保持無菌水、水凝膠、或其他物質，以在裝置周圍產生潮溼環境。

類似地，保持器40進一步包括：設置在盤42內的多個內儲部60，如圖9中最清楚可見。儲部60分立於晶片10且不與晶片10流體連通。因此，在使用時，每個儲部60可用於保持無菌水、水凝膠、或其他物質，以在晶片10周圍產生潮溼環境。

既然已經詳細描述了微流體平臺的優選實施例，因而顯見的是，提供針對現有技術的多個優點，包括以下優點：

(i)其克服了與使用pdms用於晶片襯底相關聯的問題；

(ii)改進的晶片通道埠涉及消除了與過度吸出相關聯的問題；

(iii)晶片可本身使用，或者使用模塊式魯爾連接器與其他裝置相結合使用；

(iv)晶片和保持器均符合微滴定板的sbs/ansi標準，因而其與自動化板填充/處理系統兼容；

(v)內置的儲部允許晶片和保持器提供自有溼度控制。

對於本相關領域技術人員易於顯見的是，除了已經描述的實施例以外，在不背離本發明基本發明思路的情況下，可對前述實施例進行各種修改和改進。例如，所述實施例中的流體平臺或晶片均設置有三組微流體通道。不過，晶片可定製設計以包含任意所希望數量的通道和採取各種構造。因此，應認識到，本發明的範圍不限於所描述的具體實施例。