一種羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法

2023-06-25 07:03:16

專利名稱：：一種羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法一種羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法駄領域本發明涉及一種從羥基積雪草甙提取物中分離獲得純度大於98%的羥基積雪草甙化學對照品的製備方法。羥基積雪草甙(Madecassoside)是積雪草中一種重要的活性化學成分，屬於五環三萜類化合物。羥基積雪草甙的結構式如下OHOH羥基積雪草的製備方法主要有如下方法:1.大孔吸附樹脂吸附法秦路平等(中國專利CN12110訴C，2005年公開)報導了積雪草總甙的提取方法，該方法採用皂甙型大孔吸附樹脂吸附積雪草提取物，經蒸餾水洗脫，去除雜質後，以水醇洗脫，得到積雪草總甙溶液，乙酸乙酯結晶，減壓濃縮至幹，經核磁共振分析，所得總皂甙主要由積雪草甙和羥基羥基積雪草甙組成，兩種成分佔總該提取物的60%以上。2.正相色譜法陳瑤等(中國專利CN1377649，2002年公開)報導了採用正相色譜製備羥基積雪草甙的方法以積雪草總甙為原料，進行矽膠正相層析，氯仿甲醇為洗脫液，收取其中的2:l比例部分洗脫液，回收穫得羥基積雪草甙晶體。3.離子交換色譜法A"盧瓦索等報導(中國專利CN1774257，2006年公開)報導積雪草甙、羥基積雪草甙和另一種五環三萜成分特米諾甙總含量為75%混合物可以通過如下方法獲得積雪草地上部分的醇提取物經過陰離子樹脂後，用液/液提取的方法進行選擇性脫脂，濃縮脫脂後的水一醇液依次通過陽離子樹脂、陰離子樹脂獲得混合物。該混合物如通過選擇性色譜分離可以獲得羥基積雪草甙和特米諾甙兩種成分總量佔混合物含量95%以上的混合物。羥基積雪草是積雪草中一種具有很強生物活性的化合物，將積雪草甙和羥基積雪草甙共同做為研究對象開展有關研究成為積雪草植物研究的趨勢。積雪草苷和羥基積雪草苷含量之和大於40%的積雪草總甙可以用來用於防治冠心病、心絞痛、心肌梗死、腦血栓形成、腦梗塞等心腦血管疾病。當積雪草甙、羥基積雪草甙和特米諾甙三種成分總量佔混合物含量75%以上時具有抗炎作用，可以用於治療多種炎性疾病及銀屑病、白癜風等皮膚疾病。但目前羥基積雪草甙的提取方法都無法穩定獲得純度為98%以上的羥基積雪草甙化學對照品，無法滿足羥基積雪草藥材或相關製劑的質量分析及控制要求。制約了積雪草及羥基積雪草甙的科學研究及應用。開發一種可以獲得克級純度在98%以上羥基積雪草甙化學對照品的方法是當前積雪草研究的難點。針對該問題,我們開發了一種可以獲得10克/月以上規模、純度在98%以上羥基積雪草甙的製備方法。
發明內容為克服現有技術的缺陷，優化分離條件，本發明的目的在於提供一種分離時間短、分離效果好、產品純度高(純度在98%以上)的羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法。為實現上述目的，本發明採用的技術方案對照品的分離製備方法，以重量含量3097%(優選6097%)的羥基積雪草甙提取物為原料，以製備型髙效液相色譜為分離手段，以甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得純度98%以上羥基積雪草甙化學對照品；具體步驟為，(1)樣品預處理將重量含量3097%的羥基積雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量濃度為2060mg/ml的積雪草甙提取物溶液，經0.220.45nm微孔濾膜過濾；(2)色譜柱處理高效液相色譜柱選擇製備型高效液相色譜柱，以520倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱；洗脫體系溶液為甲醇水溶液，其體積濃度為50—80%;(3)進樣將過濾後的樣品溶液通過六通閥或泵進樣，進樣體積為l100ml;(4)洗脫採用洗脫體系溶液洗脫色譜柱，流速控制在10600ml/min，在線紫外監測，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液；(5)羥基積雪草甙化學對照品的獲得減壓濃縮所收集到的羥基積雪草甙洗脫液至幹，獲得純度高於98%的羥基積雪草甙化學對照品。所述製備型高效液相柱選用商品化或自己裝填的製備型高效液相柱;其填料可為C8或C18鍵合相填料；自己裝填的製備型高效液相柱裝填方式為溼法裝柱，填料粒徑為5-20nm，柱效在2000以上；在線紫外檢測，其檢測波長為l卯nm220nm，具體監測波長根據樣品中幹擾成分與羥基積雪草甙的靈敏度確定，在所選擇波長下，可以靈敏監測到千擾成分與羥基積雪草甙的信號；羥基積雪草甙洗脫液收集後，減壓濃縮，濃縮溫度控制在4070'C。以本方法從羥基積雪草提取物中分離羥基積雪草甙化學對照品具有如下優點和進步1.本發明以製備型高效液相為分離手段，在保證羥基積雪草甙得到高效分離的前提下，提高了羥基積雪草甙化學對照品的產量，可以獲得克級純度在訴％以上的羥基積雪草甙化學對照品。2.本發明所述的甲醇-水洗脫體系能有效的保證羥基積雪草甙與其他成分得到有效分離，從而保證分離的效果。3.本發明採用紫外監測器在線監測，監測波長為200至220nm間任一波長，使羥基積雪草甙的分離情況可以直接監測，並可以選擇性收集，顯著提高收集效果。4.本發明所述方法操作簡便，條件溫和，能有效的保證羥基積雪草甙的穩定性。5.可產業推廣。色譜柱規格為20X250mm時，其規模可達到10克/月以上。圖i為本發明實施例i製備的羥基積雪草甙化學對照品的純度分析色譜圖。具體實肪式下面通過實施例和附圖對本發明做進一步詳細說明。實施例i本實施例中，以30%的羥基積雪草甙提取物為原料，以5阿C18鍵合相填料為吸附劑，以含有甲醇-水(50:50，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預處理羥基積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為60mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經0.22阿微孔濾膜過濾。2.色譜柱處理製備型高效液相柱選擇為日本Sheshido生產的固定相為C18的製備柱(5pm，20X250mm)，以約5倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過濾後的樣品溶液通過六通閥進樣，進樣體積為lml。4.洗脫流速控制在10ml/min，在線200nm紫外監測，收集含有羥基積雪草武的洗脫液，5.羥基積雪草甙化學對照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在7(TC。得到純度為98.89。/。的羥基積雪草甙化學對照品；如圖1所示，其分析結果如表l所示表ltableseeoriginaldocumentpage6實施例2本實施例中，以60%羥基積雪草甙提取物為原料，以10pm的C8鍵合相填料為吸附劑，以含有甲醇-水(70:30,體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預處理60%羥基積雪草甙提取物用乙醇溶解，配置成濃度為40mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經0.45Mm微孔濾膜過濾。2.色譜柱處理製備型高效液相柱是自己裝填的製備柱，填料為粒徑為10拜的C18鍵合相填料，溼法裝柱，色譜柱規格為50X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過濾後的樣品溶液通過六通閥進樣，進樣體積為5ml。4.洗脫流速控制在90ml/min，在線207nm紫外監測，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，5.羥基積雪草甙化學對照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在60'C。得到純度為98.91°/。的羥基積雪草甙化學對照品。實施例3本實施例中，以60%的羥基積雪草甙提取物為原料，以10jjm的C18鍵合相填料為吸附劑，以含有甲醇-水(60:40，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預處理羥基積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為40mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經0.45nm微孔濾膜過濾。2.色譜柱處理製備型高效液相柱是自己裝填的製備柱，填料為粒徑為IO拜的C18鍵合相填料，色譜柱規格為75X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過濾後的樣品溶液通過六通閥進樣，進樣體積為10ml。4.洗脫流速控制在150ml/min，在線200nm紫外監測，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，5.羥i積雪草甙化學對照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在651C。得到純度為98.14%的羥基積雪草甙化學對照品。實施例4本實施例中，以卯％的羥基積雪草甙提取物為原料，以20nmC18鍵合相填料為吸附劑，含有甲醇-水(80:20，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預處理羥基積雪草甙提取物用甲醇溶解，配置成濃度為40mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經0.45jim微孔濾膜過濾。2.色譜柱處理製備型髙效液相柱是自己裝填的製備柱，填料為粒徑為20pm的C18鍵合相填料，色譜柱規格為100X270mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過濾後的樣品溶液通過六通閥進樣，進樣體積為20ml。4.洗脫流速控制在300ml/min,在線207nm紫外監測，收集含有羥基積雪草武的洗脫液，5.羥'基積雪草甙化學對照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在60'C。得到純度為98.95%的羥基積雪草甙化學對照品。實施例5本實施例中，以80%的羥基積雪草甙提取物為原料，以10阿C18鍵合相填料為吸附劑，含有甲醇-水(75:25，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預處理羥基積雪草甙提取物用甲醇液溶解，配置成濃度為30mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經0.45nm微孔濾膜過濾。2.色譜柱處理製備型高效液相柱是自己裝填的製備柱，填料為粒徑為10拜的C18鍵合相填料，色譜柱規格為150X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過濾後的樣品溶液通過六通閥進樣，進樣體積為lOOml。4.洗脫流速控制在600ml/min，在線220nm紫外監測，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，5.羥i積雪草甙化學對照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，得到純度為98.20%的羥基積雪草甙化學對照品。實施例6本實施例中，以97%的羥基積雪草甙提取物為原料，以l(HimC18鍵合相填料為吸附劑，含有甲醇-水(65:35，體積比)溶液為洗脫溶劑，具體工藝步驟如下1.樣品預處理羥基積雪草甙提取物用甲醇-水(65:35，體積比)溶液溶解，配置成濃度為40mg/ml的羥基積雪草甙溶液，經0.45pm微孔濾膜過濾。2.色譜柱處理製備型高效液相柱是自己裝填的製備柱，填料為粒徑為20pm的C18鍵合相填料，色譜柱規格為150X250mm，以約10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱。3.上樣將過濾後的樣品溶液通過六通閥進樣，進樣體積為100ml。4.洗脫流速控制在600ml/min，在線220nm紫外監測，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，5.羥，基積雪草甙化學對照品的獲取減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液，減壓濃縮，濃縮溫度控制在7ox:。得到純度為98.34%的羥基積雪草甙化學對照品。權利要求1.一種羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，其特徵在於以重量含量30～97％的羥基積雪草甙提取物為原料，以製備型高效液相色譜為分離手段，以甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得純度98％以上羥基積雪草甙化學對照品；具體步驟為，(1)樣品預處理將重量含量30～97％的羥基積雪草甙提取物用甲醇或乙醇溶液溶解，配置成重量濃度為20～60mg/ml的積雪草甙提取物溶液，經0.22～0.45μm微孔濾膜過濾；(2)色譜柱處理高效液相色譜柱選擇製備型高效液相色譜柱，以5～10倍柱體積的洗脫體系溶液平衡色譜柱；洗脫體系溶液為甲醇水溶液，其體積濃度為50～80％；(3)進樣將過濾後的樣品溶液進樣，進樣體積為1～100ml；(4)洗脫採用洗脫體系溶液洗脫色譜柱，流速控制在10～600ml/min，在線紫外監測，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液；(5)羥基積雪草甙化學對照品的獲得減壓濃縮所收集到的羥基積雪草甙洗脫液至幹，獲得純度高於98％的羥基積雪草甙化學對照品。2.根據權利要求1所述羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，其特徵在於所述原料為重量含量6097%的羥基積雪草甙提取物。3.根據權利要求1所述羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，其特徵在於所述製備型高效液相柱選用商品化或自己裝填的製備型高效液相柱；其填料可為C8或C18鍵合相填料。4.根據權利要求3所述羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，其特徵在於所述自己裝填的製備型高效液相柱裝填方式為溼法裝柱。5.根據權利要求4所述羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，其特徵在於所述製備型高效液相柱的柱效在2000以上。6.根據權利要求3所述羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，其特徵在於所述製備型高效液相柱的填料粒徑為5-20miti。7.根據權利要求1所述羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，其特徵在於所述在線紫外檢測，其檢測波長為l卯nm220nm。8根據權利要求1所述羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，其特徵在於所述羥基積雪草甙洗脫液收集後，減壓濃縮，濃縮溫度控制在607ox:。全文摘要本發明涉及一種羥基積雪草甙化學對照品的分離製備方法，以重量含量30～97％的羥基積雪草甙提取物為原料，以製備型高效液相色譜為分離手段，以一定比例的甲醇-水溶液為洗脫體系，獲得純度大於98％的羥基積雪草甙化學對照品；工藝步驟有樣品預處理，色譜柱處理，進樣，洗脫，在線監測，收集含有羥基積雪草甙的洗脫液，減壓濃縮羥基積雪草甙洗脫液至幹，即得羥基積雪草甙化學對照品。經高效液相色譜法監測，羥基積雪草甙的含量可達到98％以上。文檔編號C07J63/00GK101210039SQ20061013509公開日2008年7月2日申請日期2006年12月27日優先權日2006年12月27日發明者肖紅斌,高明哲申請人:中國科學院大連化學物理研究所