改進的糖基化測定、糖分析陣列和測定系統的製作方法

2023-06-26 23:34:11 1

專利名稱：改進的糖基化測定、糖分析陣列和測定系統的製作方法
技術領域：
本申請涉及改進的糖基化測定(分析)。
背景技術：
寡糖和多糖是由單糖(糖)單元通過糖苷鍵互相連接而組成的聚合物。這些聚合物具有可根據單糖亞單元的線性序列進行描述的結構，其稱為多糖的二維結構。也可根據由它們的組分單糖亞單元在三個維度形成的結構來描述多糖。與DNA或蛋白的鏈一樣，糖鏈具有兩個不同的末端。在糖鏈的情況下，這些是還原性末端(相當於線性糖分子的醛基)和非還原性末端。然而，與蛋白和DNA不同，多糖一般
被支化，其中基本上多糖中的每個糖單元均可作為可選的支化點。存在許多結合於糖的蛋白。許多這些蛋白特異性地結合於特定短單糖序列或二糖序列。凝集素是與糖結合的蛋白的一大家族。已表徵了許多植物凝集素並在研究中使用。也表徵了許多哺乳動物凝集素。抗體是特異性識別特定分子結構的蛋白。與凝集素一樣，抗體也可識別糖結構。糖苷酶是能夠切割糖鏈中糖苷鍵的酶。糖苷酶也可特異性識別特定寡糖序列。糖基轉移酶是將糖單元轉移至受體分子的酶。在體內，這些受體分子是增長的聚糖結構。多糖的結構測定對糖生物學的發展非常重要。糖生物學的研究涉及包括細菌細胞壁、血液聚糖的對象，涉及與病毒性疾病如HIV感染，自身免疫病如胰島素依賴型糖尿病和類風溼性關節炎，以及如在癌症中發生的異常細胞生長有關的生長因子和細胞表面受體結構。青黴素的發現強調了糖分子的重要性，青黴素是細菌細胞壁糖分子合成的抑制齊U，並且可能是迄今為止所發現的最成功的抗生素。另一個實例是肝素的醫學應用，肝素是能抑制血液凝固的粘多糖，並且目前廣泛用於醫藥中。醫學上重要的糖分子的另外的實例包括粘多糖(GAG)、硫酸乙醯肝素、單克隆抗體、細胞因子(例如，IL-8、TNF、和最成功的ΕΡ0)、趨化因子(例如酸性成纖維細胞生長因子)和不同的生長因子。上述細胞因子、趨化因子和生長因子也能夠結合於GAG和其它多糖，因此也可以被認為是凝集素。多糖的結構複雜性阻礙它們的分析。例如，認為糖類通過非模板依賴性機理進行合成。在缺少結構信息的情況下，研究人員因此必須假設構建單元選自目前已知的任意糖單元。此外，這些單元可能在合成過程中例如通過加入硫酸酯基團而被修飾。在沒有測量該碳水化合物結構信息的能力的情況下，研究人員無法確定細胞群體例如組織中真實的、正確的糖基化模式。此外，這些單元可能在合成過程中例如通過加入硫酸酯基團而被修飾，使得僅僅了解添加了哪些類型的糖並不能提供全貌。此外,糖單元間的連接是多樣的。如果所連接的糖單元是己糖，則該糖可以連接至Cl、C2、C3、C4或C6原子中的任一個。而且，與Cl原子的連接可能為α構型或β構型。此外，許多糖之間的結構上的差異是微小的，因為糖單元可能僅僅通過羥基的位置區別於另一個(差向異構體)。在體內，糖基化是組織依賴性的，並可以隨著細胞狀態而顯著變化。在體外，糖基化強烈地取決於生長條件細胞類型，養分濃度，PH，細胞密度和年齡可以影響糖蛋白的糖基化模式。糖型的數量及其在細胞內的相對豐度受到單個蛋白的固有結構性質以及可用的糖基化酶的全部性質(包括其類型、濃度、動力學特徵、區室化)的影響。已顯示該全部性質在細胞狀態改變時發生變化(例如，致癌性轉化)。

實用新型內容本申請提供了改進的糖基化測定。該改進的測定能夠提供更準確的結果。這些改進的實例包括但不限於對測定系統的測定優化改進；涉及陣列改進的K指紋陣列格式；與檢測系統的改進有關的QC監測和校正；陣列和系統的測定外標誌(out of assay flag)的 實施。根據至少一些實施方式，提供了糖分析陣列，包括平面基板和存在於所述基板的表面上多個預定位置的多種糖結合劑，所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置，其中所述多個獨立的預定位置涉及所述位置的所述糖結合劑在濃度曲線中的多個濃度；所述平面基板適於接觸包括糖蛋白的樣品，使得所述糖蛋白與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線來確定非特異性結合的基線。根據至少一些實施方式，提供了一種糖分析陣列，其特徵在於，包括平面基板；和多個接觸部，所述多個接觸部存在於所述平面基板的表面上的多個預定位置處，在所述多個接觸部中設置有多種糖結合劑，所述多種糖結合劑設置在所述平面基板的預定位置中；所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置，其中所述多個獨立的預定位置設置有在濃度曲線中的多個濃度的所述糖結合劑；所述平面基板被設置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個接觸部處與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線確定用於非特異性結合的基線。可選地，所述接觸部選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔。可選地，可通過結合信號對所述可檢測的結合複合物進行檢測，並且其中在所述濃度曲線中，所述結合信號在糖結合劑濃度總數的至少五個中是線性的。可選地，所述平面基板具有凹陷或孔。可選地，所述平面基板包括膜、玻璃或塑料中的至少一種。可選地，所述平面基板為衍生化的。可選地，所述陣列進一步包括在所述平面基板上的多個標記的預定位置，以提供高信號來支持所述陣列在與所述樣品接觸後的圖像分析。可選地，所述陣列進一步包括多種糖結合劑，在所述平面基板的預定位置中作為校正標準。可選地，所述平面基板被分為多個襯墊，並且其中每一個襯墊包括獨立的多個校正標準。可選地,所述糖結合劑包括凝集素或抗體,或其修飾的成分或組合。可選地，所述基板上的每種凝集素的濃度範圍為O. 01mg/ml至10mg/ml。可選地，所述濃度範圍為O. 001mg/ml至10mg/ml。可選地，所述濃度範圍為0. 01mg/ml至5mg/ml。可選地，每個位置具有斑點尺寸直徑，並且其中所述斑點尺寸直徑在0. 05mm至75mm的範圍內。可選地，每個位置具有斑點尺寸直徑，並且其中所述斑點尺寸直徑在80微米至2500微米的範圍內。可選地，所述糖蛋白包括IgG抗體或片段。可選地，每個位置所述IgG的量在I. 8-12 μ g的範圍內。可選地，在用於將所述IgG抗體或片段與所述糖結合劑接觸的溶液中，所述IgG濃度在O. 001微摩爾至100微摩爾的範圍內。可選地，所述溶液包括去汙劑，以展開所述IgG抗體或片段並暴露至少一種聚糖。根據本申請的至少一些實施方式，提供了用如本文所述的多個陣列進行糖基化測 定的測定系統，其包括用於進行所述糖基化測定的試劑盒，通過結合信號來檢測所述可檢測的結合複合物以獲得結合數據的檢測器，以及測定優化模塊，其用於比較參考數據和從樣品糖蛋白獲得的所述結合數據，以通過計算最佳凝集素活性，測量僅與樣品糖蛋白產生信號的凝集素，以及通過與基於使用大量樣品類型創建的實驗確定的資料庫來定義的計算的基線相比較而計算載玻片背景值，來確定合適的測定條件。根據本申請的至少一些實施方式，提供了一種用於進行糖基化測定的測定系統其特徵在於，包括-多個陣列，-測定執行模塊，所述多個陣列連接至所述測定執行模塊(104)，或容納在所述測定執行1吳塊中；-檢測器，連接至所述測定執行模塊，通過所述檢測器檢測所述糖結合劑與樣品蛋白的結合；-測定數據分析儀，與所述檢測器通信或連接至所述檢測器；-測定外標誌模塊；連接至所述測定數據分析儀或者與所述測定數據分析儀通信；以及-測定優化模塊，連接至所述測定數據分析儀或者與所述測定數據分析儀通信；其中，所述多個陣列中的每一個包括_平面基板；和-多個接觸部，所述多個接觸部存在於所述平面基板的表面上的多個預定位置處，在所述多個接觸部中設置有多種糖結合劑，所述多種糖結合劑設置在所述平面基板的預定位置中；所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置，其中所述多個獨立的預定位置設置有在濃度曲線中的多個濃度的所述糖結合劑；所述平面基板被設置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個接觸部處與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線確定用於非特異性結合的基線。可選地，所述接觸部選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔。可選地，所述陣列插入或提供至所述測定執行模塊，可選地用於測定優化僅一次。可選地，所述檢測器與所述測定執行模塊組合或與所述測定執行模塊分開。可選地，所述檢測器與所述測定數據分析儀組合或與所述測定數據分析儀分開。可選地，所述測定優化模塊包括資料庫，所述資料庫包含與感興趣的蛋白在不同實驗條件下測定的結合有關的數據。可選地，所述測定優化模塊接收包含其它特定類型蛋白的優化實驗結果的文件。可選地，所述測定優化模塊根據以下參數中的一個或多個進一步確定合適的測定條件用於溫育樣品蛋白和糖結合劑的結合時間、溫度和緩衝液的PH值；糖結合劑信號、信號比、當暴露為非最佳時發生反應的一組指定的糖結合劑、背景值以及與校正標準背景相比較的背景值；樣品緩衝液中的去汙劑濃度；以及樣品蛋白濃度。可選地，所述測定優化模塊對樣品糖蛋白濃度、基板格式和測定格式進行優化。可選地，所述樣品糖蛋白包括IgG抗體，並且其中所述測定優化模塊確定IgG樣品抗體是否具有Fab糖基化或O-連接糖基化，以便實施特異優化條件，以及發出有關這樣的糖基化存在的警告。可選地，所述測定優化模塊確定施加於所述樣品糖蛋白的暴露溶液的量，其中所 述暴露溶液具有用於展開蛋白的本領域中已知百分比的去汙劑，其選自由膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、C16TAB、LysoPC, CHAPS、兩性表面活性劑(兼性離子洗滌劑，Zwittergent)、辛基糖苷、洋地黃皂苷、蘆布若爾、C12E8、曲拉通X-100 (Triton X-100)、諾乃P-40SDS (十二烷基硫酸鈉)、和吐溫-80組成的組。可選地，所述測定優化模塊確定涉及以下中的一個或多個的條件矩陣最優化暴露溶液濃度0. 001至1%，最優化溫度50-80°C，預處理溫育的最優化時間1分鐘至I小時。可選地，該系統進一步包括至少一個QC (質量控制)監測，其選自由通過前景均一性、背景均一性、平均中位密度間的相似性、飽和水平進行的斑點評估；根據陣列背景、對照斑點、陣列內重現性對整個平面基板的質量進行評估的陣列驗證；樣品和校正位置之間歸一化的評估；整個陣列信號的測定組成的組。可選地，該系統進一步包括作為校正樣品而施加於多個包含所述糖結合劑的預定位置的校正蛋白，以根據黃金指紋標準，通過所述測定優化模塊來校正糖結合劑的反應性。可選地，所述測定優化模塊可根據所述樣品糖蛋白與所述校正樣品的結合信號的比較來確定測定外標誌。可選地，所述測定優化模塊根據所述測定外標誌發出警告。除非另有規定，此處使用的所有技術和科學術語具有與本申請所屬領域的普通技術人員通常所理解相同的含義。雖然可在本申請的實施或測試中使用與本文所述的相似或等同的方法和材料，但下面描述合適的方法和材料。本文中提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考文獻的全部內容均以引用方式併入本文中。這些包括但不限於WO00/68688 和 W001/84147(US20060194269, US20070092915, US7056678 和 US7132251)， WO02/37106 (US20040132131)，和 WO 02/44714 (US7079955 和 US20040153252)。在衝突的情況下，以本說明書，包括定義為準。此外，材料、方法和實例僅是說明性的，並不旨在是限制性的。

此處僅通過舉例的方式，參考附圖對本申請進行描述。在現在對圖的詳細內容進行具體參考的情況下，強調以實施例的方式顯示詳細內容並且僅用於對本申請的優選實施例進行描述性討論，並且是為了提供認為最有用的和最容易理解本申請的原理和概念方面的描述而提出的。在這方面，與基本理解本申請所必需的細節相比，未試圖更加詳細地顯示本申請的結構細節，圖所附的描述使得如何使本申請的幾種形式在實踐中體現對本領域技術人員是顯而易見的。在圖中圖I示出了根據本申請的至少一些實施方式的示例性陣列；圖2示出了根據本申請的至少一些實施方式的示例性系統；圖3涉及用於根據本申請的至少一些實施方式的示例性凝集素的示例性印刷濃度；圖4示出了用於圖2的系統操作的示例性QC和校正過程，以及圖5示出了測試優化實驗布局、樣品和陣列類型與不同的測試樣品暴露條件結合的結果，其實驗是使用示例性的IgG抗體，阿瓦斯汀，通過上述系統針對一個陣列類型(一個襯墊載玻片或多個襯墊載玻片)進行測試的。
具體實施方式
本申請是改進的糖基化測定。根據本申請的優選實施方式，可能可選地且優選地根據與本申請共有的美國專利號7，056，678進行這樣的測定，此處以參考方式併入本文，如同在本文中完全闡述一樣。例如，該專利描述了用於糖的結構分析的方法，包括在表面上設置多個必需的序列特異性和/或位點特異性結合劑，使表面與待分析的糖的混合物接觸，例如來自細胞或組織的特定區室的糖分子的提取物；洗滌或以其他方式去除未結合的糖或糖片段；將之前獲得的必需序列特異性和/或位點特異性標誌物，或必需序列特異性和/或位點特異性標誌物的混合物添加到表面上；獲得結合於表面的標誌物的一個或多個圖像；以及衍生(導出)與通過圖像分析的糖的鑑定有關的信息。在一個方面，本申請提供了一種糖分析陣列102，其特徵在於，包括平面基板I ;和多個接觸部10，所述多個接觸部存在於所述平面基板I的表面上的多個預定位置處，在所述多個接觸部10中設置有多種糖結合劑，所述多種糖結合劑作為在所述平面基板I的預定位置中的分析樣品上的聚糖結構的檢測器；所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置10，其中所述多個獨立的預定位置10設置有在濃度曲線中的多個濃度的所述糖結合劑；所述平面基板I被設置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個接觸部10處與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線確定用於非特異性結合的基線。在另一方面，提供了一種用於進行糖基化測定的測定系統100，其特徵在於，包括-多個陣列102，所述多個陣列102中的每一個包括平面基板I;和多個接觸部10，所述多個接觸部10存在於所述平面基板I的表面上的多個預定位置處，在所述多個接觸部10中設置有多種糖結合劑，所述多種糖結合劑設置在所述平面基板I的預定位置中；所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置10，其中所述多個獨立的預定位置10設置有在濃度曲線中的多個濃度的所述糖結合劑；所述平面基板I被設置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個接觸部10處與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線確定用於非特異性結合的基線；-測定執行模塊104，所述多個陣列102連接至所述測定執行模塊104，或容納在所述測定執彳丁I旲塊104中；-檢測器105，連接至所述測定執行模塊104，通過所述檢測器105檢測所述糖結合劑與樣品蛋白的結合；-測定數據分析儀106，與所述檢測器105通信或連接至所述檢測器105；-測定外標誌模塊107;連接至所述測定數據分析儀106或者與所述測定數據分析儀106通信；以及-測定優化模塊108，連接至所述測定數據分析儀106或者與所述測定數據分析儀 106通信。可選地，所述接觸部10選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔。可選地，所述陣列102插入或提供至所述測定執行模塊104。 可選地，所述檢測器105與所述測定執行模塊104組合或與所述測定執行模塊104分開。可選地，所述檢測器105與所述測定數據分析儀106組合或與其分開。可選地，所述測定優化模塊108包括資料庫，所述資料庫包含與感興趣的蛋白在不同實驗條件下測定的結合有關的數據。可選地，所述測定優化模塊108接收包含其它特定類型蛋白的優化實驗結果的文件。其上設置有結合劑的表面可以包括，例如珠或陣列，或多孔板(例如96孔板)，但優選包括平面基板。平面基板(優選具有凹陷或孔)上的陣列可選地可以包括膜、玻璃或塑料表面等中的任一種。可選地可以通過獲得標誌物的圖像並生成待分析的多糖的識別位點圖來檢測糖結合標誌物的結合，以衍生(導出)樣品結構上的部分結構分布，從而衍生涉及多糖的至少部分序列信息。標誌物可選地可以包括色原結合劑，使得通過結合劑與例如複合物的結合來提供圖像，所述圖像是在基板表面顯像的顏色。可替換地，標誌物可能是標記的結合劑，使得根據來自標記的信號提供標誌物的圖像。可通過例如使用濾光器、雷射掃描儀或通過攝影和/或數位化圖像來獲得圖像。用於測定樣品例如細胞或人類IgG的糖基化模式或「指紋」的另外的方法和測定還披露在美國專利申請號20050186645中，其也與本申請共有，將其以參考方式併入本文，如同在本文中完全闡述一樣。該申請描述了一種通過將糖分子添加到連接有一種或多種糖結合劑(此處還稱作第一糖結合劑)的基板上來獲得關於糖分子的碳水化合物含量信息的方法。鑑定了與糖分子結合的第一糖結合劑，並且所得的結合信息用於生產糖分子的指紋。本申請的必需序列特異性和/或位點特異性結合劑可以包括，例如凝集素(例如有色凝集素、螢光凝集素、生物素標記的凝集素)或抗體(例如，螢光抗體、生物素標記的抗體、或酶標記的抗體)。可使用至少五個凝集素實施方法或測定，例如，5、IO、15、20、25、30、
35、40、45或50個凝集素，雖然可以可選地使用任意數量的凝集素，例如約5個凝集素至約100個或更多的凝集素。例如，可以可選地使用以4-8組重複(或任意其他合適的重複組)印在膜塗覆的載玻片上的一組20-30個凝集素實施該方法，或者可替換地在能夠提供每個印刷的凝集素的劑量應答的濃度範圍內。將完整糖蛋白的樣品應用於陣列，並通過使用任意螢光團直接標記或通過使用針對蛋白部分-例如抗體，或碳水化合物部分-凝集素的螢光團標記的探針來檢測其結合模式。所得的指紋是高度特有的樣品的糖基化模式。每個都具有其特異識別模式的大量的凝集素，可確保指紋對糖基化模式的變化的高靈敏性。可以使用許多螢光標記，如FITC、羅丹明、Cy3、Cy5、或任意Alexa染料。此處將這些螢光標記和染料標記統稱為「色原標記」。此外，可使用本領域中已知的生物素-親和素系統和/或使用任意其它合適的標記類型進行標記。在如上述進行分析之前，可以可選地對糖分子進行修飾。本申請的方法和測定可以可選地在整個細胞中進行。可替換地，方法和測定可在細胞製品中進行(非完整細胞材料)，例如膜蛋白提取物、細胞勻漿、或粗製膜混合物。在包括使用完整細胞的實施方式中，優選首先對細胞進行固定。例如，通過添加在索倫森氏緩衝液(Sorenson’s buffer),pH 為 7. 3 (Tousimis Research Corp. ,Rockville,Md)中的I %戊二醛的溶液，在24-48小時後用索倫森氏緩衝液洗滌，細胞可固定在RPMI培養基的懸浮液中，(如例如描述在Sanders et al,A high-yield technique for pr印aringcells fixed in suspension for scanning electron microscopy,The Journal of CellBiology, Volume 67，1975，pages 476480 中)。可替換地，可通過在環境溫度下將細胞浸入PBS/3. 7%甲醛中60分鐘對細胞進行固定，隨後用蒸懼水洗搽細胞(如例如描述在Nimrichter et al, Intact cell adhesionto glycan microarrays, Glycobiology, vol. 14，no. 2 ；pp. 197-203，2004 中)。當然，可以可選地進行任何類型的細胞固定過程，以允許檢測糖結合劑與細胞的
彡口口 本申請的方法可以可選地並優選地在體外進行。本申請的方法和測定可以可選地並優選地使用Qproteome Glycoprofiling試劑盒(Qiagen,美國)或任意GlycoScope型試劑盒實施。使用了精心挑選的大量數據集、已表徵的糖蛋白、和一大組酶合成的這些蛋白的糖變異體，通過分析超過80個凝集素的組對在這樣的試劑盒中使用的凝集素進行選擇。在可能的情況下，根據單糖特異性對陣列上的凝集素進行分組；表示為「複合物」的組中的凝集素不與單糖結合，但可與複雜N-連接聚糖結合。下面詳細描述各組和每組內凝集素間的差異。複合物該組中的凝集素可識別位於複雜N-連接複合聚糖的三甘露糖基核心的兩個α -甘露糖殘基中任一個的分支。由於該組中某些凝集素結合聚糖結構的大部分，因此它們對不同的天線末端是敏感的。表示為複合物(I)和複合物(4)的凝集素傾向於2，6_支化結構；凝集素複合物(3)傾向於2，4_支化結構，而凝集素複合物(2)以相似親和力識別兩種結構。GlcNAc該組中的凝集素與N-乙醯葡萄糖胺(GlcNAc)結合，並且其β 4_連接的寡聚物具有隨後者的鏈長增加而增加的親和力。該組中兩種凝集素的碳水化合物特異性不存在差異，但觀察到其結合模式中的差異，並且可能源於樣品的非碳水化合物部分。Gl c/Man該凝集素組是甘露糖結合凝集素的子組(參見下面)，並且由於它們除了與甘露糖結合以外還與葡萄糖結合，因此表示為Glc/Man結合凝集素。該組中的所有凝集素與雙天線複合N-連接聚糖以高親和力結合。將其對雙天線結構的親和力進行比較，凝集素Glc/Man(I)和(2)以較低的親和力結合於高甘露糖聚糖，而凝集素Glc/Man(3)將以較高的親和力結合於高甘露糖聚糖。甘露糖該組由特異性結合於甘露糖的凝集素組成。這些凝集素可以以較低的親和力結合於高甘露糖結構，並且可識別雙天線複合結構的核心甘露糖。末端GlcNAc該凝集素特異性地識別末端GIcNAc殘基。a -Gal這些凝集素結合於末端α -半乳糖(a -Gal)。凝集素a -Gal (I)可與α -半乳糖和a -GalNAc ( α -N-乙醯半乳糖胺)兩者結合，並且可結合於N和O-連接聚糖。凝集素a-Gal (3)主要與以N-連接天線為基礎的Galili抗原(Galal_3Gal)結合。β -Gal這些凝集素特異性結合於末端(非唾液酸化的)β -半乳糖殘基。Gal/GalNAc這些凝集素對末端半乳糖和N-乙醯半乳糖胺殘基是特異性的。該組內的不同凝集素對於半乳糖和N-乙醯半乳糖胺的相對親和力有所不同。來自該組的凝集素(2)和(5)幾乎專門地與Gal結合；凝集素⑴、(3)和(4)幾乎專門地與GalNAc結合。組中的其餘凝集素對GalNAc/Gal的相對親和力順序為(8) >
(7)> (6)。巖藻糖來自該組的凝集素以各種連接與巖藻糖殘基結合。凝集素巖藻糖(6)優先與1-2連接的巖藻糖結合；凝集素巖藻糖(8)優先與1-3和1-6連接的巖藻糖結合；凝集素巖藻糖(12)和(13)優先與Fucl-4G1CNAC結合(路易斯A抗原)。由於空間位阻，這些凝集素通常不與完整糖蛋白上的N-連接寡糖的核心巖藻糖
彡口口 唾液酸唾液酸凝集素與帶電荷的唾液酸殘基反應。也觀察到該組的成員對其它酸性基團(如硫酸鹽化)具有中級特異性。凝集素唾液酸(I)主要識別2-3連接的唾液酸；凝集素唾液酸(4)主要識別2-6連接的唾液酸。應當理解，僅以討論為目的提供這些用於檢測糖基化的方法和測定的實例，並且不用於以任何方式限制本申請，可在本申請中可選地使用任何其它合適的方法和/或測定。參照附圖和所附描述及以下實施例可以更好地理解本申請的原理和操作。[0112]實施例I對測定系統的測定優化改進該實施例涉及對測定系統的測定優化改進。該測定系統通常可用於測定用於許多不同類型蛋白的糖基化。然而，發現了針對一種類型蛋白的該系統的特異性改進，其優選涉及抗體，並且優選人類IgG抗體。已驚人地發現這些蛋白的糖分析需要暴露隱藏在蛋白結構中的聚糖，而這可通過特異性改進的糖分析系統實現。系統限定了最佳暴露條件，並帶領使用者通過優化過程，包括測定參數和分析參數。系統調節陣列以及使用調節的陣列進行檢測的相關陣列條件，並且包括樣品緩衝液中的最佳暴露溫度和暴露溶液濃度，優化方案和軟體。系統優選驗證了所選的最佳暴露處理與通過傳統方法例如HPLC和/或通過如下更詳細描述的對照獲得的參比結果相比，能夠實現準確的糖分析。雖然優選針對圖2所述的測定系統進行完整分析，但可選地在通過HPLC或其它測定分析前對蛋白進行消化。可使用具有或不具有HPLC參比的方案，以允許使用者進行內部校正或以簡單方式校正。該系統優選具有測定軟體以及有關方案和樣品。·如圖I中所示，本申請的糖分析陣列102包括平面基板I ;和多個接觸部10，所述多個接觸部10存在於所述平面基板I的表面上的多個預定位置處，在所述多個接觸部10中設置有多種糖結合劑，所述多種糖結合劑根據它們的結合特異性在所述平面基板I的預定位置中作為糖類和聚糖的檢測器；所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置10，其中所述多個獨立的預定位置10設置有在濃度曲線中的多個濃度的所述糖結合劑；所述平面基板I被設置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個接觸部10處與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線確定用於非特異性結合的基線。如圖2所示，提供測定系統100以進行糖基化測定。測定系統100具有多個陣列102，每個都包括固體(優選平面)基板，在該固體基板上以預定順序提供多個序列或位點特異性的糖結合劑(對於該順序的格式的非限定性實例，參見下面的實施例2)。這樣的結合劑包括但不限於抗體、凝集素等。這樣的凝集素的非限定性實例先前已描述。固體基板可以可選地包括多孔膜，例如硝酸纖維素，或非多孔基板，例如玻璃(如本領域中已知的，優選對後一類型的基板進行衍生化以允許蛋白穩固地與其結合)。可選地可以根據如下實施例2所述的K指紋陣列格式來製備陣列102。優選通過基於測定方案和測定優化方案中的具體說明的試劑盒的組分對陣列102進行處理，例如包括一種或多種如本文所述的洗滌和/或封閉緩衝液(blockingbuffers)。可以可選地將陣列102插入(或以其他方式提供至)測定執行模塊104，用於自動製備和執行如本文所述的測定方案。在測定執行模塊104中，將樣品蛋白施加於每個陣列102上，接著進行一個或多個洗滌步驟。可選地，在施加樣品蛋白前，還進行一次或多次封閉、平衡和/或洗滌步驟。「封閉」是指施加緩衝液以阻斷非特異性相互作用。也可以在樣品蛋白施加於陣列102後可選地進行這樣的封閉。以下也將陣列102稱為「載玻片」。在施加樣品蛋白後以及可選地在一個或多個洗滌步驟後，通過檢測器105檢測糖結合劑與樣品蛋白的結合。應注意，樣品蛋白可選地在沒有糖結合劑的情況下首先結合於陣列102，並且之後施加糖結合劑，但在任何情況下，均通過檢測器105對糖結合劑和樣品蛋白之間的複合物的形成進行檢測。檢測器105可選地可以與檢測執行模塊104組合或可以可替換地與其分尚。檢測器105優選接收直接指示結合的原始信號；例如，如果使用比色指示器來檢測結合複合物的形成，則可選地用檢測器105進行圖像分析以獲得原始結合信號。可選地並且優選地，隨後用測定數據分析儀106分析數據以確定結合是否確實發生。檢測器105與測定數據分析儀106連通，但可能可選地與測定數據分析儀106組合或可替換地與其分離。通過計算糖結合劑信號例如凝集素信號，並且通過計算凝集素信號比來測量結合。例如，如下文中的某些實施例所述，認為可選的校正結果或QC(質量控制)因素能夠確定結合是否發生。可選地，如實施例4所述，測定外標誌模塊107對任何異常的或「離群」結果進行標誌，並且也檢測測定相關的問題；還如下文更詳細地描述的，通過進一步考慮可能可選地排除這些結果。 隨後測定優化模塊108接收結合結果。測定優化模塊108優選包括資料庫，其含有與感興趣的蛋白在不同實驗條件下測定的結合有關的數據，在本實施例中感興趣的蛋白為IgG抗體。測定優化模塊108優選接收含有其它特定類型蛋白如IgG抗體的優化實驗結果的文件。文件優選包括涉及以下內容的數據校正標準在不同暴露條件的基質中的所需樣品(不同暴露溶液濃度和不同暴露溫度)參比樣品用於這樣的實驗的實驗布局的非限定性實例(例如參見圖5)為圖5示出了優化/暴露校正實驗結果的實例。該實驗優選進行一次，以利用樣品確定用於未來實驗的最佳條件。下面的表示出了實驗布局(具有相關測試暴露條件的所需載玻片和樣品)。當進行實驗時，如圖5所示，通過具有另外的信息如用戶名、日期等的系統來產生一組結果/糖分析。將圖5所示的報告加載(上傳)到用於分析的測定優化軟體模塊，並且該系統產生表明用於運行未來測定的最佳條件的報告。
I號襯墊/載2號襯塾3號襯塾/ 4號襯墊/ 5號襯墊/ 6號襯墊/ 7號襯墊/ 8號襯墊/ 玻片(頂部/載玻片載玻片載玻片載玻片載玻片載玻片載玻片 襯墊/第I載(底部襯
玻片)________墊)
培養基暴露無暴露培養基暴培養基暴低暴露溶高暴露溶高暴露溶高暴露溶 溶液濃度％處理露溶液濃露溶液濃液濃度％液濃度％液濃度％液濃度％
(低溫。C) 測試IgG度％(低度％ (低(低溫。C)(低溫°C)(高溫。C)(低溫。C)
校正標準溫° 溫° 測試IgG 測試IgG 測試IgG 參比樣品
(已提供)測試IgG 測試IgG(已提供)每個襯墊或載玻片與材料的類型和/或材料和特定樣品暴露條件的組合有關，因而與產生實驗條件設定的實驗組有關。例如，對於襯墊載玻片(如載玻片數量為2)，在特定暴露條件(溫度、暴露溶液濃度和暴露時間)下，在每片載玻片上均存在一種材料。在載玻片之間提供共享的校正標準以實現校正數據。多襯墊載玻片具有一個基板，如一個平面基板，但具有多個子區域。對於這樣的載玻片，第一襯墊通常為校正標準。可選地，獨立襯墊可具有樣品、參比標準和對照。可在相同載玻片或襯墊/子區域中提供多於一個的具有不同檢測劑(例如具有不同顏色的比色劑)的探針。此外，如果可提供，則測定優化模塊108還可以可選地接收對存在於陣列102中的相同蛋白樣品和至少一種糖結合蛋白的比較性HPLC(高效液相色譜)數據；可選地根據本領域中已知的一種或多種方法來獲得數據。然後測定優化模塊108將所有可用的參比數據和獲自樣品蛋白的實際數據進行比較，以通過計算最佳凝集素活性，測量僅當樣品暴露時產生信號的凝集素，以及通過與基於使用大量樣品類型創建的實驗確定的資料庫來定義的計算的基線相比較而計算載玻片背景值，來確定最合適的測定條件。這樣的參數的非限定性實例包括用於溫育樣品蛋白和糖結合劑的結合時間、溫度和緩衝液的暴露溶液濃度值；凝集素(糖結合劑)信號、信號比、當暴露為非最佳時發生反應的一組指定的凝集素、背景值以及與校正標準背景相比較的背景值；樣品緩衝液中的 ES(暴露溶液)濃度(例如樣品緩衝液體積的O. 01%);和樣品蛋白濃度。測定優化模塊108也可特異性確定IgG樣品抗體蛋白是否具有Fab糖基化或O-連接糖基化；如果有，則實施特異優化條件。對使用者發出有關該糖基化存在的警告，該糖基化的存在可能對結果的準確性產生負面影響。可選地，對一個或多個以下的其它參數進行優化-樣品濃度-載玻片格式-測定格式-解釋算法(腳本)為了將測定定製為特異性mAb (抗體)並允許Fe (免疫分子)相關聚糖的最大化暴露而進行優化。優化包括至少三個參數的校正暴露溶液濃度，溫度和暴露預處理的溫育時間，以將聚糖暴露於陣列凝集素。暴露溶液可以可選地包括任何適合將未暴露的聚糖結構進行暴露的成分，其會以其他方式被封閉。可選地且優選地，溶液含有去汙劑；更優選地，去汙劑選自包括膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、C16TAB、LysoPC、CHAPS、兩性表面活性劑(兼性離子洗漆劑，Zwittergent、SDS>辛基糖苷、洋地黃皂苷、蘆布若爾、C12E8、曲拉通X-100 (Triton X-100)、諾乃P-40、和吐溫-80的組，其比例均為用於展開蛋白的本領域已知的百分比。由於蛋白序列的差異可能影響抗體的生化和結構特性，因此暴露條件可能會隨著單克隆抗體不同而稍微變化。待控制的條件矩陣可以可選地包括優化暴露溶液濃度0. 001%至1%優化溫度50_80°C預處理溫育的優化時間I分鐘至I小時通過如本文所述的軟體方法自動地進行最佳條件的選擇。實施例2多濃度陣列格式多濃度陣列格式涉及對其本身物理陣列的改進，以獲得更優化的結合結果。與先前陣列類型中的單一濃度相比，該新型網格格式在陣列上使用了針對每個凝集素(或抗體-糖結合劑)而印刷的濃度曲線。開發多濃度格式以便提高系統重現性並生成更精確的信號。不希望限於封閉列表中，多濃度陣列格式還提供了至少以下改進指紋和解釋水平的更高的重現性在某些非特異性結合的情況下，用於定義基線的改進和更可靠的方式多濃度格式能夠解決各種問題， 例如「凝集素零點」，重現性和樣品濃度，這些問題對於高背景或低信號可以是非常重要的。對該問題的解決使得印刷在陣列上的糖結合劑的量得以降低。多濃度格式定義了每個結合劑有多個斑點，包括用於每個糖結合劑如凝集素的濃度曲線，因而每個陣列需要更多斑點。為了實現該目標，對陣列格式進行修飾，並且使每個凝集素包括另外的斑點。也將板格式進行改變以包括所有改進的自動圖像分析所需的濃度和其它標記斑點。添加更多斑點可能降低自動圖像分析軟體精確地檢測陣列上的斑點並定位虛擬測量網格(設置斑點值並計算指紋)的能力。為了提高圖像分析能力，可能提供其它的標記斑點，包括在處理的陣列掃描過程中提供高信號的預標記蛋白。如上所述，多濃度格式針對每個糖結合劑例如凝集素定義濃度曲線。在該非限定性實施例中，針對印刷在多個斑點之上的陣列的固體基板上的凝集素的量，給出了濃度曲線。優選地，對於陣列基板上的每個凝集素(糖結合劑)，存在多個不同的斑點，其與不同蛋白濃度相關。可選地，濃度範圍為O. 01mg/ml至10mg/ml ;優選地,該範圍為O. 038mg/ml至
3.5mg/ml,並且更優選地為O. 05mg/ml至lmg/ml (作為每毫升點樣溶液中的凝集素的毫克量給出)。例如，凝集素ConA的濃度在圖3中給出，具有7種不同的濃度(因而在物理基板上有7個不同斑點，每個含有凝集素的量在表中給出)。多濃度印刷格式用於計算載玻片上每種凝集素的信號曲線。如上所述，系統100優選自動測定哪些濃度是可接受的；如果信號和線性存在問題，則可以可選地忽略曲線中多達2個濃度點(在濃度的總數之內)。所計算的曲線和信號的質量決定所提交指紋的錯誤值。預計結合信號在凝集素濃度總數的至少五個中呈線性；該參數是通過測定優化模塊108測定的參數之一，並且是選擇如實施例I所述的特定實驗條件組的標準之一。通過接觸或非接觸印刷，可選地在陣列上製備多濃度格式，如先前所述優選平面基板。如其名稱所示，接觸印刷涉及將包覆有含有糖結合劑的溶液的固體裝置如針頭與平面基板的表面接觸。非接觸印刷可能例如可選地涉及噴灑或含有糖結合劑的溶液的其它分布方式，以使糖結合劑沉積在平面基板上。對於接觸印刷,斑點尺寸直徑優選從O. 05mm至75mm變化。對於非接觸印刷,斑點尺寸直徑優選從80微米至2500微米變化。「直徑」指的是斑點的最長軸(尺寸)；斑點不需要呈圓形或關於它們的軸對稱。根據每個斑點的樣品蛋白的量，對於IgG蛋白，推薦的IgG量在I. 8-12 μ g的範圍內。推薦的IgG濃度在O. OOl微摩爾至100微摩爾的範圍內；特別優選O. I μ M。實施例3QC監測和校ιΗQC(質量控制)監測和校正涉及測定系統的改進。QC監測識別在系統100的工作流程的溼(載玻片處理)和幹(掃描)階段中的技術問題。檢測的主要問題是載玻片質量、掃描質量、副本間的相關性(如果有)和圖像分析步驟過程中的問題。提供給使用者實驗中的載玻片和樣品的數值得分(對於技術質量，等級為0-1，而對於圖像分析網格校正質量，等級為-100至-200)。在提供每個樣品的報告中提供了關於每個得分的內部成分的更詳細的信息。計算階段:算法的計算階段以測試載玻片上的每個斑點開始；每個斑點根據其均一性和背景水平接收得分。在該過程中可排除某些斑點。然後根據其平均斑點質量，兩個相同子塊間的相關性和其它技術參數，對整個載玻片進行打分。下一階段是測試副本載玻片間的相關性(兩個樣品載玻片，或兩個對照載玻片)。如果副本相關性很差，則系統會自動選擇更好的載玻片作為計算的基礎。下表總結了用於計算載玻片得分的主要監測；應當注意，下表是用於一種載玻片類型的實例，並且對於其它的載玻片格式和/或表面類型可以是不同的。
權利要求1.一種糖分析陣列，包括平面基板和存在於所述基板的表面上多個預定位置的多種糖結合劑，所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置，其中所述多個獨立的預定位置涉及所述位置的所述糖結合劑在濃度曲線中的多個濃度；所述平面基板適於接觸包括糖蛋白的樣品，使得所述糖蛋白與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線確定用於非特異性結合的基線。
2.一種糖分析陣列(102)，其特徵在於，包括 平面基板(I);和 多個接觸部(10)，所述多個接觸部(10)存在於所述平面基板(I)的表面上的多個預定位置處，在所述多個接觸部(10)中設置有多種糖結合劑，所述多種糖結合劑設置在所述平面基板(I)的預定位置中；所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置(10)，其中所述多個獨立的預定位置(10)設置有在濃度曲線中的多個濃度的所述糖結合劑；所述平面基板(I)被設置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個接觸部(10)處與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線確定用於非特異性結合的基線。
3.根據權利要求I或2所述的陣列，其中，所述平面基板具有凹陷或孔。
4.根據權利要求3所述的陣列，其中，所述平面基板包括膜、玻璃或塑料中的至少一種。
5.根據權利要求4所述的陣列，其中，所述平面基板是衍生化的。
6.根據權利要求I或2所述的陣列，其中，所述陣列進一步包括在所述平面基板上的多個標記的預定位置，以提供高信號來支持所述陣列在與所述樣品接觸後的圖像分析。
7.根據權利要求6所述的陣列，其中，所述陣列進一步包括多種糖結合劑，在所述平面基板的預定位置作為校正標準。
8.根據權利要求7所述的陣列，其中，所述平面基板被分成多個襯墊，並且其中每一個襯墊包括獨立的多個校正標準。
9.根據權利要求I或2所述的陣列，其中，所述糖結合劑包括凝集素或抗體。
10.根據權利要求9所述的陣列，其中，所述基板上的每種凝集素的濃度範圍為O. 001mg/ml 至 10mg/ml。
11.根據權利要求10所述的陣列,其中，所述濃度範圍為O.01mg/ml至10mg/ml。
12.根據權利要求11所述的陣列，其中，所述濃度範圍為0.01mg/ml至5mg/ml。
13.根據權利要求10所述的陣列，其中，每個位置具有斑點尺寸直徑，並且其中所述斑點尺寸直徑在0. 05mm至75mm的範圍內。
14.根據權利要求10所述的陣列，其中，每個位置具有斑點尺寸直徑，並且其中所述斑點尺寸直徑在80微米至2500微米的範圍內。
15.根據權利要求13或14所述的陣列，其中，所述糖蛋白包括IgG抗體或片段。
16.根據權利要求15所述的陣列，其中，每個位置所述IgG量在I.8-12 μ g的範圍內。
17.根據權利要求16所述的陣列，其中，在用於使所述IgG抗體或片段與所述糖結合劑接觸的溶液中，所述IgG濃度在O. 001微摩爾至100微摩爾的範圍內。
18.根據權利要求17所述的陣列，其中，所述溶液包括去汙劑，用於展開所述IgG抗體或片段並暴露至少一種聚糖。
19.根據權利要求I或2所述的陣列，其中，所述平面基板具有凹陷或孔。
20.根據權利要求I或2所述的陣列，其中，所述糖結合劑包括凝集素或抗體。
21.一種用根據權利要求1-20中任一項所述的多個陣列進行糖基化測定的測定系統，包括用於進行所述糖基化測定的試劑盒，通過結合信號來檢測所述可檢測的結合複合物以獲得結合數據的檢測器，以及測定優化模塊，所述測定優化模塊用於比較參考數據和從樣品糖蛋白獲得的所述結合數據，以通過計算最佳凝集素活性、測量僅與樣品糖蛋白產生信號的凝集素、以及通過與基於使用大量樣品類型創建的實驗確定的資料庫來定義的計算的基線相比較而計算載玻片背景值，來確定合適的測定條件。
22.一種用於進行糖基化測定的測定系統(100)，其特徵在於，包括 多個陣列(102)， 測定執行模塊(104)，所述多個陣列(102)連接至所述測定執行模塊(104)，或容納在所述測定執行模塊(104)中； 檢測器(105)，連接至所述測定執行模塊(104)，通過所述檢測器(105)檢測所述糖結合劑與樣品蛋白的結合； 測定數據分析儀(106)，與所述檢測器(105)通信或連接至所述檢測器(105)； 測定外標誌模塊(107);連接至所述測定數據分析儀(106)或者與所述測定數據分析儀(106)通信；以及 測定優化模塊(108)，連接至所述測定數據分析儀(106)或者與所述測定數據分析儀(106)通信； 其中，所述多個陣列(102)中的每一個包括 平面基板(10);和 多個接觸部(10)，所述多個接觸部(10)存在於所述平面基板(I)的表面上的多個預定位置處，在所述多個接觸部(10)中設置有多種糖結合劑，所述多種糖結合劑設置在所述平面基板(I)的預定位置中；所述多種糖結合劑中的每一種存在於所述表面上的多個獨立的預定位置(10)，其中所述多個獨立的預定位置(10)設置有在濃度曲線中的多個濃度的所述糖結合劑；所述平面基板(I)被設置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得所述糖蛋白在所述多個接觸部(10)處與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據所述濃度曲線確定用於非特異性結合的基線。
23.根據權利要求22所述的測定系統，其中，所述樣品糖蛋白包括IgG抗體，並且其中所述測定優化模塊確定IgG樣品抗體是否具有Fab糖基化或O-連接糖基化，使得實施特異優化條件，並發出有關這樣的糖基化存在的警告。
24.根據權利要求23所述的測定系統，其中，所述測定優化模塊確定待施加於所述樣品糖蛋白的暴露溶液的量，其中所述暴露溶液具有用於展開蛋白的本領域已知百分比的去汙劑，所述去汙劑選自由十二烷基硫酸鈉、膽酸鹽、脫氧膽酸鹽、C16TAB、LysoPC, CHAPS、兩性表面活性劑、辛基糖苷、洋地黃皂苷、蘆布若爾、C12E8、曲拉通X-100、諾乃P-40、和吐溫-80組成的組。
25.根據權利要求24所述的測定系統，其中，所述測定優化模塊確定涉及以下中的一個或多個的條件矩陣優化暴露溶液濃度0. 001%至1%，優化溫度50-80°C，預處理溫育的優化時間1分鐘至I小時。
26.根據權利要求21或22或23-25中任一項所述的測定系統，進一步包括至少一個質量控制監測，其選自由通過前景均一性、背景均一性、平均中位密度間的相似性、飽和水平的斑點評估；根據陣列的背景、對照斑點、陣列內重現性對整個平面基板的質量進行評估的陣列驗證；樣品和校正位置之間的歸一化的評估；整個陣列信號的確定組成的組。
27.根據權利要求21或22或23-25中任一項所述的測定系統，進一步包括作為校正樣品而應用於多個包含所述糖結合劑的預定位置的校正蛋白，以根據黃金指紋標準，通過所述測定優化模塊來校正糖結合劑的反應性。
28.根據權利要求27所述的測定系統，其中，所述測定優化模塊根據所述測定外標誌發出警告。
29.根據權利要求2所述的陣列，其中，所述接觸部(10)選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔。
30.根據權利要求22所述的測定系統，其中，所述接觸部(10)選自圓形、橢圓形、方形的凹槽、凹陷或孔。
31.根據權利要求22所述的測定系統，其中，所述陣列(102)插入或提供至所述測定執行模塊(104)。
32.根據權利要求22所述的測定系統，其中，所述檢測器(105)與所述測定執行模塊(104)組合或與所述測定執行模塊(104)分開。
33.根據權利要求22所述的測定系統，其中，所述檢測器(105)與所述測定數據分析儀(106)組合或與所述測定數據分析儀(106)分開。
34.根據權利要求22所述的測定系統，其中，所述測定優化模塊(108)包括資料庫，所述資料庫包含與感興趣的蛋白在不同實驗條件下測定的結合有關的數據。
35.根據權利要求22所述的測定系統，其中，所述測定優化模塊(108)接收包含其它特定類型蛋白的優化實驗結果的文件。
專利摘要本申請提供一種改進的糖基化檢測法、糖分析陣列和測定系統。該糖分析陣列(102)包括平面基板(1)；和多個接觸部(10)，多個接觸部存在於平面基板(1)的表面上的多個預定位置處，在多個接觸部(10)中設置有多種糖結合劑，多種糖結合劑在平面基板(1)的預定位置中起糖類和聚糖檢測器和結合劑的作用；多種糖結合劑中的每一種存在於表面上的多個獨立的預定位置(10)，其中多個獨立的預定位置(10)設置有在濃度曲線中的多個濃度的糖結合劑；平面基板(1)被設置成與包括糖蛋白的樣品接觸，使得糖蛋白在多個接觸部(10)處與至少一種糖結合劑特異性結合併形成可檢測的結合複合物，以便根據濃度曲線確定用於非特異性結合的基線。
文檔編號G01N33/68GK202471720SQ20112033992
公開日2012年10月3日 申請日期2011年9月9日 優先權日2011年9月9日
發明者戴維·達布希, 查南·希梅爾法布, 約瑟夫·柯亨, 耶胡迪特·阿莫爾, 耶薩亞胡·亞基爾, 艾拉納·貝爾澤爾, 艾裡斯·利德爾, 阿爾貝納·薩莫科夫利斯基 申請人:普若康尼(以色列)有限公司