一種林可黴素的分離方法
2023-06-26 20:18:06 1
專利名稱：一種林可黴素的分離方法
技術領域：
本發明涉及一種林可黴素的分離方法。
背景技術：
林可黴素(Lincomycin)是一種林可胺類鹼性抗生素，易溶於水和甲醇，臨床上用其鹽酸鹽，主要用於治療革蘭氏陽性菌起的感染。用林肯鏈黴菌(Sti^ptomycesIincolnensis)發酵生產林可黴素的過程中除產生林可黴素外，也產生林可黴素B組分等其他結構類似物。林可黴素B組分是一種有毒成分，需要除去，否則會影響產品質量，尤其是在加工林可黴素衍生物時對B組分含量的控制更為嚴格。
傳統工藝一般採用溶媒萃取法從發酵液中提取林可黴素。其中，丁醇萃取法的缺點是溶劑消耗大、操作條件和環境差，結晶成品的B組分含量高；使用高碳醇，如辛醇作為萃取劑時，可以在一定程度上降低B組分的含量，但氣味難聞，操作複雜；CN 101348508A專利文獻中公開了一種用樹脂從發酵液中提取林可黴素的方法，該方法省去了萃取步驟，但缺點是B組分的含量仍然較高(0. 7% I. 3% )。鑑於現有林可黴素分離方法存在上述缺陷，該現狀亟待解決。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服了現有技術中林可黴素的分離方法溶劑消耗大或操作複雜，並且均存在獲得產品中林可黴素B組分含量較高的缺陷，提供了一種溶劑消耗適中、操作簡便，且產品林可黴素純度可達98%以上，而林可黴素B組分含量0. 5%以下的林可黴素的分離方法。本發明的林可黴素的分離方法包括如下步驟將含林可黴素發酵液酸化後過濾，然後調鹼性後再次過濾取濾液，之後上樣聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂柱，先用與上樣液同PH的鹼性水溶液洗脫除雜，再用正丁醇洗脫林可黴素，收集林可黴素正丁醇溶液進行濃縮、酸化並結晶，然後再用丙酮重結晶，即可。本發明中，所述的含林可黴素發酵液為本領域常規製備林可黴素的微生物菌發酵液，一般由林肯鏈黴菌Streptomyces Iincolnensis經過本領域常規方法發酵培養獲得。所述的林肯鏈黴菌具體菌種沒有特殊限定，常規能夠生產林可黴素的菌種均可使用，如林肯鏈黴菌 Streptomyces lincolnensis NRRL2936、林肯鏈黴菌 Streptomyces IincolnensisCPCC 280065 (中國藥用微生物菌種保藏管理中心可售)、林肯鏈黴菌Streptomyceslincolnensis CPCC 240859 (中國藥用微生物菌種保藏管理中心可售)等。其中，所述的林肯鏈黴菌經培養發酵獲得含林可黴素發酵液具體菌種不受限定是因為林可黴素是林肯鏈黴菌的次級代謝產物，不同的具體菌株雖然在林可黴素的產量、雜質的比例上有所不同，但發酵液的主要成分相對固定，因此不同具體菌種林肯鏈黴菌製備的發酵液均適用本發明方法。本發明中，所述的含林可黴素發酵液酸化後過濾，然後調鹼性後再次過濾取濾液為本領域常規分離林可黴素處理髮酵液的常規預處理操作，其中，酸化是為了絡合鈣離子等金屬離子以沉澱雜質蛋白並利於過濾，調鹼性後再次過濾是為了沉澱除去鹼性不溶雜質進一步澄清濾液，均屬於常規現有操作。其中，所述的酸化較佳的為草酸調PH 2-4，更佳為草酸調PH 3;所述的調鹼性較佳的為氫氧化鈉調pH 9-11，更佳的為氫氧化鈉調pH 10;所述的過濾較佳的為板框過濾。本發明中，所述的聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂(PS-DVB反相吸附樹脂)為本領域常規使用的聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂，較佳的型號為匪PS100或微球I號，更佳的為NM PS100。其中，所述的PS-DVB反相吸附樹脂的粒徑較佳的為50iim-120iim，孔徑較佳的為80人-120A，更佳的為IOOA。本發明中，所述的上樣的上樣量較佳的為彡50mg/mL樹脂。 本發明中，所述的上樣聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂柱的吸附流速較佳的為0. 02BV/min-0. 04BV/min,其中所述的BV/min為本領域常規計量術語,流速的一種表示方法，即單位時間通過的流體相當於樹脂體積的倍數。本發明中，所述的與上樣液同pH的鹼性水溶液較佳的為氫氧化鈉水溶液。其中，所述的pH值較佳的為9-11，更佳的為10。本發明中，所述的與上樣液同pH的鹼性水溶液的用量較佳的為4. 5BV-5. 5BV，更佳的為5BV。本發明中，所述的正丁醇的用量較佳的為I. 5BV-2. 5BV。本發明中，所述的收集林可黴素正丁醇溶液進行濃縮、酸化並結晶均為本領域常規處理操作步驟。其中，所述的濃縮為本領域常規操作，較佳的為50°C-80°C減壓濃縮。所述的濃縮的終點較佳的為濃縮至原體積的15% -25%。所述的酸化為本領域常規操作，較佳的為鹽酸調節PH調整0.5-2. 5。所述的結晶條件為本領域常規使用條件，較佳的為200C -30°C靜置 4h-8h。本發明中，所述的丙酮重結晶為本領域常規處理操作步驟。所述的丙酮重結晶較佳的為10倍以上體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的10% -20%再靜置結晶即可。其中，所述的靜置結晶的條件為本領域常規結晶條件，較佳的為4°C靜置4h-8h。本發明中，所述的丙酮重結晶之後一般還可按照本領域常規後處理，較佳的將為將重結晶的晶體再用丙酮洗滌2-3次後烘乾即可。本發明所用試劑和原料除特殊說明外，均市售可得。在符合本領域常識的基礎上，本發明中上述的各技術特徵的優選條件可以任意組合得到本發明較佳實例。本發明的積極進步效果在於本發明的林可黴素分離方法的溶劑消耗適中、操作簡便，且產品林可黴素純度可達98%以上，而林可黴素B組分含量0. 5%以下。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。
下述實施例中，檢測林可黴素的高效液相色譜檢測條件為色譜柱0DS_C18(5iO，檢測波長214nm，流動相0. 05mol/L硼砂溶液(用85%磷酸溶液調pH至5. 0)甲醇乙腈=60 : 36 : 4,流速 0. 8ml/min,柱溫 35°C。下述實施例中，樹脂來源為蘇州納微生物科技有限公司。其中，NMPS100樹脂粒徑50 u m-100 u m,孔徑IOOA;微球I號樹脂粒徑60 u m-120 u m,孔徑100人。製備實施例製備林可黴素發酵液，使用的菌種為林肯鏈黴菌StreptomyceslincolnensisNRRL 2936 (來源美國農業研究菌種保藏中心)、Streptomyceslincolnensis CPCC280065 (來源中國藥用微生物菌種保藏管理中心)、Streptomyces lincolnensis CPCC240859(來源中國藥用微生物菌種保藏管理中心)。培養條件
將菌株在30°C條件下接入斜面培養基中培養6天，斜面培養基的組成為):澱粉 2. O、冷黃豆餅粉 0. 5、K2HPO4 0. 05、NaCl 0. 05、MgSO4 7H20 0. 05、瓊脂 2. 5, pH 7. 0 ；之後將斜面上長出的菌體挖塊接種到種子培養基中培養2天，培養溫度為30°C，種子培養基的組成為):澱粉2. O、葡萄糖2. 5、黃豆餅粉2. O、玉米漿2. 5、硫酸銨0. 2、氯化鈉0. 07、碳酸鈣0. 8、pH 7.0 ；林可黴素發酵條件將培養好的種子按10%的接種量接種到發酵培養基中培養7天，培養溫度為30°C，發酵培養基的組成為):澱粉I. O、葡萄糖4. O、黃豆餅粉3. O、玉米漿I. 2、硫酸銨0. 8、硝酸銨0. I、氯化鈉0. 5、硝酸鈉0. 6、磷酸二氫鉀0. 03、碳酸鈣0. 8、pH7. O。其中，實施例I 3使用菌種為林肯鏈黴菌Streptomyces IincolnensisNRRL2936 ;實施例4 6使用菌種為林肯鏈黴菌Streptomyces IincolnensisCPCC 280065,實施例7 8使用菌種為林肯鏈黴菌Streptomyces IincolnensisCPCC 240859。實施例I將林可黴素發酵液(單位為7560u/ml，體積為I. 3L)，用草酸調節pH至2. 0，板框過濾取酸化液，並將酸化液用氫氧化鈉調pH至9. 5後再過濾取濾液；選用PS/DVB反相吸附樹脂匪PS100對其進行吸附(層析柱直徑約為4cm，高度約為20cm)，以0. 02BV/min的流速上柱吸附後，用4. 5BV pH為9. 5的鹼水進行洗脫除雜，除去了大量的色素和鹽，並將B組分基本洗下，之後再用I. 5BV的正丁醇將林可黴素集中洗下；將林可黴素的正丁醇溶液在60°C減壓濃縮至原體積的20%，並用鹽酸將pH調整到0. 5後將其溫度降低至20°C靜置4h結晶，並抽濾得到粗晶體；將林可黴素的粗晶體用10倍體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的20%，於4°C環境靜置4h結晶，4h後將晶體抽濾，並用丙酮洗滌3次後烘乾得到鹽酸林可黴素晶體，HPLC檢測林可黴素純度為98. 2%，B組分含量為0. 42%。實施例2將林可黴素發酵液(單位為7361u/ml，體積為I. 4L)，用草酸調節pH至3. 0，板框過濾取酸化液，並將酸化液用氫氧化鈉調pH至9. 0後再過濾取濾液；選用PS/DVB反相吸附樹脂微球I號對其進行吸附(層析柱直徑約為4cm，高度約為20cm)，以0. 04BV/min的流速上柱吸附後，用5BV pH為9. 0的鹼水進行洗脫除雜，除去了大量的色素和鹽，並將B組分基本洗下，之後再用2BV的正丁醇將林可黴素集中洗下；將林可黴素的正丁醇溶液在50°C減壓濃縮至原體積的15%，並用鹽酸將pH調整到I. 0後將其溫度降低至25°C靜置6h結晶，並抽濾得到粗晶體；將林可黴素的粗晶體用11倍體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的15%，於4°C環境靜置7h結晶，7h後將晶體抽濾，並用丙酮洗滌2次後烘乾得到鹽酸林可黴素晶體，HPLC檢測林可黴素純度為98. 5%，B組分含量為0. 35%。實施例3將林可黴素發酵液(單位為7862u/ml，體積為I. 0L)，用草酸調節pH至3. 5，板框
選用PS/DVB反相吸附樹脂匪PS100對其進行吸附(層析柱直徑約為4cm，高度約為20cm)，以0. 03BV/min的流速上柱吸附後，用5. 5BV pH為10. 0的鹼水進行洗脫除雜，除去了大量的色素和鹽，並將B組分基本洗下，之後再用2. 5BV的正丁醇將林可黴素集中洗下；將林可黴素的正丁醇溶液在55°C減壓濃縮至原體積的25%，並用鹽酸將pH調整到I. 5後將其溫度降低至30°C靜置8h結晶，並抽濾得到粗晶體；將林可黴素的粗晶體用13倍體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的10%，於4°C環境靜置5h結晶，5h後將晶體抽濾，並用丙酮洗滌3次後烘乾得到鹽酸林可黴素晶體，HPLC檢測林可黴素純度為98. 6%，B組分含量為0. 32%。實施例4將林可黴素發酵液(單位為8200u/ml，體積為I. 0L)，用草酸調節pH至3. 0，板框過濾取酸化液，並將酸化液用氫氧化鈉調pH至10. 0後再過濾取濾液；選用PS/DVB反相吸附樹脂匪PS100對其進行吸附(層析柱直徑約為4cm，高度約為20cm)，以0. 02BV/min的流速上柱吸附後，用4. 5BV pH為10. 0的鹼水進行洗脫除雜，除去了大量的色素和鹽，並將B組分基本洗下，之後再用2BV的正丁醇將林可黴素集中洗下；將林可黴素的正丁醇溶液在65°C減壓濃縮至原體積的15%，並用鹽酸將pH調整到I. 0後將其溫度降低至25°C靜置6h結晶，並抽濾得到粗晶體；將林可黴素的粗晶體用10倍體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的15%，於4°C環境靜置6h結晶，6h後將晶體抽濾，並用丙酮洗滌2次後烘乾得到鹽酸林可黴素晶體，HPLC檢測林可黴素純度為98. 7%，B組分含量為0. 3%。實施例5將林可黴素發酵液(單位為6251u/ml，體積為I. 5L)，用草酸調節pH至3. 0，板框過濾取酸化液，並將酸化液用氫氧化鈉調pH至10. 0後再過濾取濾液；選用PS/DVB反相吸附樹脂匪PS100對其進行吸附(層析柱直徑約為4cm，高度約為20cm)，以0. 04BV/min的流速上柱吸附後，用5. 5BV pH為10. 0的鹼水進行洗脫除雜，除去了大量的色素和鹽，並將B組分基本洗下，之後再用I. 5BV的正丁醇將林可黴素集中洗下；將林可黴素的正丁醇溶液在75°C減壓濃縮至原體積的20%，並用鹽酸將pH調整到2. 5後將其溫度降低至20°C靜置5h結晶，並抽濾得到粗晶體；將林可黴素的粗晶體用12倍體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的20%，於4°C環境靜置5h結晶，5h後將晶體抽濾，並用丙酮洗滌2次後烘乾得到鹽酸林可黴素晶體，HPLC檢測林可黴素純度為98. 0%，B組分含量為0. 4%。實施例6將林可黴素發酵液(單位為7945u/ml，體積為I. 0L)，用草酸調節pH至4. 0，板框過濾取酸化液，並將酸化液用氫氧化鈉調pH至11. 0後再過濾取濾液；選用PS/DVB反相吸附樹脂匪PS100對其進行吸附(層析柱直徑約為4cm，高度約為20cm)，以0. 03BV/min的流速上柱吸附後，用5. OBV pH為11. 0的鹼水進行洗脫除雜，除去了大量的色素和鹽，並將B組分基本洗下，之後再用2. 5BV的正丁醇將林可黴素集中洗下；將林可黴素的正丁醇溶液在80°C減壓濃縮至原體積的15%，並用鹽酸將pH調整·到I. 5後將其溫度降低至30°C靜置4h結晶，並抽濾得到粗晶體；將林可黴素的粗晶體用12倍體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的15%，於4°C環境靜置5h結晶，5h後將晶體抽濾，並用丙酮洗滌3次後烘乾得到鹽酸林可黴素晶體，HPLC檢測林可黴素純度為98. 7%，B組分含量為0. 3%。實施例7將林可黴素發酵液(單位為7713u/ml，體積為I. 2L)，用草酸調節pH至3. 0，板框過濾取酸化液，並將酸化液用氫氧化鈉調pH至9. 5後再過濾取濾液；選用PS/DVB反相吸附樹脂微球I號對其進行吸附(層析柱直徑約為4cm，高度約為20cm)，以0. 03BV/min的流速上柱吸附後，用4. 5BV pH為9. 5的鹼水進行洗脫除雜，除去了大量的色素和鹽，並將B組分基本洗下，之後再用2BV的正丁醇將林可黴素集中洗下；將林可黴素的正丁醇溶液在75°C減壓濃縮至原體積的25%，並用鹽酸將pH調整到2. 0後將其溫度降低至25°C靜置5h結晶，並抽濾得到粗晶體；將林可黴素的粗晶體用11倍體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的15%，於4°C環境靜置6h結晶，6h後將晶體抽濾，並用丙酮洗滌3次後烘乾得到鹽酸林可黴素晶體，HPLC檢測林可黴素純度為98. 5%，B組分含量為0. 33%。實施例8將林可黴素發酵液(單位為7680u/ml，體積為I. 1L)，用草酸調節pH至3. 5，板框過濾取酸化液，並將酸化液用氫氧化鈉調pH至9. 0後再過濾取濾液；選用PS/DVB反相吸附樹脂匪PS100對其進行吸附(層析柱直徑約為4cm，高度約為20cm)，以0. 04BV/min的流速上柱吸附後，用5. 5BV pH為9. 0的鹼水進行洗脫除雜，除去了大量的色素和鹽，並將B組分基本洗下，之後再用I. 5BV的正丁醇將林可黴素集中洗下；將林可黴素的正丁醇溶液在60°C減壓濃縮至原體積的25%，並用鹽酸將pH調整到I. 5後將其溫度降低至20°C靜置4h結晶，並抽濾得到粗晶體；將林可黴素的粗晶體用10倍體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的20%，於4°C環境靜置5h結晶，5h後將晶體抽濾，並用丙酮洗滌3次後烘乾得到鹽酸林可黴素晶體，HPLC檢測林可黴素純度為98. 1%，B組分含量為0.45%。
權利要求
1.一種林可黴素的分離方法，其特徵在於其包括如下步驟將含林可黴素發酵液酸化後過濾，然後調鹼性後再次過濾取濾液，之後上樣聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂柱，先用與上樣液同PH的鹼性水溶液洗脫除雜，再用正丁醇洗脫林可黴素，收集林可黴素正丁醇溶液進行濃縮、酸化並結晶，然後再用丙酮重結晶，即可。
2.如權利要求I所述的分離方法，其特徵在於所述的含林可黴素發酵液由林肯鏈黴菌Streptomyces Iincolnensis經過本領域常規方法發酵培養獲得。
3.如權利要求2所述的分離方法，其特徵在於所述的林肯鏈黴菌為林肯鏈黴菌Streptomyces lincolnensis NRRL 2936、林肯鏈黴菌 Streptomyceslincolnensis CPCC280065、或者林肯鏈黴菌 Streptomyces lincolnensis CPCC240859。
4.如權利要求I所述的分離方法，其特徵在於所述的含林可黴素發酵液酸化後過濾，然後調鹼性後再次過濾取濾液步驟中，所述的酸化為草酸調PH 2-4，較佳為草酸調pH 3；所述的調鹼性為氫氧化鈉調pH 9-11,較佳的為氫氧化鈉調pH 10 ;所述的過濾為板框過濾。
5.如權利要求I所述的分離方法，其特徵在於所述的聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂的型號為NM PSlOO或微球I號；所述的聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂的粒徑為50-120 u m，孔徑為80A-120A，較佳的為 100A。
6.如權利要求I所述的分離方法，其特徵在於所述的上樣的上樣量為<50mg/mL樹脂；所述的上樣聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂柱的吸附流速為0. 02BV/min-0. 04BV/min0
7.如權利要求I所述的分離方法，其特徵在於所述的與上樣液同pH的鹼性水溶液為氫氧化鈉水溶液；所述的PH值為9-11，較佳的為10 ;所述的與上樣液同pH的鹼性水溶液的用量為4. 5BV-5. 5BV，較佳的為5BV。
8.如權利要求I所述的分離方法，其特徵在於所述的正丁醇的用量為I.5BV-2. 5BV。
9.如權利要求I所述的分離方法，其特徵在於所述的收集林可黴素正丁醇溶液進行濃縮、酸化並結晶步驟中，所述的濃縮為50°C -80°C減壓濃縮；所述的濃縮的終點為濃縮至原體積的15% -25% ;所述的酸化為鹽酸調節pH調整0. 5-2. 5 ;所述的結晶條件為200C -30°C靜置 4h-8h。
10.如權利要求I所述的分離方法，其特徵在於所述的丙酮重結晶為10倍以上體積的丙酮溶解後濃縮至原體積的10% -20%再靜置結晶即可。
全文摘要
本發明公開了一種林可黴素的分離方法。該方法包括如下步驟將含林可黴素發酵液酸化後過濾，然後調鹼性後再次過濾取濾液，之後上樣聚苯乙烯-二乙烯苯反相吸附樹脂柱，先用與上樣液同pH的鹼性水溶液洗脫除雜，再用正丁醇洗脫林可黴素，收集林可黴素正丁醇溶液進行濃縮、酸化並結晶，然後再用丙酮重結晶，即可。該方法溶劑消耗適中、操作簡便，且產品林可黴素純度可達98％以上，而林可黴素B組分含量0.5％以下。
文檔編號C07H15/16GK102746348SQ20111009851
公開日2012年10月24日 申請日期2011年4月19日 優先權日2011年4月19日
發明者李繼安, 藍鴻 申請人:上海醫藥工業研究院