生產等電點高於8或低於5的多肽的方法

2023-06-27 05:34:16

專利名稱：生產等電點高於8或低於5的多肽的方法
技術領域：
本發明涉及用於肽生產的方法和試劑。本發明特別涉及生產等電點高於8或低於5多肽的方法。本發明的一種優選的實施例涉及b-型鈉尿肽的生產。
本發明針對表達和回收一種肽的有效方法，特別是需要生產具有高等電點或低等電點的肽時，從而使離子交換層析法作為肽純化的一個步驟成為必須的。本發明雖然以具有相對高的等電點的b-型鈉尿肽為例作為說明，但是本領域的技術人員將可以應用本發明所公開的方法和試劑來生產其它具有高等電點或低等電點的肽。
本領域眾所周知，在一個重組宿主細胞中，例如大腸桿菌，用表達編碼肽的DNA來生產長度少於50個胺基酸的肽會遇到所表達的肽在宿主細胞內發生酶降解的問題，導致部分甚至全部的肽的破壞。解決此問題的最普通的方法是設法使肽在宿主細胞中不溶解。有效的方法是肽表達為一種融合蛋白，在該融合蛋白中肽被連接在一個融合配偶體上。通常，該融合配偶體會與肽的N-端融合。該融合蛋白在細胞內形成包含體，在包含體中，肽受到保護，免受蛋白水解酶的降解作用。
在該包含體從宿主細胞回收後，必須將該肽從前導序列中分離、純化並以活性形式回收。從前導序列中分離可通過在前導序列和肽之間的連接處放置一種胺基酸序列來進行，可以被特異性地識別，並在合適的條件下分離，如酸分離或酶分離。由於酶的高成本以及可用的時效受限，酶分離的方法往往不可能在商業規模的生產上實現，即使在一個固定的分離柱中使用也難以實現。
可以在前導序列和肽的連接處放置一種特定的二肽，以實現酸裂解，這種二肽的第一個胺基酸是天冬氨酸。第二個胺基酸的確定將決定了在酸性條件下該二肽鍵裂解的速率。當然，如果所需生產的肽中有任何可被酸裂解的二肽序列，即麼在該前導序列和肽接合處的裂解點的酸裂解速率必須比肽內部的裂解速率高得多，以避免產量的較大損失。可進行酸裂解的二肽的相對反應速率如下
*F.Marcus,Intl.J.Peptide and Protein Res.(1985)25:542-546**本發明的觀察在用酶或酸裂解之前，通常用一種離液劑處理包含體中的融合蛋白，使其溶解，離液劑會引起蛋白結構的伸展。然後將該溶解了的融合蛋白裂解，所需的肽被分離並純化，然後對該肽加以使其再摺疊成一種有生物學活性的構象的條件，例如，在需要形成蛋白內的二硫鍵時去除離液劑和氧化。
通常所說的b-型鈉尿肽或BNP在人體中以一種32-胺基酸的肽出現，這種物質在體內是通過一種134-胺基酸的前體蛋白的裂解而產生的。編碼該人類b-型鈉尿肽前體蛋白的DNA序列已被分離出(US Patent No5114923)。經人體臨床實驗證明，b-型鈉尿肽可在無直接心臟刺激(這可以引起有害的副作用，如心律不齊等)的情況下改善心功能，降低某些可引起增加死亡率的神經激素水平並促使改善心力衰竭。因此，b-型鈉尿肽可用於治療充血性心力衰竭患者。
儘管b-型鈉尿肽在臨床上優於其它用於治療充血性心力衰竭患者的藥物，但是比起非肽類藥物，生產肽類藥物的相對高的成本卻成為臨床實踐中使用該類藥物的一個難以接受的阻礙。因此，需要提供一種減低成本並高效生產b-型鈉尿肽的方法。以包含體形式的該肽重組體的生產存在著幾個問題。使用一種融合蛋白進行酶裂解來生產b-型鈉尿肽是不合適的，因為所需的酶成本太高。如果希望用離子交換層析作為一種純化步驟生產相對高等電點的b-型鈉尿肽(大於或等於10)，應避免使用一種離子型離液劑，例如鹽酸胍，因為離子型離液劑會干擾離子交換層析。另一方面，如果進行融合蛋白的酸裂解，用脲這種最常用的非離子型離液劑是有問題的，在高溫酸性條件下，脲的存在會導致肽的降解。
本發明中，融合蛋白的酸裂解是在無離液劑情況下進行的，產生可溶解的b-型鈉尿肽。該可溶解的肽可從融合配偶體及其它不溶性的雜質中分離出，可採用任何方便的已知方法將可溶解的蛋白從其它不溶的蛋白中分離，如超濾法，滲濾法或離心方法。因為從商業的角度來看，超濾法和離心方法不是最理想的分離方法，本發明的一個優選實施方案中在裂解後採用了對不溶性物質的溶解，然後用非離子型離液劑，如尿素，並用離子交換層析法分離b-型鈉尿肽。
本發明提供了一種有效的生產等電點高於8或低於5的肽的方法。本發明所述方法的一個優選實施方案包括如下步驟(A)在一個重組宿主細胞中以一種融合蛋白的形式表達所述的肽，其中，所需的肽在其N-末端與一種融合配偶體融合，該融合配偶體在其C-末端包括具有Asp殘基的胺基酸序列，其中(Ⅰ)該融合配偶體的C端Asp殘基和該肽的N端殘基形成一個在酸性條件下可斷裂的鍵；(Ⅱ)該肽與融合配偶體、任何經酸裂解融合配偶體所產生的不需要的片段之間具有足夠的淨電荷差別，使該肽能夠通過離子交換層析從融合配偶體和任何融合蛋白的不需要的酸裂解片段中分離出來；(Ⅲ)該融合蛋白在重組宿主細胞中形成包含體；(B)從重組宿主細胞中回收包含體；(C)在無離液劑情況下將融合蛋白置於酸性條件，將肽與融合配偶體之間進行裂解；(D)用一種非離子型的離液劑對不溶性的裂解產物進行溶解化處理，其條件是使其變得可溶但又不破壞肽的一級結構；(E)用離子交換層析分離肽。
本文還提供一種表達載體，可用於表達一種在酸性條件下可裂解的融合蛋白，得到所需的等電點高於8或低於5的肽，所述的載體包括
(A)一種在宿主細胞中能夠指導融合蛋白表達的調節序列；(B)一種編碼修飾的氯黴素乙醯轉移酶的至少一部分胺基酸序列的DNA序列，其中足夠量的編碼賴氨酸、精氨酸、和/或組氨酸殘基的密碼子已被替換為編碼不帶電荷或帶負電荷胺基酸的密碼子，使該融合蛋白的等電點在6.0-8.0之間。
(C)一種編碼天冬氨酸的密碼子，它被直接或通過一種連接子序列連接於編碼修飾的氯黴素乙醯轉移酶DNA序列的3′端；(D)一種編碼所需肽的DNA序列，所述肽的等電點高於8或低於5，並且其N端有脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、亮氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或纈氨酸殘基，所述序列在其5′端與編碼修飾的氯黴素乙醯轉移酶DNA序列的3′端相連接。
圖2上面一行是野生型phoA啟動子的DNA序列，下面一行是修飾的phoA啟動子的DNA序列。
圖3是pTH85的質粒圖。
圖4是pSP54的質粒圖。
圖5是pCB101-1的質粒圖。
圖6是pTH76的質粒圖。
圖7是pTH53的質粒圖。
A．本發明的生產方法本發明的方法用於生產等電點高於8或低於5的純化的肽。儘管本發明在此以具有較高等電點的b-型鈉尿肽為例，但本發明的方法也適用生產有較低等電點的肽，只要所需的肽與融合配偶體、任何經酸裂解融合蛋白產生的不需要的片段(例如，在除了融合配偶體和所需肽的接合處裂解所產生的片段)具有足夠的淨電荷差，並可使所需的肽通過離子交換層析從裂解混合物中分離出。肽與其它裂解產物，包括任何在裂解混合物中完整的融合配偶體淨電荷之差優選至少為±2左右，最佳至少為±3左右。這樣，如果選擇一種具有一個或多個酸內切位點的融合配偶體，該融合配偶體的每個裂解產物應具有與所需的可通過離子交換層析分離的肽足夠的淨電荷差。
選擇融合配偶體還應對融合蛋白形成的包含體加以考慮。選擇一種合適的融合配偶體將部分地依賴於所生產的肽的性質。優選地，融合配偶體含有至少約50個胺基酸的殘基。儘管融合配偶體的胺基酸殘基的數量沒有上限，但最好不超過100，因為在融合配偶體中大的胺基酸殘基數目一般會產生較低產量的所需肽。也可以優選這樣一種融合配偶體，該融合蛋白中含有約25-50個疏水的胺基酸殘基，從而促進包含體的形成。
該融合配偶體在C端具有天冬氨酸殘基與肽的N端相連。
優選地，融合配偶體的選擇使融合蛋白的等電點在6.0-8.0之間，更優選在6.5-7.5之間。本發明特別優選的融合配偶體含有修飾的氯黴素乙醯轉移酶至少一個N端部分。將氯黴素乙醯轉移酶的胺基酸序列用不帶電或帶負電荷的胺基酸置換足量的賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸殘基而進行修飾，使該融合蛋白的等電點在6.0-8.0，更優選在6.5-7.5。對氯黴素乙醯轉移酶序列可以進行的其它修飾包括(A)用除半胱氨酸、色氨酸、蛋氨酸以外的其它胺基酸殘基置換半胱氨酸、色氨酸、蛋氨酸胺基酸殘基；(B)用疏水的胺基酸殘基置換一種或多種酸性或鹼性胺基酸殘基，以達到電荷平衡。
置換半胱氨酸、色氨酸、蛋氨酸殘基，可起到消除可能涉及所需要的肽的不需要的氧化副反應的作用。用疏水胺基酸殘基替換賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸既可以減低融合配偶體帶電殘基的等電點和百分比，又可以引入疏水性，促進包含體的形成。修飾的氯黴素乙醯轉移酶序列在C端的天冬氨酸殘基可以與氯黴素乙醯轉移酶序列直接連接或通過一個連接序列連接。一種連接子序列可以作為插入表達載體的提供限制性位點的密碼子翻譯的結果。如果用本發明的方法生產所需要的肽含有一種酸內切位點，如前所述，在融合配偶體和肽的連接處所形成的酸裂解位點一定比肽的內切位點具有較高反應速率。例如，人b-型鈉尿肽含有易受酸裂解影響的Asp-Arg二肽。根據本發明，我們已經表達了此肽與修飾的氯黴素乙醯轉移酶序列的融合蛋白，其中在融合配偶體與b-型鈉尿肽的結合處形成了Asp-Ser二肽。由於兩種二肽酸解的速率不同，我們已經能夠得到較高產量的所需肽，儘管酸解時由於在肽內部的裂解點上裂解有一些肽的損失。我們還運用本發明的步驟生產b-型鈉尿肽(2-32)。這個分子與全長32-胺基酸形式有相同的生物學活性。由於在其N端存在脯氨酸，導致從融合配偶體產生更加有效的裂解，使得產量更加增高。
融合蛋白是在宿主細胞中使用已知的重組DNA技術表達的。可以使用任何適當的已知用作通過重組DNA方法表達蛋白的宿主細胞，包括原核的和真核的宿主細胞及細胞系。大腸桿菌是一種較優選的宿主細胞。宿主細胞含有一種在調節序列控制下編碼融合蛋白的表達載體，這種調節序列能夠引導在宿主細胞中的表達，以及在宿主細胞中有功能的複製起點。載體還可含有其它通常用在重組DNA技術中的DNA序列，如編碼可選擇的標記的序列。
在適當的條件下生長含有表達載體的宿主細胞並表達融合蛋白。宿主細胞的生長條件和融合蛋白的表達條件將會根據各種不同因素而改變，例如，所使用的宿主細胞種類、啟動子和被表達的特殊融合蛋白。本領域的技術人員能夠根據所使用的特殊宿主或載體系統來確定適當的條件。
在融合蛋白以包含體的形式被表達之後，該包含體從宿主細胞中被回收。這可用已知的方法進行，如用化學或機械方法裂解細胞，用離心方法分離包含體。典型的方法是用幾倍體積的裂解緩衝液稀釋細胞漿，用AVP勻漿器以9000-10000psi壓力裂解細胞。細胞的裂解物再用緩衝液稀釋並離心以回收包含體。
然後將包含體在酸性條件下從所需的肽裂解融合配偶體。為避免產生引起肽降解的條件，酸裂解是在無離液劑存在的情況下進行的。可以將包含體懸浮在酸性水溶液中在提高溫度的情況下實現裂解。包含體在懸浮液中優選的濃度為5-15％w/v，更優選的濃度為5-8％w/v，酸性水溶液pH為1.7-2.2，優選為1.9-2.1。進行裂解優選的酸是鹽酸，然而，也可以用其它酸進行，如可用乙酸和磷酸。裂解使在足夠高的溫度下進行充足長的時間以提高產量。進行裂解的典型溫度是約75℃-95℃，時間為約2小時-約10小時。在生產b-型鈉尿肽時，進行酸裂解是通過將包含體在水中稀釋至10％w/v來進行的，用鹽酸調pH至2.0，在85℃保溫4.5-5.5小時。
從商業的角度來看，由於超濾和沉澱不是最理想的步驟，因此在裂解後，融合配偶體和肽優選通過用一種非離子型離液劑，優選尿素，進行處理來溶解，然後用離子交換層析分離肽。在加入離液劑之前，優選將懸浮液冷卻至50℃或更低的溫度，比如40℃以下。可通過加入濃度約為3M-7M的固體尿素並在低於40℃的溫度下，優選在室溫下(18-25℃)保溫進行溶解。
將pH調至3-7.5，優選在3.8-4.2之後，可將含有裂解的融合配偶體和肽的溶液直接加在離子交換柱上。任何市售的用作肽的分離的離子交換柱均可使用。對於b-型鈉尿肽，本發明採用一種硫丙基離子交換柱(Pharmacia Streamline)。將柱子平衡並洗滌，洗脫汙染物。然後用一種合適濃度的鹽將所需的肽從柱子上洗脫。對於b-型鈉尿肽，優選地，用0.5-0.6M濃度的NaCl溶液從柱子上洗脫。
許多情況下，從離子交換柱上回收的肽將重新摺疊為其天然構象，然而，可能會需要有一些額外的步驟將肽恢復到有生物學活性的形式，特別是，為保持生物學活性當這種肽需要形成內部二硫鍵時。b-型鈉尿肽含有兩個必須形成二硫鍵的半胱氨酸殘基。這可以將回收的肽進行氧化來進行。氧化反應的進行通常是將肽加熱然後暴露在空氣中攪拌即可。可選擇地，可使用如Cu+2,I3-或Fe(CN)6-3作為氧化劑。
如有需要，本領域的技術人員可用一些已知技術進行進一步的純化。這些步驟包括，高壓液相層析，比如RP-HPLC，或其它離子交換層析方法。對於生產b-型鈉尿肽，回收的肽用RP-HPLC純化，用pH為5.0-5.5的乙酸銨緩衝液和乙腈進行梯度洗脫。
B．本發明的表達載體本發明還提供了一種適於本發明生產方法的表達載體。這種表達載體利用編碼氯黴素乙醯轉移酶的胺基酸序列的至少一個N末端部分的DNA序列，該氯黴素乙醯轉移酶已被修飾，使足量的賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸殘基的密碼子被不帶電荷的或帶負電荷的胺基酸密碼子所替代，使融合蛋白的等電點在6.0-8.0,優選範圍是6.5-7.5。更方便地，某些賴氨酸、精氨酸和/或組氨酸殘基可以被疏水殘基所替代。這些疏水殘基不僅減少融合配偶體的淨電荷，而且促進宿主細胞內的包含體的形成。如果需要，天然氯黴素乙醯轉移酶中的一個或多個密碼子色氨酸、半胱氨酸和/或蛋氨酸殘基可以被除了色氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸的殘基密碼子所替代，以防止不期望出現的氧化副反應，例如與b-型鈉尿肽發生的二硫鍵合作用，從而提供等電點在所需範圍內的融合蛋白。
在

圖1中，上面一排胺基酸序列代表氯黴素乙醯轉移酶N端前78個胺基酸的天然胺基酸序列。下面一排代表修飾了的氯黴素乙醯轉移酶序列，該序列被常用於表達一種適於生產b-型鈉尿肽的融合蛋白的載體編碼。從蘇氨酸(位置在74)開始的5個胺基酸代表一種連接序列，連接C端Asp到修飾的氯黴素乙醯轉移酶序列並引入一個AgeⅠ位點。該AgeⅠ位點的產生是通過胺基酸74和75密碼子的突變。
在本發明的載體中，編碼修飾的氯黴素乙醯轉移酶的DNA序列受到調節序列的控制，該調節序列能夠指導融合蛋白在宿主細胞中的表達。可以使用任何適當的啟動子，例如，trpLE,phoA或lacZ啟動子。優選的啟動子是大腸桿菌phoA啟動子(Wanner,B.L.:Escherichia coli andSalmonella,2ndedition Neidhardt,P.C.et al.Eds.,ASM Press,Washington,D.C.pp-1357-1381.)這種啟動子在生長培養基中無磷酸鹽存在時起始編碼融合蛋白的DNA序列轉錄。本發明所使用的phoA啟動子是從天然大腸桿菌突變而得到的，以氯黴素乙醯轉移酶翻譯初始信號ATG代替天然GTG信號。圖2上面一排是野生型phoA啟動子的DNA序列，下面一排是本發明所使用的生產b-型鈉尿肽表達載體的修飾的phoA啟動子的DNA序列。
編碼所需肽的DNA序列在5′端和融合蛋白的3′端的密碼子Asp連接。編碼該肽的DNA序列在其5′端有Pro,Gly,Ser或Leu的密碼子。所選擇的特定的胺基酸將部分依賴於所需肽的序列。如果肽內部含有一個或多個酸裂解位點，就必須選擇N端的胺基酸，使融合配偶體與肽接合處的裂解位點裂解的速率大於肽內部裂解位點裂解的速率。如果所需肽的天然序列的N端不含有Pro,Gly,Ser或Leu，則編碼該肽的DNA通過在所需肽的5′端放置一個密碼子而被修飾。這將會導致在肽與融合配偶體裂解後，緊接著在肽的N端產生一個其它胺基酸，如果其不影響生物學活性，就可以被接受。在b-型鈉尿肽的情況中，N端的胺基酸是Ser。這種胺基酸在與融合配偶體的接合處是可接受的，因為b-型鈉尿肽僅含有一個內部酸裂解位點，Asp-Arg，這個位點的裂解速率大大低於Asp-Ser的裂解速率。
用眾所周知的DNA重組技術可以製備本發明的表達載體並導入宿主細胞中。
下文列舉的非限定的實施例是為了進一步說明本發明在本文中所述的實際操作。實施例1中在一種大腸桿菌W3110宿主中的質粒pCB101-1已提交美國典型培養物保藏中心保藏(American Type Culture Collection,Manassas,VA)，保藏號是ATCC 98774。實施例1中在一種大腸桿菌W3110宿主中的質粒pTH 76已提交美國典型培養物保藏中心保藏(AmericanType Culture Collection,Manassas,VA)，保藏號是ATCC 98775。實施例2中在一種大腸桿菌W3110宿主中的質粒pTH 53已提交美國典型培養物保藏中心保藏(American Type Culture Collection,Manassas,VA)，保藏號是ATCC 98776。
實施例1編碼一種與b-型鈉尿肽的融合蛋白的基因的合成及克隆5微克抗四環素質粒pCBl01-1，它編碼trp啟動子和一種b-型鈉尿肽與153胺基酸修飾的氯黴素乙醯轉移酶N端部分的3′端融合的融合蛋白，用NdeⅠ和AgeⅠ消化。所得的消化產物用1％瓊脂糖凝膠(SeaPlaque,FMC,Rockland,ME)進行電泳，切下3.4Kbp片段。
合成了具有下述序列的寡核苷酸寡核苷酸1099TATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCACCGTTGAT(SEQ ID NO:1)
寡核苷酸1100CAGAACATGATATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCCA(SEQ ID NO:2)寡核苷酸1101ATATCCCAATATCATGTTCTGGAACATTTTGAGGCATTTCAGTCAGTTGCTCAATCAACC(SEQ ID NO:3)寡核苷酸1102TATAACCAGACCGTTCAGCTGGATATTACGGCCTTTTTAGAAACCGTAGAAGTTAATGTT(SEQ ID NO:4)寡核苷酸1103AAAGGCCGGATAAAACAGGTGAACATTAACTTCTACGGTTTCTAAAAAGGCCGTAATATC(SEQ ID NO:5)寡核苷酸1104CAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTTGATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAATGTTC(SEQ ID NO:6)寡核苷酸1105CACCTGTTTTATCCGGCCTTTATTCACATTCTTGCCGTTCTGCTGAATGCTCATCCGCTGTTCA(SEQ ID NO:7)寡核苷酸1106CCGGTGAACAGCGGATGAGCATTCAGCAGAACGGCAAGAATGTGAAT(SEQ ID NO:8)用ATP和T4多核苷酸激酶將寡核苷酸1100-1105每種1微克分別磷酸化，並分別與寡核苷酸1099-1106每種1微克結合。然後將這些寡核苷酸混合物加熱煮沸，保持7分鐘，使其變性，逐漸冷卻至室溫。在214微升反應混合物中取5微升與1.5微升切下的熔化pCB101-1片段連接，該片段是用上述T4DNA連接酶在室溫過夜製備的。將該混合物重新熔化並用於轉化大腸桿菌株MC1061為抗四環素型。為得到具有317bpAgeⅠ/MluⅠ片段的質粒，篩選了8個所得到的菌落。一種這樣的質粒被稱為pTH80，在trp控制下編碼一個與b-型鈉尿肽融合的修飾的CAT序列。
在發酵期間能夠控制融合蛋白的合成是很重要的。通過排除PO4達到完全誘導之前，PhoA啟動子能夠保持目的基因的未誘導狀態。為了使融合體被置於PhoA啟動子控制之下，用NdeⅠ和HindⅢ限制酶對pTH80進行消化。然後將消化產物用3％瓊脂糖凝膠進行電泳(NuSieve,FMC,Rockland,ME)，切下編碼CAT-BNP融合的332個bp片段。該載體片段的製備是用NdeⅠ和HindⅢ限制酶對抗四環素質粒pTH76進行消化。除了trp啟動子被PhoA啟動子替代以外，pTH76非常類似於pTH80。該載體片段的分離是用NdeⅠ和HindⅢ對2.4微克的pTH76進行消化，在37℃過夜，然後在37℃加入牛小腸磷酸酶1小時。反應混合物的終體積是100微升。1微升的載體片段和3微升的含有pTH80插入片段的熔化電泳凝膠切片間進行連接。在室溫培育過夜後，該混合物被用於轉化W3110株。篩選從產生的菌落中製備的DNA，尋找單一的BstⅪ位點的存在。通過DNA測序，確定3個陽性克隆。其中1個被稱為pTH85，圖3是pTH85的質粒圖。
質粒pTH85和其它2個從其結構中陽性克隆被用於轉化大腸桿菌株W3110為四環素抗性型。單個的菌落在L液體培養基中與6.25μg/ml四環素培育，在37℃培育4小時後，將得到的培養物接種至含有下述培養基，光密度為0.1的培養物中葡萄糖4g酪蛋白胺基酸 5g1M鉀MOPS緩衝液，pH7.4 40ml(NH4)2SO41.24g1MMgSO42ml水加至終體積1升在37℃溫育過夜後，所有的細胞都能在相差顯微鏡下觀察到至少具有一相明視包含體。細胞在SDS樣品緩衝液中被恢復並煮沸18分鐘，然後用標準Laemmli Tris-glycine SDS聚丙烯醯胺凝膠進行電泳。由在約12千道爾頓處遷移的深色考馬斯染色帶表明有高豐度累積的b-型鈉尿肽融合蛋白存在。
實施例2克隆編碼b-型鈉尿肽(2-32)融合蛋白的基因在Asp-Pro肽鍵酸裂解發生速度最快。由於成熟的b-型鈉尿肽的第二殘基是Pro，通過表達一種截斷型的(truncated version)包括有胺基酸殘基2-32的b-型鈉尿肽，能夠促使b-型鈉尿肽從融合配偶體裂解。構建了一種改變了形式的AgeⅠ/HindⅢ限制性內切酶酶切片段，該片段缺少成熟b-型鈉尿肽的原來的絲氨酸密碼子，方法是將野生型編碼序列進行PCR，用下列二種寡核苷酸作為PCR引物寡核苷酸754:
GTGGTGGTACCGGTGGTGACCCGAAAATGGTTCAG(SEQ ID NO.:9)寡核苷酸PR 1279:
CCTACTCTCGCATGGGGAGA(SEQ ID NO:10)製備100μl的反應混合物，其中含有0.4 mM每種dNTP,1.3μg每種引物，50ng攜帶b-型鈉尿肽序列，並與克隆的人類遍在蛋白質3′端融合的質粒pTH53，以及1μl VENT DNA聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)在生產商製造的反應緩衝液中。反應進行30個循環周期，以下列溫度與時間進行94℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，72℃ 1分鐘。預計長度的167個bp用3％Nusieve瓊脂糖凝膠電泳檢驗。該PCR反應產物與載體質粒pTH53用KpnⅠ HindⅢ3進行二次消化。將載體消化產物再用牛小腸磷酸酶在37℃處理45分鐘，然後用苯酚提取和乙醇沉澱。將質粒消化產物然後重新懸浮於30μl Tris-EDTA緩衝液中。將該PCR產物經3％Nusieve電泳，用DE81紙獲取遷移帶回收108bp片段。載體與PCR消化片段的連接在20μl反應混合物中進行，該反應混合物包括0.5μl載體DNA、0.1μl PCR片段、0.5μl T4連接酶(New England Biolabs,Beverly,MA)溶於製造者提供的緩衝液中。連接反應在室溫進行3小時，然後轉化為二氯化鈣感受態大腸桿菌B。質粒DNA從兩個產生的轉化體中製備，使用雙脫氧DNA測序以確定所獲得的是正確的核苷酸序列。這種質粒被命名為pUDBNP2，編碼框內融合的b-型鈉尿肽的人類遍在蛋白質(2-32)。
對於構建一種表達CAT154與b-型鈉尿肽(2-32)基因融合的表達質粒，當質粒pCB101-1編碼CAT154融合配偶體時，質粒pUDBNP2作為b-型鈉尿肽(2-32)編碼序列源，被用作b-型鈉尿肽(2-32)片段的受體。5μgpUDBNP2和1μgpCB101-1分別在37℃與AgeⅠ在製造者(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)提供的緩衝液中消化2小時。用瓊脂糖凝膠電泳檢查消化反應是否進行完全。用GeneClean(Bio101,CA)從消化反應混合物中回收DNA，並以15μl的終體積洗脫。然後將兩種質粒在37℃用BamHⅠ在製造者(New England Biolabs,Beverly,MA)提供的緩衝液中消化1.5小時。瓊脂糖凝膠電泳檢查表明pUDBNP2消化反應進行不完全，因此，部分消化的DNA用GeneClean回收，用BamHⅠ按前述方法進行再次消化。此時，瓊脂糖凝膠電泳檢查表明pUDBNP2和pCB101-1消化反應都已進行完全。經3％Nusieve電泳，從pUDBNP2消化產物中切下2407鹼基電泳帶，並從pCB101-1消化產物中切下1562鹼基電泳帶，製備連接片段。用GeneClean回收DNA片段，以10μl的終體積洗脫。用2μl pUDBNP2 DNA片段和5μl來自pCB101-1的DNA片段的混合物在15℃與1μl T4DNA連接酶在製造者(New England Biolabs,Beverly,MA)提供的緩衝液中反應過夜，達到兩種片段的連接。所得的混合物轉化為二氯化鈣感受態大腸桿菌W3110。將從所產生的6種轉化物中製備的質粒DNA用BglⅠ進行消化，根據存在2845 bp和890 bp片段鑑別正確結構的質粒。預期來自抗四環素區的234bp帶因太小而觀察不到。此外，將用作質粒DNA製備的培養物也接種在小LB培養物上，並在37℃溫育過夜。所產生的細胞在相差顯微鏡下觀察到，將其它部分在SDS樣品緩衝液中煮沸並用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳進行分析。在6個以此方式處理的菌落中，3個給出正確限制圖譜的菌落在顯微鏡下也顯示出存在包含體及在SDS-PAGE中顯示出約20500道爾頓的深色考馬斯染色帶。這種質粒被命名為pSP54。圖4是pSP54的質粒圖。
實施例3b-型鈉尿肽(1-32)的生產和分離(A)發酵和細胞裂解包含有b-型鈉尿肽(1-32)的大腸桿菌表達載體(pTH85/THE 102)以補料分批方式發酵。在此系統中，去除培養基中的磷酸鹽引起誘導融合蛋白的表達。在培養完成時，收穫43升全發酵液體培養基。將全發酵液體培養基置於一個1升的瓶中進行離心，收集所得到的生物量，並在-70±10℃存放。從43升發酵液中產生的生物量為4.7kg溼重的大腸桿菌細胞。該冷凍的生物質在室溫下經過一夜解凍，用裂解緩衝液(20mMNaxHxPO4,5mM EDTA,pH6.0)稀釋到25％w/v。將該細胞用帶有冷熱交換器的Maton-Gaulin Model 30 CD(9-10000psi)勻漿器攪勻。在開始裂解之前，將細胞溶液冷卻至2℃，並在整個裂解過程中保持溫度低於15℃。通過勻漿器的液體流回細胞溶液中，使6次經過勻漿器的平均數經顯微鏡檢查達到在勻漿終點時大於90％的標準。
(B)經分批離心回收包含體在一個1升的聚丙烯瓶中，用帶有H6000轉頭的Sorvall RC-3B離心機進行分批離心。用裂解緩衝液將大腸桿菌細胞裂解產物稀釋至起始細胞重量的12.5％，然後用帶有H6000轉頭的Sorvall RC-3B離心機進行40分鐘離心，離心速度為4500轉/分(5894g)。傾去上清液，將905g包含體沉澱物在2-8℃貯存。
(C)酸裂解反應從上述製備的包含體製備酸裂解反應混合物。從2-8℃貯存液中取出包含體，並用手提式勻漿器重新懸浮至1980ml(100g包含體/220ml)去離子水中。相當於100克溼重的這種懸浮液液體被進一步處理。用780ml去離子水稀釋該包含體製備物，得到10％溼重的懸浮物。用約4ml濃鹽酸調節該包含體懸浮物的pH，至1.99。當pH調到4.5和3.0之間時，溶液會變得很濃，需要劇烈攪拌。
將上述包含體懸浮物置於一個備有攪拌器、加樣口、提供惰性氣體連接管的溫控搪瓷反應容器中。惰性氣體可以通過通氣口以5psi(磅/平方英寸)的壓力進入反應容器。打開溫控器並調至合適的溫度設置，此時記錄反應開始時間。此時進行加熱，至40℃，關閉通氣口，使反應容器中的壓力為5psi。在調節溫度期間有時可以通入一些惰性氣體，以保持與開始的壓力一致。反應混合物在所需溫度的上下5℃範圍內保持15分鐘。整個反應期間的溫度控制在85±0.5℃。定時取樣(1小時或30分鐘一次)，用RP-HPLC分析分離出的b-型鈉尿肽。取樣的操作應該是先關閉氣體入口閥，使容器與大氣壓連通後再進行。最後用任意形式的注射器從取樣口中抽取1ml樣品。關閉取樣口重新打開氣體入口，通入氣體5-10秒，最後再關閉通氣口，使容器重新加壓。
4.5小時後，將反應容器置於冰上冷卻使反應停止。在冷卻期間繼續攪拌反應溶液。在少於20分鐘以內將溫度降至40℃以下。在冷卻期間結束時，用2N NaOH將反應混合物的pH調至2.9。該溶液中的b-型鈉尿肽含量用RP-HPLC峰面積測定為每升含b-型鈉尿肽1.92g。將該溶液在-70±10℃冷凍保存，直到進行下一步操作。
(D)從酸裂解反應混合物中得到的b-型鈉尿肽(1-32)的IEC純化將前述所製備的用於b-型鈉尿肽IEC純化的四種酸裂解反應混合物合併，在1升酸裂解反應混合物中加入260克固體尿素，使尿素濃度達到3.5M。終體積為1.3升。該溶液含有0.6mg b-型鈉尿肽/ml或780mg b-型鈉尿肽。將溶液裝入一個(Whatman Express-Ion Exchanger S次硫酸乙基離子交換樹脂)填充柱中，根據RP-HOLC試驗，裝入8mg hBNP/ml。將該柱用200ml 3.5mM尿素溶液、50mM pH3.5的乙酸、500ml 50mM乙酸、600ml 10mM二硫蘇糖醇(DTT)、50mM pH7.2的磷酸鈉依次洗脫，最後用1L 55mM NaCl在50mM,pH6.8的磷酸鈉中的溶液洗脫。從柱上全部還原的b-型鈉尿肽用1L 500mM NaCl在50mM,pH6.8的磷酸鈉中的溶液分級梯度洗脫。收集150ml洗脫峰，進行b-型鈉尿肽含量分析，總共590mg。將洗脫液在-70±10℃冷凍保存，直到進行下一步操作。
(E)形成二硫鍵145ml離子交換柱洗脫液在4℃過夜解凍，使升溫至室溫。用50mM,pH6.8的磷酸鈉稀釋至b-型鈉尿肽1.4mg/ml。二硫鍵的形成是在35℃時，將溶液放置空氣中氧化6小時並適當攪拌來完成的。通過加入5M乙酸使反應液酸化，使達到pH5.0而終止反應。將氧化的反應液在-70±10℃冷凍保存，直到進行下一步操作。
(F)b-型鈉尿肽反相HPLC純化將前述的兩種氧化的反應液在2-8℃過夜解凍，使升溫至室溫。用5N氫氧化銨調pH至5.5。將該溶液(b-型鈉尿肽869mg/756ml)與一種混合溶劑(Load:Buffer B 85:15)以10.6ml/min速度裝入製備的RP-HPLC柱(Zobax Pro 10/150 C8)，使填充物中得到6％的乙腈。裝入的樹脂量是9.8mg/ml。根據與下表中列出的同樣的流速進行洗脫。緩衝液A是純化的水，緩衝液B是40％乙腈，緩衝液C是1M,pH為5.5的乙酸銨。
用分析RP-HPLC分析洗脫峰部分，合併純度大於96％的部分。合併的RP-HPLC洗脫液含有406mg b-型鈉尿肽(1-32)。
(G)酸裂解反應得到的b-型鈉尿肽(1-32)鑑定通過完整的N末端胺基酸測序、胺基酸分析和電噴射質譜分析，鑑定經過酸裂解、IEC層析、RP-HPLC純化製備的b-型鈉尿肽RP-HPLC主峰，每種鑑定都證明本方法所製備的肽與合成的b-型鈉尿肽標準品完全一致。
實施例4用超濾和滲濾方法純化酸裂解得到的b-型鈉尿肽(1-32)作為一種選擇，為用於層析而溶解的酸裂解反應混合物，可溶解的b-型鈉尿肽粗品可從酸裂解混合物中用滲濾方法分離出。還原的b-型鈉尿肽通過濾器，收集較高分子量的部分，留下不溶的物質。b-型鈉尿肽可以自由通過濾膜，在濾液中被發現。
使用一種帶有標示分子量的Filtron ultrasette濾器300KD(Filtron,Cat#OS100C72)，操作方法按製造商說明書。用蒸餾水洗滌該裝置，然後用20mM乙酸鈉，150mM氯化鈉，pH4.0的溶液進行平衡。
按上述方法製備1升酸裂解反應混合物。該溶液含有705mg還原的經RP-HPLC峰面積測定的b-型鈉尿肽(RT 112/123,1/26/96)。將此溶液置於一個2升的Pyrex瓶中，加入60ml 5M的氯化鈉。將反應混合物在冰上攪拌25分鐘，然後加入60ml蒸餾水、100ml 0.2mM pH4.0的乙酸鈉。將反應混合物在冰上繼續攪拌20分鐘，然後用蠕動泵將該混合物循環通過滲濾裝置，循環速率保持在2L/分。在循環開始時，濾液的出口完全關閉，循環進行大約2分鐘後，濾液的出口慢慢打開，將濾液的流速控制在平均53.5ml/min(在25-82ml/min速度範圍內)。將滲濾緩衝液20mM乙酸鈉、150mM氯化鈉、pH4.0加至2升的瓶中，加入的速度與從濾器中放出濾液的速度相等，以保持滲濾溶液的體積恆定。在此裝置中，整個滲濾過程中保持跨膜壓小於10psi。收集完全部5700ml濾液後，停止往滲濾液中加入稀釋液。在滲濾過程完成前，另收集1L濾液。在滲濾過程結束時，收集的濾液總體積為6.7L。將濾液中的b-型鈉尿肽經RP-HPLC定量分析，表明回收了550mg b-型鈉尿肽，回收率為78％。
實施例5b-型鈉尿肽(2-32)的製備和分離(A)發酵和細胞裂解包含有b-型鈉尿肽(2-32)的大腸桿菌表達載體pSP54以補料分批方式發酵。該系統使用trp啟動子，通過加入吲哚丙烯酸誘導融合蛋白的表達。在培養完成時，收集4.7升全發酵液體培養基。將全發酵液體培養基置於一個1升的瓶中進行離心，收集所得到的生物量，並在-70±10℃存放。從4.7升發酵液中產生的生物量為432g溼重的大腸桿菌細胞。該冷凍的生物質在室溫下經過一夜解凍，用斷裂緩衝液(20mMNaxHxPO4,5mM EDTA,pH6.0)稀釋到25％w/v。將該細胞用帶有冷熱交換器的AVP Gaulin Model 30 CD(9-10000psi)勻漿器攪勻。在開始斷裂之前，將細胞溶液冷卻至2℃，並在整個裂解過程中保持溫度低於15℃。通過勻漿器的液體流回細胞溶液中，使4次經過勻漿器的平均數經顯微鏡測定達到在勻漿終點時斷裂大於90％。
(B)經分批離心回收包含體在一個1升的聚丙烯瓶中，用一個冷凍的帶有H6000轉頭的SorvallRC-3B離心機進行分批離心。用裂解緩衝液將大腸桿菌細胞裂解液稀釋至起始細胞重量的12.5％，然後用帶有H6000轉頭的Sorvall RC-3B離心機進行40分鐘離心，離心速度為4500轉/分(5894g)。傾去上清液，將包含體沉澱物111.5g在-70±10℃貯存。
(C)酸裂解反應從上述製備的包含體製備酸裂解反應混合物。從-70±10℃貯存液中取出包含體55.8g，並用手提式勻漿器重新懸浮至558ml去離子水中，得到10％溼重的懸浮物。用約28ml,1M鹽酸調節該包含體懸浮物的pH，至2.0。當pH調到4.5和3.0之間，溶液變濃時，需要劇烈攪拌。
將上述包含體懸浮物置於一個備有攪拌器、加樣口、提供惰性氣體連接管的溫控搪瓷反應容器中。惰性氣體(Ar)可以通過通氣口以5psi(磅/平方英寸)的壓力進入反應容器。打開溫控器並調至合適的溫度設置，此時記錄反應開始時間。此時進行加熱，至40℃，關閉通氣口，使反應容器中的壓力為5psi。在調節溫度期間有時可以通入一些惰性氣體，以保持與開始的壓力一致。反應混合物在所需溫度的上下5℃範圍內保持15分鐘。整個反應期間的溫度控制在85±1.5℃。定時取樣(30分鐘一次)，用RP-HPLC分析分離出的b-型鈉尿肽(2-32)。先關閉氣體入口閥後完成取樣，然後使容器與大氣壓連通，最後用任意形式的注射器從取樣口中抽取1ml樣品。關閉取樣口，重新打開氣體入口，通入氣體5-10秒，最後再關閉通氣口，使容器重新加壓。
2小時後，將反應容器置於冰上冷卻至20℃使反應停止。在冷卻期間繼續攪拌反應溶液。在冷卻期間結束時，在反應混合物中加入28ml 1M磷酸(最終濃度為50mM)並用10NNaOH將反應混合物的pH調至2.8。該溶液中的b-型鈉尿肽(2-32)含量用RP-HPLC峰面積測定為每升含b-型鈉尿肽(2-32)0.45g。(總共223mg還原的b-型鈉尿肽(2-32))。將該溶液在-70±10℃冷凍保存，直到進行下一步操作。
(D)從酸裂解反應混合物中得到的b-型鈉尿肽(2-32)的分批離子交換純化用分批培育方法從調節了pH的酸裂解反應混合物中用SP-SpherodexLS陽離子交換樹脂將b-型鈉尿肽(2-32)吸附。吸取500ml上述酸裂解反應混合物置於一個熱水浴中1.5小時，直至溫度升至22℃。將50mlSP-Spherodex LS樹脂按製造者說明書中的方法洗滌後，加入置於一玻璃容器中解凍的該反應混合物中，並進行適當攪拌。該反應混合物在室溫環境下攪拌90分鐘，每30分鐘的間隔取上清液一次。在混合結束時停5分鐘，使樹脂沉降。傾去上清，用250ml,50mM乙酸洗滌樹脂三次。然後將樹脂裝入一個柱(2.5×11.5cm)中，再用2倍柱體積(CV)的50mM乙酸洗滌樹脂，該乙酸pH是3.5，洗滌速度為8ml/分。然後再用4CV 50mMpH7.2的磷酸鈉洗滌柱子。用4CV 10mM二硫蘇糖醇(DTT)、50mMpH 7.2的磷酸鈉洗脫，完成在柱上的還原。最後用4CV 50mM pH7.2的磷酸鈉、含有200mM氯化鈉的5CV 50mM pH7.2的磷酸鈉洗脫。用450mM NaCl在50mM pH7.2磷酸鈉和1M NaCl在50mM pH7.2的磷酸鈉的溶液兩次洗滌後，完成全部還原的b-型鈉尿肽(2-32)的洗脫。收集全部330ml洗脫液，進行b-型鈉尿肽含量分析，總共148mg，產率為66％。將洗脫液直接用於進行下一步形成二硫鍵的操作。
(E)b-型鈉尿肽(2-32)形成二硫鍵將含有b-型鈉尿肽(2-32)0.45mg/mlr離子交換柱洗脫液330ml用2N鹽酸調pH至6.8。二硫鍵的形成是在氬氣中，2-8℃時，將11ml 15mMK3Fe(CN)6加入溶液中反應11小時而完成的。通過加入3.4ml 5M乙酸使反應液酸化至pH5.0終止反應。氧化反應得到的產物是121mg b-型鈉尿肽(2-32)，本步驟產率是82％。將氧化反應液置於2-8℃保存過夜。
(F)b-型鈉尿肽(2-32)反相HPLC純化將氧化反應液升溫至室溫，用反相HPLC方法進行進一步的純化。在342ml氧化反應液中加入乙腈18ml，共裝入360ml。用10N氫氧化銨調pH至5.5。將該溶液(b-型鈉尿肽(2-32)51mg/160m1)以4.5ml/min速度裝入RP-HPLC柱(Vydac C4 214TPl010)。裝入的樹脂量是3mg/ml。根據與下表中列出的同樣的流速進行洗脫。緩衝液A是5％乙腈，50mM乙酸銨，pH5.0，緩衝液B是50％乙腈，50mM乙酸銨，pH5.0。
手工收集洗脫峰部分，在合併洗脫液前用分析RP-HPLC進行分析，並在2-8℃貯存三天。合併純度大於95％的部分。經RP-HPLC分析，最終得到的合併液的純度大於97％。得到48mg b-型鈉尿肽(2-32)，本步驟產率是94％。
(G)酸裂解反應得到的b-型鈉尿肽(2-32)鑑定通過完整的N末端胺基酸測序、胺基酸分析和電噴射質譜分析，鑑定經過酸裂解、IEC層析、RP-HPLC純化製備的b-型鈉尿肽RP-HPLC主峰，所有三種試驗都證明按本程序所製備的肽是b-型鈉尿肽(2-32)。
權利要求
1．一種生產等電點高於8或低於5的純化的多肽的方法，包括(A)在一種重組宿主細胞中以一種融合蛋白的形式表達所述的肽，其中，所需的肽在其N-末端與一種融合配偶體融合，該融合配偶體在其C-末端包括具有Asp殘基的胺基酸序列，其中(Ⅰ)該融合配偶體的C端Asp殘基和該肽的N端殘基形成一個在酸性條件下可斷裂的鍵；(Ⅱ)該肽與融合配偶體、任何經酸裂解融合配偶體所產生的不需要的片段之間具有足夠的淨電荷差別，使該肽能夠通過離子交換層析從融合配偶體和任何融合蛋白的不需要的酸裂解片段中分離出來；(Ⅲ)該融合蛋白在重組宿主細胞中形成包含體；(B)從重組宿主細胞中回收包含體；(C)在無離液劑情況下將融合蛋白置於酸性條件，將肽與融合配偶體之間進行裂解；(D)用一種非離子型的離液劑對不溶性的裂解產物進行溶解化處理，所使用的條件是使其變得可溶但又不破壞肽的一級結構；(E)用離子交換層析分離肽。
2．權利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白的PI在6.0-8.0之間。
3．權利要求1所述的方法，其中所述的融合蛋白的PI在6.5-7.5之間。
4．權利要求1所述的方法，還包括將分離的肽置於使其重新摺疊成具有生物活性的三級結構，並形成生物學活性所需的分子內二硫鍵的條件下的步驟。
5．權利要求1所述的方法，其中所需的肽內部不含有在酸性條件下可裂解的二肽序列。
6．權利要求1所述的方法，其中所述的肽內部含有一個或多個在酸性條件下可裂解的二肽，其裂解速率低於融合配偶體的C端殘基和肽的N端胺基酸殘基形成的二肽的裂解速率。
7．權利要求1所述的方法，其中所述的肽是b-型鈉尿肽。
8．權利要求1所述的方法，其中在步驟(D)中所使用的非離子型的離液劑是尿素。
9．權利要求7所述的方法，其中，將肽用濃度為約3M至約7M的尿素處理。
10．權利要求1所述的方法，其中所述的肽在其具有生物學活性的構象時含有至少一個半胱氨酸殘基間的二硫鍵，並且步驟(F)是在導致二硫鍵形成的氧化條件下進行的。
11．權利要求9所述的方法，其中所述的肽是b-型鈉尿肽。
12．一種生產等電點高於8或低於5的純化的多肽的方法，包括(A)在一種重組宿主細胞中以一種融合蛋白的形式表達所述的肽，其中，所需的肽在其N-末端與一種融合配偶體融合，該融合配偶體在其C-末端包括具有Asp殘基的胺基酸序列，其中(Ⅰ)該融合配偶體的C端Asp殘基和該肽的N端殘基形成一個在酸性條件下可斷裂的鍵；(Ⅱ)該肽與融合配偶體、任何經酸裂解融合配偶體所產生的不需要的片段之間具有足夠的淨電荷差別，使該肽能夠通過離子交換層析從融合配偶體和任何融合蛋白的不需要的酸裂解片段中分離出來；(Ⅲ)該融合蛋白在重組宿主細胞中形成包含體；(B)從重組宿主細胞中回收包含體；(C)在無離液劑情況下將融合蛋白置於酸性條件，將肽與融合配偶體之間進行裂解；(D)用超濾、滲濾或離心方法從該裂解混合物中去除不溶性的裂解產物；(E)用離子交換層析分離肽。
13．權利要求1所述的方法，其中所述的肽在進行步驟(F)之後還進行一個或幾個其它的純化步驟。
14．權利要求13所述的方法，其中所述的肽是b-型鈉尿肽，並在進行步驟(F)之後依次進行反相HPLC層析和額外的離子交換層析。
15．一種在用於在一種宿主細胞中表達融合蛋白的載體，該融合蛋白在酸性條件是可裂解的，得到所需的等電點高於8或低於5的肽，所述的載體包括(A)一種在宿主細胞中能夠指導融合蛋白表達的調節序列；(B)一種編碼修飾的氯黴素乙醯轉移酶的至少一部分胺基酸序列的DNA序列，其中足夠量的編碼賴氨酸、精氨酸、和/或組氨酸殘基的密碼子已被替換為編碼不帶電荷或帶負電荷胺基酸的密碼子，使該融合蛋白的等電點在6.0-8.0之間。(C)一種編碼天冬氨酸的密碼子，它被直接或通過一種連接子序列連接於編碼修飾的氯黴素乙醯轉移酶的DNA序列的3′端；(D)一種編碼所需肽的DNA序列，所述肽的等電點高於8或低於5，並且其N端有脯氨酸、甘氨酸、絲氨酸、亮氨酸、丙氨酸、異亮氨酸或纈氨酸殘基，所述序列在其5′端與編碼修飾的氯黴素乙醯轉移酶的DNA序列的3′端相連接。
16．權利要求15所述的載體，其中，在編碼修飾的氯黴素乙醯轉移酶的DNA序列中一個或多個編碼賴氨酸、精氨酸、和/或組氨酸殘基的密碼子被編碼疏水胺基酸的密碼子替換。
17．權利要求15所述的載體，其中所編碼的融合蛋白的等電點在6.5-7.5之間。
18．權利要求15所述的載體，其中所編碼的肽是b-型鈉尿肽。
19．權利要求15所述的載體，其中所述調節序列包括phoA啟動子。
20．權利要求15所述的載體，其中所編碼的修飾的氯黴素乙醯轉移酶含有至少50個相應於氯黴素乙醯轉移酶的50個N端胺基酸殘基的殘基。
21．一種含權利要求15所述載體的宿主細胞。
22．一種含權利要求16所述載體的宿主細胞。
23．一種含權利要求17所述載體的宿主細胞。
24．一種含權利要求18所述載體的宿主細胞。
25．一種含權利要求19所述載體的宿主細胞。
26．一種含權利要求20所述載體的宿主細胞。
全文摘要
本發明提供了一種生產等電點高於8或低於5的多肽的方法,其中肽作為融合蛋白被表達,在該融合蛋白中肽通過一個酸裂解位點與一個融合配偶體連接。在無離液劑存在的情況下肽通過酸裂解與融合配偶體分離。該融合配偶體及其可能存在的酸裂解產物與所需的肽具有足夠的淨電荷差,使肽可通過離子交換層析被分離。
文檔編號C12N15/62GK1313896SQ99809946
公開日2001年9月19日 申請日期1999年7月8日 優先權日1998年7月10日
發明者N·史蒂芬·波利特, 道格拉斯·I·巴克利, 皮特·A·斯塔西斯, 塔伊瑪·E·哈特曼, 鍾紫陽 申請人:賽歐斯公司