Mir-34的合成模擬物的製作方法

2023-06-27 05:35:01

Mir-34的合成模擬物的製作方法
【專利摘要】實施方案關注牽涉miR-34模擬物，包括miR-34a和miR-34c模擬物的方法和組合物。在一些實施方案中，存在有具有經修飾的核苷酸的雙鏈RNA分子，其具有有miR-34a序列的活性鏈和互補的過客鏈。在別的實施方案中，存在有具有經修飾的核苷酸的雙鏈RNA分子，其具有有miR-34c序列的活性鏈和互補的過客鏈。
【專利說明】MIR-34的合成模擬物
[0001]發明背景
[0002]本申請要求美國臨時專利申請61/439，280的優先權，其在此通過提及併入本文。
[0003]1.發明領域
[0004]本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體而言，提供了用於治療疾病和/或狀況的牽涉RNA分子的方法和組合物，所述RNA分子至少具有miR-34的功能特性，和在一些實施方案中增強的與miR-34相關的特徵。在一些實施方案中，在所述範疇內提供了發揮miR-34a或miR_34c功能的RNA分子。
[0005]I1.背景
[0006]在2001年，幾個小組使用克隆方法從秀麗隱杆線蟲(C.elegans)、果蠅(Drosophila)、和人分離並鑑定一大類「微小 RNA，，(miRNA) (Lau 等，2001; Lee 和Ambros, 2001;Lagos-Quintana 等，2003)。
[0007]發表的人成熟微小RNA序列(其記載於資料庫miRBase 15.0 (Griffths-Jones等，2006))大小範圍為長度16-27個核苷酸，並且源自較長的前體。前體形成的結構在自身互補區中自身折回，並且受到核酸酶Dicer(在動物中)或DCLl(在植物中)加工以生成短的雙鏈成熟miRNA。成熟的miRNA鏈之一摻入蛋白質和miRNA的複合物中，所述複合物稱作RNA誘導的沉默複合物(RISC)。miRNA引導RISC複合物靶向mRNA，然後，該mRNA受到切割或翻譯沉默，這取決於miRNA與其靶mRNA的序列互補性程度。目前，認為完全或幾乎完全互補性導致mRNA降解，如在植物中最常觀察到的。比較而言，不完全鹼基配對(如主要在動物中找到的)導致翻譯沉默。然而，目前的數據提示額外的複雜性(Bagga等，2005;Lim等，2005)，而且miRNA實現的基因沉默的機制仍然在緊張的研究下。
[0008]研究已經顯示了眾多miRNA的表達水平變化與各種癌症有關(綜述見Calin和Croce, 2006;Esquela-Kerscher 和 Slack, 2006 ;ffiemer, 2007)。miRNA還已經牽涉調節細胞生長及細胞和組織分化，即與癌症形成有關的細胞過程。
[0009]多種miRNA的活性已經得到鑑定和分析。雖然先前在美國專利申請公開文本20080050744 (其在此通過提及收錄)中已經鑑定有效的miRNA模擬物，但是需要大大改善天然存在的miRNA的一種或多種特性的別的miRNA模擬物，特別在這些分子從實驗室移向臨床時。
[0010]發明概述
[0011]治療性微小RNA應當是穩定的、有活`性的、且與正確的mRNA靶物特異性雜交。實施方案關注miR-34a和miR-34c模擬物，其具有維持的和/或增強的對核酸酶消化的抗性、與正確的靶mRNA的雜交能力、和/或功能性。
[0012]實施方案關注含有成熟miR_34a序列的不同RNA分子。RNA分子可以是雙鏈的和/或平端的，這意味著該分子整個是雙鏈的和/或在兩個末端是平端的。此外，實施方案關注對所述RNA分子的化學修飾以產生具有改善的或增強的特性的miR-34a模擬物或miR_34c模擬物。雙鏈RNA分子的活性鏈含有成熟miR-34a序列。在某些實施方案中，雙鏈RNA分子的一條鏈的序列由成熟miR-34a序列組成。在某些實施方案中，雙鏈RNA分子的一條鏈的序列由成熟miR-34c序列組成。
[0013]在一些實施方案中，提供了雙鏈的RNA分子，這意味著該分子由兩條可以彼此分開的多核苷酸或鏈組成。雙鏈分子不包含髮夾分子，其是一條鏈或多核苷酸。在一些實施方案中，RNA分子在一個或兩個末端是平端的。在雙鏈RNA分子中，一條或兩條鏈的長度可以是18、19、20、21、22、23、24、或25個核苷酸，或者其中可導出的任何範圍。在某些實施方案中，雙鏈平端分子的長度是22或23個鹼基對(bp)。
[0014]涵蓋的是，在一些實施方案中，雙鏈RNA分子含有兩條彼此完全互補的鏈，這生成必然平端的分子。
[0015]在某些實施方案中，RNA分子具有包含成熟人miR-34a序列(5』 -UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU-3』)(SEQ ID NO:1) (22聚體)的活性鏈。在某些實施方案中，成熟miR_34a序列具有 SEQ ID NO:1 及 3』 端額外的 U 的序列(5』 -UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-3』)(SEQ IDNO: 2) (23聚體)。如此，在某些實施方案中，RNA分子具有的活性鏈具有SEQ ID NO: 2的核苷酸I到22的序列。進一步涵蓋的是，在一些實施方案中，有如下的RNA分子，其具有的活性鏈具有SEQ ID NO: 2的核苷酸I到22的序列，但是RNA分子的長度是23個核苷酸，這是因為在序列的3』端有A、C、G、或U。在一些實施方案中，活性鏈在一個或多個內部位置處具有經修飾的核苷酸。
[0016]在某些實施方案中，RNA分子具有活性鏈，該活性鏈包含成熟人miR_34c序列(5，-AGGCAGUGUAGUUAGCUGAUUGC-3』 ) (SEQ ID NO:5) (23 聚體)。在一些實施方案中，活性鏈在一個或多個內部位置處具有經修飾的核苷酸。
[0017]按照慣例，本文中討論的序列以5』至3』列出，除非另有規定。此外，含有SEQ IDNO序列的鏈具有從5』至3』的所述序列，除非另有規定。
[0018]術語「內部位置」指在鏈中`既不是第一個也不是最後一個位置的位置。術語「經修飾的核苷酸」意指與未修飾的核苷酸相比具有別的模塊(moiety)或替換模塊的核苷酸或核苷(若指5』位置處的核鹼基的話)。在含有一個或多個經修飾的核苷酸的活性鏈的情況下，涵蓋的是，有不少於，或者有不超過2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，或15個經修飾的核苷酸，或其中可導出的任何範圍。明確涵蓋的是，在一些實施方案中，活性鏈中少於每個的核苷酸是經修飾的，並且在某些實施方案中，活性鏈中少於半數的核苷酸是經修飾的。此外，在一些實施方案中，明確涵蓋的是，具有多個經修飾的核苷酸的活性鏈沒有使該活性鏈中的每個核苷酸或每個核苷酸被修飾。本文中公開的miRNA模擬物是序列和/或位置特異性的。
[0019]在一些實施方案中，方法關注miR_34a模擬物；此類模擬物包含具有活性鏈的RNA分子，所述活性鏈具有與SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2相同或具有90%或更多同一性的序列。在其它實施方案中，方法關注miR-34c模擬物；此類模擬物包含具有活性鏈的RNA分子，所述活性鏈具有與SEQ ID N0:5相同或具有90%或更多同一性的序列。在別的實施方案中，方法關注提供miR-34a和miR-34c活性的miRNA模擬物；此類模擬物包含具有活性鏈的RNA分子，所述活性鏈具有與SEQ ID N0:7相同或具有90%或更多同一性的序列。
[0020]在一些實施方案中，提供了長度為22或23個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含:a)包含從5』至3』的SEQ ID NO:1的活性鏈和b)完全互補的過客鏈，該過客鏈包含i)所述過客鏈的前和後兩個核苷酸中的經修飾的核苷酸；和ii)在5』端的末端核苷酸修飾。在某些實施方案中，此RNA分子的長度是22個鹼基對，而在其它實施方案中，此RNA分子的長度是23個鹼基對。在後一種情況中，活性鏈包含SEQ ID NO:1，但是整個序列是來自SEQID NO:2的序列。在別的實施方案中，提供了長度為23或24個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含:a)活性鏈，該活性鏈包含從5』至3』的SEQ ID NO:5和至少一個經修飾的內部核苷酸，和b)完全互補的過客鏈，該過客鏈包含i)所述過客鏈的前和後兩個核苷酸中的經修飾的核苷酸；和ii)在5』端的末端核苷酸修飾。在別的實施方案中，進一步涵蓋的是，此RNA 分子包含 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 2、或 SEQ ID NO: 7 代替 SEQ ID NO: 5。在一些實施方案中，活性鏈包含至少兩個經修飾的核苷酸。在別的實施方案中，活性鏈在任一端的前兩個位置中沒有經修飾的核苷酸。在別的實施方案中，活性鏈在距離5』端的前四個位置中不包含經修飾的核苷酸。在別的實施方案中，RNA分子具有包含至少兩個經修飾的核苷酸的活性鏈，儘管經修飾的核苷酸不在活性鏈5』端的前兩個位置中。在某些實施方案中，活性鏈在活性鏈的後兩個位置(即，3』端的後兩個位置)中不包含經修飾的核苷酸。
[0021]在某些實施方案中，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的活性鏈沒有任何經修飾的核苷酸，儘管在此類實施方案中，過客鏈具有至少末端修飾和至少一個其它修飾。在別的實施方案中，與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2具有至少90%同一性的活性鏈沒有任何經修飾的核苷酸，儘管在此類實施方案中，過客鏈具有至少末端修飾和至少一個其它修飾。在又一些實施方案中，具有SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:7序列的活性鏈沒有任何經修飾的核苷酸，儘管在此類實施方案中，過客鏈具有至少末端修飾和至少一個其它修飾。在別的實施方案中，與SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7具有至少90%同一性的活性鏈沒有任何經修飾的核苷酸，儘管在此類實施方案中，過客鏈具有至少末端修飾和至少一個其它修飾。
[0022]在一些實施方案中，活性鏈可以包含SEQ ID NO:1 (5』-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUU⑶-3，)的成熟miR-34a序列或者包含 SEQ ID NO: 2 (5』-UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGUU-3』)的核苷酸I到22的序列。SEQ ID NO: 2具有SEQ ID NO:1的成熟miR_34a序列以及3』端額外的U。與 miRBasel6.0 資料庫中的成熟人 miR_34a (Griffths-Jones 等，2006)(成熟 miR_34a序列是SEQ ID NO:1，而其互補物是SEQ ID NO: 3)相比，SEQ ID NO: 2具有3』端額外的U。在這些實施方案之任一中，活性鏈包含`相同的序列。在別的實施方案中，活性鏈具有包含SEQ ID N0:2或由SEQ ID NO:2組成的序列。在一些實施方案中，活性鏈可以具有經修飾的核苷酸，其中那些經修飾的核苷酸的身份相對於提及的SEQ ID NO而言。
[0023]在具體的實施方案中，活性鏈中的經修飾的核苷酸是相對於SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO: 2 位於位置 3 (G)、4 (C)、11 (U)、12 (U)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、16 (U)、17 (G)、和 / 或18(G)處的核苷酸(因為這兩種序列間僅有的差異是核苷酸23的添加，所有其它位置在這兩種序列中是相同的)，包括其經修飾的核苷酸的任何組合。這意味著它們是與所述SEQ IDNO中所述位置中的那些核苷酸對應的核苷酸。
[0024]明確涵蓋的是，本文中在特定核苷酸和位置背景中討論的實施方案也可以僅就位置(距離5』端)而言實現。例如，在位置3(G)處具有經修飾的核苷酸的活性鏈也可以在距離活性鏈5』端的位置3處具有經修飾的核苷酸的活性鏈的背景中實現。
[0025]在關注RNA分子的具體實施方案中，活性鏈中的經修飾的核苷酸是相對於SEQ IDNO: 5 (其含有成熟的人 miR-34c 序列)位於位置 3 (G)、4 (C)、11 (G)、12 (U)、13 (U)、14 (A)、
15(G)、16 (C)、17⑶、和/或18 (G)處的核苷酸。[0026]在特定核苷酸鹼基命名(為「A」、「C」、「G」、或「U」)並描述為「相對」於序列(諸如SEQ ID NO:2)中的位置時，這意味著在鏈中涵蓋所述特定命名的核苷酸的修飾，即使其位置變化I或2個位置(±1或±2個位置)(由於相對於參照序列的缺失或插入)。在其它實施方案中，經修飾的核苷酸相對於鏈中的位置描述，而不描述為相對於特定的SEQ IDNO:2 ;在所述情況中，位置指鏈中的位置，其中鏈的5』端以位置I開始，並且繼續到2、3、4，等等，直到達到3』端的核苷酸位置。 [0027]包含SEQ ID NO:1序列，但不由SEQ ID NO:1組成的活性鏈相對於SEQ ID NO:1可以具有核苷酸添加或插入。這意味著如果此類活性鏈相對於SEQ ID NO:1在位置5處具有經修飾的核苷酸，那麼此鏈具有鏈中位置5處或鏈中位置6處經修飾的A (取決於插入或添加在何處)。換言之，除非另有規定，SEQ ID NO背景中的經修飾的核苷酸是核苷酸特異性的。例如，若活性鏈包含SEQ ID NO: 1，並且其長度是23個核苷酸，這意味著它相對於SEQID NO:1具有插入，因為SEQ ID NO:1的長度是22個核苷酸。在一些實施方案中，如果此類活性鏈包含相對於SEQ ID NO:1在位置5處的經修飾的核苷酸，那麼所述活性鏈在插入在位置5後時在鏈中的位置5處會具有經修飾的A，或者它在插入在位置5前或位置5處時在鏈中的位置6處會具有經修飾的A。
[0028]在某些實施方案中，活性鏈包含SEQ ID NO: 5的序列。在別的實施方案中，活性鏈具有由SEQ ID NO: 5中的序列組成的序列。在具體的實施方案中，活性鏈包含SEQ ID NO: 5的序列，但是其序列不由SEQ ID N0:5中的序列組成的序列。
[0029]在一些實施方案中，活性鏈包含至少兩個經修飾的核苷酸，儘管經修飾的核苷酸不在活性鏈5』端的前兩個位置中。在某些實施方案中，活性鏈不包含在活性鏈的後兩個位置(即，3』端的後兩個位置)中的經修飾的核苷酸。
[0030]在某些實施方案中，活性鏈包含SEQ ID N0:1或SEQ ID NO: 2的位置15 (C)和
16(U)處的經修飾的核苷酸。在具體的實施方案中，替代位置15(C)和16 (U)處的修飾或在位置15(C)和16⑶處的修飾外，活性鏈包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2的位置3 (G)和4 (C)處的經修飾的核苷酸。在別的實施方案中，活性鏈包含在SEQ ID NO:1或SEQ IDNO: 2的位置Il(U)和12⑶處的經修飾的核苷酸，其可以代替位置3(G)、4(C)、15(C)和/或16(U)處的修飾或者在位置3(G)、4 (C)、15 (C)和/或16(U)處的修飾外。在具體的實施方案中，活性鏈包含 SEQ ID N0:1 和/或SEQ ID NO: 2 的位置 11 (U)、12 (U)、13 (A)、和 14 (G)處的經修飾的核苷酸，其可以代替相對於SEQ ID N0:1和/或SEQ ID NO:2在位置3(G)、
4(C)、11 (U)、12 (U)、15 (C)和/或16 (U)處的修飾，或者在相對於SEQ ID NO:1和/或SEQID NO: 2在位置3(G)、4 (C)、11 (U)、12 (U)、15 (C)和/或16⑶處的修飾外。在別的實施方案中，活性鏈包含SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO: 2的位置17(G)和18(G)處的經修飾的核苷酸，其可以代替在上文討論的位置3、4、11、12、13、14、15和/或16處的修飾，或者在在上文討論的位置3、4、11、12、13、14、15和/或16處的修飾外。
[0031 ] 在一些實施方案中，活性鏈具有相對於SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2在位置11⑶、12 (U)、15 (C)、和16 (U)處的經修飾的核苷酸。在其它實施方案中，此活性鏈進一步包含相對於SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 2在位置13 (A)、14 (G)、17 (G)、和18 (G)處的經修飾的核苷酸。
[0032]在具體的實施方案中，活性鏈包含相對於SEQ ID NO:1或SEQ ID N0:2在位置3(G)、4 (C)、15 (C)、和16 (U)處的經修飾的核苷酸。
[0033]在某些實施方案中，具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2序列的活性鏈沒有任何經修飾的核苷酸，儘管在此類實施方案中，過客鏈具有至少末端修飾和至少一個其它修飾。
[0034]在某些實施方案中，活性鏈是下文所描述的下列一項:
[0035]i)包含至少兩個經修飾的核苷酸的活性鏈，其中所述經修飾的核苷酸不在5』端的前兩個位置中；
[0036]ii)在距離末端的前或後兩個位置中包含至少兩個經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0037]iii)包含相對於 SEQ ID NO:5 在位置 3 (G)、4(C)、11 (G)、12 (U)、13 (A)、14(G)、15 (C)、16 (C)、17 (U)、和/或18 (G)處的經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0038]iv)包含相對於SEQ ID NO: 5在位置11 (G)和12 (U)處的經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0039]V)包含相對於SEQ ID NO: 5在位置17 (U)和18(G)處的經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0040]vi)包含相對於SEQ ID NO: 5在位置11 (G)、12 (U)、17 (U)、和18 (G)處的經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0041]vii)包含相對於SEQ ID NO: 5在位置3 (G)和4 (C)處及至少一個在位置11(G), I
2(U)，13 (A)，14 (G)，15 (C)，16 (C)，17 (U)，和/或18 (G)處的經修飾的核苷酸的活性鏈；或
[0042]viii)包含相對於 SEQ ID NO`: 5 在位置 3 (G)、4 (C)、11 (G)、12 (U)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、16 (C)、17 (U)、和18 (G)處的經修飾的核苷酸的活性鏈.[0043]在一些實施方案中，雙鏈的RNA分子含有包含整個或部分的成熟miRNA序列的活性鏈和與活性鏈完全或部分互補的過客鏈兩者。在一些實施方案中，過客鏈與活性鏈是，至少是，或者至多是 80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100%互補的，或其中可導出的任何範圍。在某些實施方案中，活性和過客鏈彼此完全互補。
[0044]在含有一個或多個經修飾的核苷酸的過客鏈的情況下，涵蓋的是，有不少於，或有不超過2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15個經修飾的核苷酸，或其中可導出的任何範圍。明確涵蓋的是，在一些實施方案中，過客鏈中少於每個的核苷酸是經修飾的，並且過客鏈中少於半數的核苷酸在某些實施方案中是經修飾的。此外，在一些實施方案中，明確涵蓋的是，具有多個經修飾的核苷酸的過客鏈沒有使該過客鏈中的每個或每隔一個核苷酸被修飾。
[0045]在此類實施方案中，過客鏈包含5』端的核苷酸修飾，其可以稱為5』端修飾。此類末端修飾可以就5』端的核苷酸(或核苷，若其缺乏磷酸根基團的話)而言。此末端修飾在一些實施方案中明確預期為不是糖分子(sugar molecule)修飾的修飾。明確涵蓋的是,此修飾可以是下列一項:NH2、生物素、胺基團、低級烷基胺基團、NHCOCH3、乙醯基基團、2 』 O-Me、DMT0、螢光素、硫醇、吖啶、間隔物18 (PEG)醯胺酯(amidite) (DMT-六(乙二醇))，或具有此類官能性的任何其它基團。在具體的實施方案中，過客鏈上的5』端修飾是C6胺接頭。在其它實施方案中，過客鏈5』端的核苷酸可以具有非糖修飾和糖修飾兩者。
[0046]在一些實施方案中，過客鏈在過客鏈的前兩個或後兩個核苷酸中含有至少一個經修飾的核苷酸。在某些實施方案中，過客鏈在前兩個和兩個核苷酸兩者中包含經修飾的核苷酸。在其它實施方案中，過客鏈具有，具有至少，或具有至多1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15或更多個經修飾的核苷酸，或其中可導出的任何範圍。明確涵蓋的是，在一些實施方案中，過客鏈中少於每個的核苷酸是經修飾的，而且在某些實施方案中，過客鏈中少於半數的核苷酸是經修飾的。此外，在一些實施方案中，明確涵蓋的是，具有多個經修飾的核苷酸的過客鏈中沒有使過客鏈中的每個一個核苷酸被修飾。
[0047]在某些實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID NO:4 (5』-AACAACCAGCUAAGACACUGCCA-3，) (23 聚體)位於位置 I (A)，2 (A) ,3(C), 4(A), 5 (A)，6 (C)，9 (G)，10 (C), Il(U), 12 (A)，13(A)，14 (G)，17 (A)，18 (C)，19 (U)，20 (G)，21 (C)，22 (C)，和 / 或 23 (A)及其任何組合處的經修飾的核苷酸。SEQ ID NO: 4包含與 SEQ ID N0:3 (5』-ACAACCAGCUMGACACUGCCA_3』)(22聚體)相同的序列，只是SEQ ID N0:4在5』端具有額外的A。在一些實施方案中，過客鏈由SEQ IDN0:3組成或者包含SEQ ID N0:3，但是不由SEQ ID NO:4組成或不包含SEQ ID N0:4。相對於SEQ ID NO: 4的經修飾的核苷酸在SEQ ID NO: 3中與那些在位置I (A)、2 (C)、3 (A)、4 (A)、5(C) ,8 (G)、9 (C)、10 (U)、11 (A)、12 (A)、13 (G)、16 (A)、17 (C)、18 (U)、19 (G)、20 (C)、21 (C)、和/ 或 22(A)處的核苷酸對應(5』 -GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3』 )。
[0048]在一些實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID NO: 4在位置i) I (A)和2 (A)和/或ii) 22 (C)和23 (A)處的經修飾的核苷酸。在某些實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ IDNO: 4在位置I (A) ,2(A)、22 (C)、和23 (A)處的經修飾的核苷酸。在別的實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID NO: 4在位置i) 3 (C)和4 (A)和/或ii) 19 (U)和20 (G)處的經修飾的核苷酸，其可以在相對於SEQ ID NO: 4在位置iii) 1(A)、2 (A)和/或iv)22(C)和23 (A)處的修飾外或者代替相對於SEQ ID NO: 4在位置iii) 1(A)、2 (A)和/或iv)22(C)和23 (A)處的修飾。在某些實施方案中，過客鏈具有SEQ ID NO: 4中在位置i) 3 (C)和4 (A)或ii)19(U)和20(G)處，但不在位置i)和ii)兩者處的經修飾的核苷酸。在其它實施方案中，過客鏈具有相對於SEQ ID勵:4在3(0、4(八)、19卬)、和20(6)處的經修飾的核苷酸。在某些實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID` N0:4在位置5(A)和6 (C)處的經修飾的核苷酸，其可以代替本文中討論的其它過客鏈修飾或者在本文中討論的其它過客鏈修飾外。
[0049]在其它實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID NO: 4在位置9 (G)和10 (C)處的經修飾的核苷酸，其可以代替本文中討論的其它過客鏈修飾或者在本文中討論的其它過客鏈修飾外。在別的實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID N0:4在位置Il(U)和12(A)處的經修飾的核苷酸，其可以代替本文中討論的其它過客鏈修飾或者在本文中討論的其它過客鏈修飾外。在一些實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID N0:4在位置13和14處的經修飾的核苷酸，其可以代替本文中討論的其它過客鏈修飾或者在本文中討論的其它過客鏈修飾外。在別的實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID N0:4在位置17(A)和18(C)處的經修飾的核苷酸，其可以代替本文中討論的其它過客鏈修飾或者在本文中討論的其它過客鏈修飾外。
[0050]在具體的實施方案中，過客鏈沒有相對於SEQ ID NO: 4位於位置7 (C)、8 (A)、9 (G)、15(A)、和16(C)處的經修飾的核苷酸。在其它實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID NO:4在位置1(八)、2(八)、20(6)、21(0、22(0、和23(A)處的經修飾的核苷酸。在其它實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID勵:4在位置1(六)、2(六)、3(0、4(六)、22(0、和23(八)處的經修飾的核苷酸。在一些實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID N0:4在位置I(A)、2 (A)、19 (U)、20 (G)、22 (C)、和23 (A)處的經修飾的核苷酸。
[0051]在某些實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID N0:6(5』-GCAAUCAGCUAACUACACUGCCU-3，) (23 聚體)位於位置 1(G)，2(C)，3(A)，4(A)，7(A)，8(G)，9(C)，10(U)，aa(A)，12(A)，I
3(C)，14 (U), 19 (U), 21 (C)，22 (C)，和/或23 (U)及其任何組合處的經修飾的核苷酸。
[0052]在某些實施方案中，過客鏈包含相對於SEQ ID NO: 6 (5』-GCAAUCAGCUAACUACACUGCCU-3，) (23 聚體)位於位置 I (G)，2 (C) ,3(A), 4(A), 7 (A)，8 (G)，9 (C)，10 (U)，11 (A)，12 (A)，I
3(C)，14 (U), 19 (U), 21 (C)，22 (C)，和/或23 (U)及其任何組合處的經修飾的核苷酸。
[0053]在某些實施方案中，過客鏈沒有相對於SEQ ID NO: 6位於位置5 (U)，6 (C)，15 (A)，和/或16(C)處的經修飾的核苷酸。
[0054]涵蓋特定活性鏈和特定過客鏈的組合。涵蓋的是，本文中描述的任何活性鏈可以與部分或完全互補的過客鏈組合以形成雙鏈RNA分子。在某些實施方案中，提供了 RNA分子，該RNA分子具有包含SEQ ID NO: 5 (或與SEQ ID NO: 5具有至少90%同一性的序列)和一個或多個經修飾的核苷酸的活性鏈，和下列過客鏈之一:
[0055]i)除了 5』端的末端修飾外不包含任何經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0056]ii)包含相對於 SEQ ID NO: 6 在位置 I (G)，2 (C)，3 (A)，21 (C)，22 (C)，和 / 或 23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0057]iii)包含位於子集位置處的經修飾的核苷酸的過客鏈，其中所述子集是相對於SEQ ID NO: 6 的 a) I (G)，2 (C)，3 (A)和 / 或 b) 22 (C)，和 23 (U)；
[0058]iv)包含相對於SEQ ID `NO: 6位於位置I (G)，2 (C)，和3 (A)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0059]V)包含相對於SEQ ID NO: 6位於位置22 (C)和23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0060]vi)包含相對於 SEQ ID NO: 6 位於位置 I (G)，2 (C)，3 (A)，22 (C)和 23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0061]vii)在下組位置a)和/或b)中包含經修飾的核苷酸的過客鏈，其中a)是相對於SEQ ID N0:6的位置1(G)、2 (C)、和3(A);而b)是位置22 (C)和23 (U)，儘管在一些實施方案中，經修飾的核苷酸不位於組a)和b)兩者中；
[0062]viii)包含相對於 SEQ ID NO: 6 位於位置 4 (A)，7 (A)，8 (G)，9 (C)，10 (U)，11 (A)，12(A)，13 (C)，14 (U)，19 (U)，和/或21 (C)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0063]ix)包含相對於 SEQ ID NO: 6 位於位置 I (G)，2 (C)，3 (A)，4 (A)，7 (A)，8 (G)，9 (C)，IO (U)，11 (A)，12 (A)，13 (C)，14 (U)，19 (U)，和/或21 (C)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0064]X)包含相對於 SEQ ID NO: 6 位於位置 4 (A)，7 (A)，8 (G)，9 (C)，10 (U)，11 (A)，12 (A)
，13 (C)，14 (U), 19 (U), 21 (C) 22 (C)和/或23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0065]xi)包含相對於 SEQ ID NO: 6 位於位置 I (G)，2 (C)，3 (A)，4 (A)，7 (A)，8 (G)，9 (C)，IO (U)，11 (A)，12 (A)，13 (C)，14 (U)，19 (U)，21 (C) 22 (C)和 / 或 23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0066]xii)包含相對於 SEQ ID NO: 6 在位置 I (G)，2 (C)，3 (A)，17 (A)，18 (C)，21 (C)，22 (C)，和23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0067]xiii)包含相對於 SEQ ID NO: 6 在位置 I (G)，2 (C)，3 (A)，17 (A)，18 (C)，21 (C)，22 (C)，和23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0068]xiv)包含相對於 SEQ ID NO: 6 在位置 I (G)，2 (C)，3 (A)，11 (A)，12 (A)，13 (C)，14 (U),21(C),22 (C)，和23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；或
[0069]XV)包含相對於 SEQ ID NO: 6 在位置 I (G)，2 (C)，3 (A)，11 (A)，12 (A)，13 (C)，14 (U)
，17 (A)，18 (C)，21 (C)，22 (C)，和23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈。
[0070]涵蓋特定活性鏈和特定過客鏈的組合。涵蓋的是，本文中所描述的任何活性鏈可以與本文中所描述的任何過客鏈組合以形成雙鏈RNA分子。
[0071]在一些實施方案中，對具有miR_34a活性的RNA分子涵蓋活性和過客鏈的特定組
八
口 ο
[0072]在某些實施方案中，提供了 RNA分子，其具有包含相對於SEQ ID NO:1或SEQ IDNO: 2在位置Il(U), 12 (U) 15 (C)，和16 (U)處的經修飾的核苷酸的活性鏈和下列過客鏈之一:i)除了 5』端的末端修飾外不包含任何經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0073]ii)包含SEQ ID NO:4和相對於SEQ ID NO:4在位置 I ㈧，2 (A)，20 (G)，21 (C)，22 (C)，和23(A)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0074]iii)包含 SEQ ID NO:4和相對於 SEQ ID NO:4在位置 I ⑷，2 (A)，3 (C)，4 (A)，22 (C)，和23(A)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；或
`[0075]iv)包含SEQ ID NO:4和相對於SEQ ID NO:4在位置 I (A)，2 (A)，19 (U)，20 (G)，22 (C)，和23(A)處的經修飾的核苷酸的過客鏈。
[0076]在別的實施方案中，提供了 RNA分子，其具有包含相對於SEQ ID NO:1或SEQ IDNO: 2 在位置 Il(U), 12 (U)，13 (A)，14 (G)，15 (C)，16 (U)，17 (G)，和 18 (G)處的經修飾的核苷酸的活性鏈和下列過客鏈之一:
[0077]i)包含 SEQ ID NO:4和相對於 SEQ ID NO:4在位置 I ⑷，2 (A)，20 (G)，21 (C)，22 (C)，和23(A)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0078]ii)包含 SEQ ID NO:4 和相對於 SEQ ID NO:4 在位置 I (A)，2 (A)，3 (C)，4 (A)，22 (C)，和23(A)處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0079]iii)包含 SEQ ID NO:4 和相對於 SEQ ID NO:4 在位置 I (A)，2 (A)，19 (U)，20 (G)，22 (C)，和23㈧處的經修飾的核苷酸的過客鏈;或
[0080]iv)包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的過客鏈，其中除了 5』末端修飾外，它不包含任何經修飾的核苷酸。
[0081]在某些實施方案中，提供了 RNA分子，其具有包含相對於SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2在位置3，4，15，和16處的經修飾的核苷酸的活性鏈和下列過客鏈之一:
[0082]i)包含SEQ ID NO: 4和相對於SEQ ID NO: 4在位置I, 2，21，22，和23處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0083]ii)包含SEQ ID NO: 4和相對於SEQ ID NO: 4在位置I, 2，3，4，22，和23處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0084]iii)包含 SEQ ID NO:4 和相對於 SEQ ID NO:4 在位置 I, 2，19，20，22，和 23 處的經修飾的核苷酸的過客鏈；
[0085]在其它實施方案中，對具有miR_34c活性的RNA分子涵蓋活性和過客鏈的特定組合。在某些實施方案中，提供了雙鏈RNA分子，其包含a)包含SEQ ID NO: 6和SEQ ID NO: 6中在位置I (G)，2 (C)，3 (A)，17 (A)，18 (C)，21 (C)，22 (C)，和23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈和 b)包含 SEQ ID NO: 5 和相對於 SEQ ID NO: 5 在位置 11 (G)，12 (U)，17 (U)，和 18 (G)處的經修飾的核苷酸的活性鏈。
[0086]在具體的實施方案中，提供了雙鏈RNA分子，其包含a)包含SEQ ID N0:6和SEQID NO: 6 中在位置 I (G), 2 (C), 3 (A), 11 (A), 12 (A), 13 (C), 14 (U), 21 (C), 22 (C),和 23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈和b)包含SEQ ID N0:5和相對於SEQ ID N0:5在位置11(G), 12 (U), 17 (U),和18(G)處的經修飾的核苷酸的活性鏈。
[0087]在其它實施方案中，提供了雙鏈RNA分子，其包含a)包含SEQ ID NO:6和SEQ IDNO: 6 中在位置 I (G), 2 (C), 3 (A), 11(A), 12(A), 13(C), 14 (U), 17(A), 18 (C), 21 (C), 22 (C),和23 (U)處的經修飾的核苷酸的過客鏈和b)包含SEQ ID NO: 5和相對於SEQ ID NO: 5在位置11，12，17，和18處的經修飾的核苷酸的活性鏈。
[0088]在別的實施方案中，提供了長度為22或23個鹼基對的雙鏈RNA分子，其中RNA分子在兩端是平端的，包含具有SEQ ID N0:5序列的活性鏈和在5』端具有經修飾的核苷酸的分開的且完全互補的過客鏈，其中所述活性鏈包含至少一個經修飾的內部核苷酸，且其中與缺乏任何內部核苷酸修飾的雙鏈平端RNA分子相比，所述雙鏈RNA分子更穩定。
[0089]在某些實施方案中，提供了 miR-34模擬物。在一些實施方案中，模擬物是長度為22或23個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含:a)活性鏈，該活性鏈包含i) 5』至3』的SEQid no:7(N1Ggcagugun2N3UuagcUgN4UUgN5N6，其中 N1 是 a、C、G、或 u ；n2 是 a、C、g、或 u ；n3 是A、C、G、U，或無；N4 是 A、C、G、或 U ；N5 是 A、C、G、或 U ;而 N6 是 A、C、G、U、或無)和 ii)至少一個經修飾的內部核苷酸；和b)包含5』端的末端核苷酸修飾的完全互補的過客鏈。在具體的實施方案中，分子的長度是23個鹼基對。
[0090]在別的實施方案中，包含SEQ ID NO:7的RNA分子具有在位置3，4，11，12，13，14，15，16，17，和/或18處具有經修飾的核苷酸的活性鏈。此名稱就活性鏈而言是位置特異性的(不是核苷酸特異性的)。就SEQ ID N0:2(mir-34a)和SEQ IDN0:5(miR-34c)而言，在一些實施方案中，RNA分子具有下列活性鏈之一:
[0091]i)包含至少兩個經修飾的核苷酸的活性鏈，其中經修飾的核苷酸不在5』端的前兩個位置中；
[0092]ii)在距離末端的前或後兩個位置中包含至少兩個經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0093]iii)包含在位置3，4，11，12，13，14，15，16，17，和/或18處經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0094]iv)包含在位置11和12處經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0095]V)包含在位置17和18處經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0096]vi)包含在位置11，12，17，和18處經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0097]vii)包含在位置3 (G)和4 (C)處經修飾的核苷酸和至少一個在位置11，12，13，14，15，16，17，和/或18處經修飾的核苷酸的活性鏈；
[0098]viii)包含在位置3，4，11，12，13，14，15，16，17，和18處經修飾的核苷酸的活性鏈；或
[0099]ix)包含不超過11個經修飾的內部核苷酸的活性鏈。
[0100]在別的實施方案中，在SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、或 SEQ ID NO:9的背景中討論的核苷酸修飾可以在SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:7、或SEQ IDN0:9的任何其它背景中實現。可以在這些這些SEQ ID NO之一的背景中實現的這些實施方案可以描述基於核苷酸或基於位置的核苷酸修飾。SEQ ID N0:9包含SEQ ID N0:7，其包含SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:5。所有這些關注本文中討論的活性鏈。
[0101]在某些實施方案中，活性鏈包含SEQ ID N0:5。在包括具有包含SEQ IDNO:7的活性鏈的RNA分子的某些實施方案中，在末端核苷酸/核苷修飾外，過客鏈包含至少一個經修飾的內部核苷酸。在一些實施方案中，過客鏈包含在位置1，2，3，4，9，10，11，12，13，14，19，21，和/或22處的經修飾的核苷酸。在某些實施方案中，過客鏈沒有位置15和/或16處的經修飾的核苷酸。
[0102]在一些實施方案中，過客鏈包含SEQ ID NO: 3。在某些實施方案中，過客鏈包含過客鏈中位置 1,2, 3, 5,6,9, 10，11，12，13，14，17，18，19，20，21，和 / 或 22 處經修飾的核苷酸。在其它實施方案中，過客鏈包含SEQ ID N0:4。在別的實施方案中，過客鏈包含位置1，2，3，4，7，8，9，10，11，12，13，14，19，21，22，和 / 或 23 處的經修飾的核苷酸。
[0103]在別的實施方案中，在SEQID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,或SEQ ID NO: 10的背景中討論的核苷酸修飾可以在SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,或SEQ IDNO: 10的任何其它背景中實現。可以在這些這些SEQ ID NO之一的背景中實現的這些實施方案可以描述基於核苷酸或基於位置的核苷酸修飾。SEQ ID N0:10包含SEQ ID N0:8，其包含SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6。所有這些關注本文中討論的過客鏈。
[0104]在某些實施方案中，提供了具有SEQ ID NO:7的miR-34模擬物。在此類RNA分子中，提供了實施方案，其中活性鏈具有一個或多個經修飾的核苷酸，其中經修飾的核苷酸鑑定為是核苷酸特異性的。在此類實施方案中，提供了包含相對於SEQ ID N0:7在位置3(G),4(C), 11(G), 12(U), 13(A), 14(G), 15(C), 16(C), 17(U),和 / 或 18(G)處經修飾的核苷酸的活性鏈；在其它實施方案中，活性鏈包含相對於SEQ ID N0:7在位置Il(G)和12(U)處經修飾的核苷酸；在別的實施方案中，活性鏈包含相對於SEQ ID N0:7在位置17(U)和18(G)處經修飾的核苷酸；在別的實施方案中，活性鏈包含相對於SEQ ID N0:7在位置11(G), 12 (U), 17 (U),和18(G)處經修飾的核苷酸；在別的實施方案中，活性鏈包含相對於SEQ ID NO: 7在位置3 (G)和4 (C)處經修飾的核苷酸和至少一個在位置11 (G)，12 (U)，13 (A), 14(G), 15(C), 16(C), 17 (U),和/或18(G)處經修飾的核苷酸；以及在又一些實施方案中，活性鏈包含相對於 SEQ ID NO: 7 在位置 3(G)，4 (C)，11(G)，12 (U)，13(A)，14(G)，15(C)，16(C), 17 (U),和18(G)處經修飾的核苷酸。
[0105]在某些實施方案中，活性和過客鏈的此組合具有過客鏈的5』端修飾，其中末端修飾是烷基胺諸如C6胺接頭，並且核苷酸修飾在糖上在2』位置處。在具體的實施方案中，糖修飾是2』 OMe。
[0106]在別的實施方案中，提供了長度為22或23個鹼基對的雙鏈RNA分子，其中RNA分子在兩端是平端的，包含具有SEQ ID NO:1序列的活性鏈和在5』端具有經修飾的核苷酸的分開的且完全互補的過客鏈，其中活性鏈包含至少一個經修飾的內部核苷酸，且與缺乏任何內部核苷酸修飾的雙鏈平端RNA 分子相比，雙鏈RNA分子在存在核酸酶的情況下更穩定。
[0107]在一些實施方案中，RNA分子具有用糖修飾修飾的核苷酸。在具體的實施方案中，糖修飾是2』 -OMe0[0108]具體的實施方案包括含有一種或多種能夠起miRNA模擬物作用的不同RNA分子的藥物組合物；差異可以涉及序列和/或修飾的類型或位置。在某些實施方案中，RNA分子包含在脂質配製劑中。在其它實施方案中，可以用脂質體、基於聚合物的納米顆粒、膽固醇偶聯物、環糊精(cyclodextran)複合物、聚乙烯亞胺聚合物和/或蛋白質複合物配製RNA分子。 [0109]實施方案中還列出用於對細胞提供miR_34a活性的方法。在一些實施方案中，提供了用於對細胞提供miR-34a活性的方法，包括對細胞施用有效量的具有miR_34a活性的RNA分子。在一些實施方案中,所述細胞是癌細胞。此類RNA分子遍及此公開內容討論。
[0110]其它方法包括用於降低細胞增殖的方法，包括對細胞施用有效量的miR-34a模擬物。其它實施方案包括用於在細胞中誘導凋亡的方法，包括對細胞施用有效量的miR-34a模擬物。其它實施方案關注用於治療患者中的癌症的方法，包括對患者施用包含一種或多種具有miRNA功能的RNA分子的藥物組合物。其它實施方案關注抑制行進通過細胞周期的方法，其通過施用有效量的本文中討論的miR-34a模擬物進行。在一些實施方案中，方法進一步包括對患者施用別的癌症療法。在一些實施方案中，已經對患者測試癌症和/或診斷為患有癌症。此類方法可以牽涉本文中討論的雙鏈RNA分子。此外，涵蓋的是，可以在本文中討論的方法和組合物中採用多種不同miR-34a模擬物。
[0111]其它實施方案關注RNA分子用於處理癌細胞的用途，或其在降低細胞增殖、誘導凋亡或對細胞提供miR-34a功能中的用途。
[0112]實施方案中還列出用於對細胞提供miR_34c活性的方法。在一些實施方案中，提供了用於對細胞提供miR-34c活性的方法，包括對細胞施用有效量的具有miR-34c活性的RNA分子。在一些實施方案中,所述細胞是癌細胞。此類RNA分子遍及此公開內容討論。
[0113]其它方法包括用於降低細胞增殖的方法，包括對細胞施用有效量的miR-34c模擬物。其它實施方案包括用於在細胞中誘導凋亡的方法，包括對細胞施用有效量的miR-34c模擬物。其它實施方案關注用於治療患者中的癌症的方法，包括對患者施用包含一種或多種具有miRNA功能的RNA分子的藥物組合物。在一些實施方案中，方法進一步包括對患者施用別的癌症療法。在一些實施方案中，已經對患者測試癌症和/或診斷為患有癌症。此類方法可以牽涉本文中討論的雙鏈RNA分子。此外，涵蓋的是，可以在本文中討論的方法和組合物中採用多種不同miR-34c模擬物。
[0114]其它實施方案關注RNA分子用於處理癌細胞的用途，或其在降低細胞增殖、誘導凋亡或對細胞提供miR-34c功能中的用途。
[0115]在miR_34a模擬物的背景中討論的方法可以在miR_34c模擬物的情況下實現，且反之亦然。
[0116]組合物及其使用方法可以「包含」遍及整個說明書公開的任何分子或步驟，「基本上由」或「由」遍及整個說明書公開的任何分子或步驟「組成」。就過渡相「基本上由…組成」而言，且在一個非限制性方面，本說明書中公開的組合物和方法的基本且新穎特徵包括miRNA模擬物活性。
[0117]在權利要求書和/或說明書中與術語「包含/包括」一起使用時使用詞語「一個」或「一種」可以意指「一個/種」，但是它也與「一或多個/種」、「至少一個/種」、和「一或超過一個/種」的意義一致。[0118]涵蓋的是，本文中討論的任何實施方案可以就本發明的任何方法或組合物而言實現，且反之亦然。此外，本發明的組合物和試劑盒可以用於實現本發明的方法。
[0119]貫穿本說明書，術語「約」用於指數值包括用於測定該數值的裝置或方法的誤差的標準差。
[0120]在權利要求書中使用術語「或」用於指「和/或」，除非明確指示指僅備選或者備選是相互排他的，儘管公開內容支持指僅備選及「和/或」的定義。還涵蓋的是，也可以明確排除使用術語「或」列出的任何內容。
[0121]本發明的其它目的、特徵和優點通過以下詳細描述會變得顯而易見。然而，應當理解雖然詳細描述和具體例子指示本發明的具體實施方案，但是其僅作為例示給出，因為本發明精神和範圍內的各種變化和修改從本詳細描述看對於本領域技術人員會變得顯而易見。
[0122]發明詳述
[0123]實施方案涉及與miRNA相關的組合物和方法、以及miRNA模擬物的用途。方法包括製備此類模擬物，並使用此類模擬物來對細胞提供miRNA活性或功能。在某些實施方案中，miRNA模擬物用於治療、預後、和診斷應用，特別是那些涉及牽涉miRNA活性或功能的狀況或疾病的治療性應用的方法和組合物。
[0124]1.核酸
[0125]核酸包括作為與成熟微小RNA( 「miRNA」或「miR」)分子相同或完全或部分互補的序列的序列或序列區段。一般地，成熟miRNA分子的長度是21至22個核苷酸，儘管已經報告了 16和多至27個核苷酸的長度。miRNA各自從較長的前體RNA分子(「前體miRNA」)加工。前體miRNA自非蛋白質編碼基因轉錄。前體miRNA具有兩個使得它們能夠形成莖-環或折回樣結構的互補性區，其在動物`中受到稱作Dicer的核糖核酸酶III樣核酸酶酶切割。經加工的miRNA通常是莖的一部分。
[0126]經加工的miRNA(又稱為「成熟miRNA」)變為較大的複合物的一部分以下調特定的靶基因。動物miRNA的例子包括那些與靶物不完全鹼基配對的miRNA，其使翻譯停止(Olsen等，1999; Seggerson等，2002)。siRNA分子也受到Dicer加工,但是從較長的雙鏈RNA分子加工。siRNA不天然存在於動物細胞中，但是它們可以經由RNA誘導的沉默複合物(RISC)指導對mRNA靶物的序列特異性切割(Denli等，2003)。
[0127]A.miR-34a 和 miR_34c
[0128]先前證明了 miR-34涉及調節眾多細胞活性，其代表用於癌症療法和用於其它疾病和病症的療法的幹預點(2005年5月31日提交的美國專利申請流水號11/141，707和2005年11月14日提交的流水號11/273，640，在此每篇通過提及併入)。
[0129]發明人還證明了 miR-34經由其調節許多關鍵癌基因表達的能力發揮腫瘤阻抑物的功能(2008年6月6日提交的美國專利申請流水號12/134，932，其在此通過提及併入)。受到miR-34直接或間接調節的癌症相關基因包括血管生成素、極光激酶B、BCL10、BRCAUBRCA2、BUB1、細胞周期蛋白A2、細胞周期蛋白D1，細胞周期蛋白D3、⑶K-4、⑶K抑制劑2C、FAS、forkhead框Ml、HDAC-l、c-Jun、MCAM、Mcl-l、c-Met、Myb L2、NF1、NF2、PI3_ 激酶、polo樣激酶 1、R-RAS、SMAD3、TGF beta 受體、TPD52 腫瘤蛋白 D52、和 Wnt_7b。
[0130]總之，miR-34控制作為細胞增殖和存活的重要調節物的蛋白質的活性。這些靶物在人癌症中經常脫調節。
[0131]B.寡聚化合物
[0132]實施方案關注miRNA模擬物，其含有能夠模擬RNA分子活性的分子。RNA分子含有核苷，其是鹼基-糖組合。核苷的鹼基部分通常是雜環鹼基模塊。最常見的兩類所述雜環鹼基是嘌呤和嘧啶。核苷酸是進一步包含與核苷的糖部分共價連接的磷酸根的核苷。對於那些包含戊呋喃糖基糖的核苷，磷酸基團可以與糖的2』、3』或5』羥基模塊連接。涵蓋的是，RNA鏈會由核苷酸(核糖核苷酸)組成，並且5』端可以是核苷酸或核苷。換言之，可以有與核苷的糖部分連接的磷酸基團或者可以僅有替代磷酸基團的羥基基團。如本文中討論的，在一些實施方案中，有末端核苷或核苷酸的修飾，其中化學模塊或基團經由目前是或先前是羥基或磷酸基團的結構而附接於所述糖。
[0133]在形成寡核苷酸時，磷酸基團將相鄰的核苷彼此共價連接以形成線性聚合化合物。可以通過雜交或通過形成共價鍵連接此線性聚合結構的相應末端以形成環形結構。另外，線性化合物可以具有內部核鹼基互補性，並且因此可以以如下的方式摺疊，使得生成完全或部分雙鏈的結構。在寡核苷酸結構內，磷酸基團通常稱為形成寡核苷酸的核苷間連接。RNA和DNA的正常核苷間連接是3』至5』磷酸二酯連接。
[0134]在一些實施方案中，提供了具有介於17和130個殘基之間的長度的RNA、RNA分子、或RNA類似物。實施方案關注合成的miRNA分子，其長度是，至少是，或者至多是15、16、
17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或 40 或
更多個殘基，包括其中可導出的任何整數或任何範圍。雙鏈RNA分子中的每條鏈或RNA分子可以是如上文所述的此類長度。在一些實施方案中，RNA分子在一個或兩個末端上具有平端。在某些實施方案中，RNA分子在具有活性鏈5』端的一側具有平端。在其它實施方案中，RNA分子在具有過客鏈5』端的一側具有平端。
[0135]本文中所描述的RNA分子可以具有一條或兩條鏈。在具有兩條鏈的分子中，兩條鏈可以彼此雜交，但是它們不通過核苷間連接彼此連接。
[0136]在某些實施方案中，包含SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:7、或 SEQ ID N0:9 或者由 SEQ ID NO: K SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:7、或 SEQ IDN0:9組成(或者由與所述SEQ ID NO之一具有至少90%同一性的序列組成)的此類RNA分子具有位於活性鏈中位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、和/或23處的經修飾的核苷酸或核苷(位置I是5』端)。在其它實施方案中，經修飾的核苷酸或核苷位於過客鏈中的位置 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、和 / 或 23(位置 I 是 5』端)，所述過客鏈包含 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO:6, SEQ ID NO:8,或 SEQ ID NO: 10 或者由 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQID NO:8,或SEQ ID NO: 10組成(或者由與所述SEQ ID NO之一具有至少90%同一性的序列組成)。對修飾的核苷酸的命名是位置特異性的，而不是核苷酸特異性的。因而，討論核苷酸特異性修飾的實施方案，例如，「包含相對於SEQ ID N0:4在位置Il(G)和12(U)處的經修飾的核苷酸的活性鏈」可以在其它實施方案中針對位置而執行；因此，在其它實施方案中，RNA分子可以包括例如在位置11和12處有修飾的核苷酸的鏈。
[0137]在一些實施方案中，miRNA模擬物或RNA分子在兩側都是平端的。涵蓋的是，在雙鏈RNA模擬物或分子的過客或活性鏈的3』或5』端可以有1、2、3、4、5、或6個鹼基的突出物。
[0138]在一些實施方案中，過客鏈和活性鏈不是完全互補的。涵蓋的是，兩條鏈間可以有不互補的1、2、3、4、5、6或更多個核苷酸。在一些實施方案中,這些核苷酸在過客鏈5』端的前10個核苷酸內。
[0139]涵蓋的是，RNA模擬物具有經過或未經修飾的RNA鹼基。因而，RNA模擬物是RNA或RNA分子。此外，理解的是，核酸(包括RNA)可以具有超過一條鏈。如本文中討論的，在一些實施方案中，miRNA模擬物或RNA分子是雙鏈的。除非另有規定，雙鏈RNA分子或miRNA模擬物會理解為具有兩條可以彼此分開並且不僅僅是通過髮夾接頭彼此連接的鏈。髮夾分子具有一條能夠分子內雜交的鏈。在一些實施方案中，miRNA模擬物是髮夾分子。在其它實施方案中，miRNA模擬物是雙鏈RNA分子。
[0140]在某些實施方案中，治療性雙鏈核酸具有第一活性鏈和第二過客鏈，所述第一活性鏈具有(a) 「miRNA區」，其從5』至3』的序列與成熟miRNA序列的整個或區段相同，所述第二過客鏈具有(b) 「互補區」，其從5』至3』的序列與miRNA序列是60%-100%互補的。在某些實施方案中，如下文限定的，還將這些合成的miRNA分離，或者純化。術語「miRNA區」指合成的miRNA上與成熟的天然存在的miRNA序列的整個序列至少75、80、85、90、95、或100%相同(包括其間的所有整數)的區域。在某些實施方案中，miRNA區與天然存在的miRNA序列，諸如人 miRNA 序列是或至少是 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1,99.2,99.3、99.4,99.5,99.6,99.7,99.8,99.9或100%相同的。或者，如通過本領域中公知的序列比對算法和方法比較的，miRNA區可以包含與天然存在的miRNA共同的18、19、20、21、22，、23、24或更多個核苷酸位置。
[0141]術語「互補區」指合成的miRNA中與成熟天然miRNA序列相同或至少是60%互補的區域。互補區是或至少是 6 0、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、
78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1,99.2、
99.3,99.4,99.5,99.6,99.7,99.8、99.9或100%互補的，或其中可導出的任何範圍。在單一
多核苷酸序列的情況中，由於miRNA區和互補區之間的化學鍵合而可以有髮夾環結構。在其它實施方案中，互補區在與所述miRNA區不同的另一核酸鏈上，在該情況中互補區在過客鏈上，而miRNA區在活性鏈上。
[0142]術語「寡核苷酸」在本領域中理解為指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或聚合物，通常長度為不超過100個鹼基或鹼基對的。涵蓋的是，寡核苷酸可以在5』端具有核苷。此術語包括寡核苷酸，其由天然存在的核鹼基、糖和共價的核苷間連接組成。術語「寡核苷酸類似物」指具有一個或多個以與寡核苷酸類似的方式發揮功能的非天然存在的部分的寡核苷酸。與天然存在的寡核苷酸相比，此類非天然存在的寡核苷酸可以具有期望的特性，諸如例如本文中公開的那些特性，包括但不限於升高的生理學活性、在存在核酸酶的情況下的穩定性升高、和/或升高的藥動學特性。
[0143]術語「寡核苷」指經由沒有磷原子的核苷間連接而化學連接的核苷。核苷間連接包括短鏈烷基、環烷基、混合的雜原子烷基、混合的雜原子環烷基、一個或多個短鏈雜原子的和一個或多個短鏈雜環的。這些核苷間連接包括但不限於矽氧烷、硫化物、亞碸、碸、乙醯基、formacetyl、硫代 formacetyl、亞甲基 formacetyl、硫代 formacetyl、烯基(alkeneyl)、氨基磺酸鹽；亞甲基亞氨基、亞甲基肼基、磺酸鹽、磺醯胺、醯胺和其它具有混合的N、O、S和CH2組分部分的連接。在上文所描述的修飾外，本發明的寡聚化合物的核苷可以具有多種其它修飾。適合於具有經修飾的鹼基模塊和或經修飾的糖模塊的實施方案的其它核苷披露於美國專利N0.6，383，808和PCT申請PCT/US89/02323，兩篇在此通過提及而收錄。
[0144]改變的鹼基模塊或改變的糖模塊還包括與miRNA模擬物的目的一致的其它修飾。此類寡聚化合物最佳地記載為與天然存在的或合成的未修飾的寡核苷酸在結構上可區別，但在功能上可互換。本發明包括所有此類寡聚化合物，只要它們有效發揮功能以模擬期望的RNA或DNA寡核苷酸鏈的結構或功能。
[0145]在一些實施方案中，RNA模擬物包括鹼基修飾或取代。RNA中的天然的或未修飾的鹼基是腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，及嘧啶鹼基胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U) (DNA具有胸腺嘧啶(T))。比較而言，經修飾的鹼基，又稱為雜環鹼基模塊，包括其它合成的和天然的核鹼基諸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-滷代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶鹼基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-滷代、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-滷代(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶)、7_甲基鳥嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。
[0146]可以使用一種或多種鹼基或糖修飾來誘導3』 -內糖構象。核苷可以摻入雜環鹼基、糖模塊或兩者的合成修飾以誘導期望的3』 -內糖構象。使用這些經修飾的核苷來模擬RNA樣核苷，從而可以在維持期望的3』 -內構象幾何學的情況下增強寡聚化合物的特定特性(參見美國專利申請公開文本2005/0261218的方案1，在此通過提及而將其收錄)。
[0147]在一些實施方案中，RNA模擬物具有特別對具體是具有與成熟miRNA互補的序列的RNA模擬物鏈的5』端殘基的修飾。`此鏈在本文中稱為「過客」鏈。不限於理論，互補鏈的5』端存在與磷酸根或羥基不同的穩定模塊似乎損害或消除miRNA途徑複合物對過客鏈的攝取，隨後促進miRNA蛋白質複合物對活性鏈的攝取。5』修飾包括但不限於NH2、生物素、胺基團、低級烷基胺基團、低級烷基基團、NHCOCH3、乙醯基基團、2』氧-甲基(2』 O-Me),DMT0、螢光素、硫醇、或吖啶或任何其它具有此類官能性的基團。在其它實施方案中，提供了間隔物IS(PEG)醯胺酯(DMT-六(乙二醇))。在其它實施方案中，提供了 40個或更少碳的烷基胺或烷基基團。在牽涉「低級」烷基胺或烷基基團的實施方案中，「低級」會理解為指具有20或更少個碳的分子。
[0148]在具體的實施方案中，在過客鏈的5』端上有C4-C12胺接頭。在具體的實施方案中，在過客鏈的第一個核苷酸的末端磷酸根上有C6胺:
[0149]
【權利要求】
1.一種長度為22或23個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含: a)活性鏈，該活性鏈包含從5』至3』的SEQID NO: 1，和 b)完全互補的過客鏈，該過客鏈包含: i)所述過客鏈的前和後兩個核苷酸中的經修飾的核苷酸；和 ?)在5』端的末端核苷酸修飾。
2.權利要求1的RNA分子，其中所述分子長度是23個鹼基對，並且所述活性鏈包含SEQID N0:2。
3.權利要求1的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4在位置1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、22、和/或23處的經修飾的核苷酸，其中所述過客鏈中少於總數一半的核苷酸是經修飾的核苷酸。
4.權利要求1-3中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:4位於位置i) I和2和/或ii) 22和23處的經修飾的核苷酸。
5.權利要求2-3中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:4位於位置i) I和2和ii) 22和23處的經修飾的核苷酸。
6.權利要求1-5中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4位於位置i) 3和4和/或ii) 19和20處的經修飾的核苷酸。
7.權利要求6的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:4位於位置i)3和4或ii) 19和20處，但不在位置 i)和ii)兩者處的經修飾的核苷酸。
8.權利要求4-7中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4在位置5和6處的經修飾的核苷酸。
9.權利要求4-7中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4在位置9和10處的經修飾的核苷酸。
10.權利要求4-7中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4在位置11和12處的經修飾的核苷酸。
11.權利要求4-7中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4在位置13和14處的經修飾的核苷酸。
12.權利要求4-7中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4在位置17和18處的經修飾的核苷酸。
13.權利要求4的RNA分子，其中所述過客鏈中經修飾的核苷酸的數目是4至8。
14.權利要求13的RNA分子，其中所述過客鏈中經修飾的核苷酸的數目是5至7。
15.權利要求14的RNA分子，其中所述過客鏈中經修飾的核苷酸的數目是6。
16.權利要求1-15中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈沒有相對於SEQID N0:4位於位置7、8、9、15、和16處的經修飾的核苷酸。
17.權利要求1-16中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4在位置1、2、21、22、和23處的經修飾的核苷酸。
18.權利要求1-16中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:4在位置1、2、3、4、22、和23處的經修飾的核苷酸。
19.權利要求1-16中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID N0:4在位置1、2、19、20、22、和23處的經修飾的核苷酸。
20.權利要求1-19中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈包含至少兩個經修飾的核苷酸，其中所述經修飾的核苷酸不在5』端的前兩個位置中。
21.權利要求1-19中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈在5』端的前兩個位置中沒有經修飾的核苷酸。
22.權利要求1的RNA分子，其中所述活性鏈在距離末端的前或後兩個位置中不包含經修飾的核苷酸。
23.權利要求20-22中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈具有相對於SEQID NO: 2在位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、和/或18處的經修飾的核苷酸。
24.權利要求23的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 2在位置15和16處的經修飾的核苷酸。
25.權利要求23的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO:2在位置3和4處的經修飾的核苷酸。
26.權利要求23的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 2在位置11和12處的經修飾的核苷酸。
27.權利要求23的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO:2在位置11、12、13、和14處的經修飾的核苷酸。
28.權利要求23的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 2在位置17和18處的經修飾的核苷酸。
29.權利要求23-28中任一項的RN`A分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 2在位置11、12、15、和16處的經修飾的核苷酸。
30.權利要求29的RNA分子，其中所述活性鏈進一步包含相對於SEQID NO:2在位置13、14、17、和18處的經修飾的核苷酸。
31.權利要求23-28中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 2在位置3、4、15、和16處的經修飾的核苷酸。
32.權利要求1-19中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈沒有任何經修飾的核苷酸。
33.權利要求29的RNA分子，其中除了5』端修飾外，所述過客鏈不包含任何經修飾的核苷酸。
34.權利要求29的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、20、21、22、和23處的經修飾的核苷酸。
35.權利要求29的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、3、4、22、和23處的經修飾的核苷酸。
36.權利要求29的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、19、20、22、和23處的經修飾的核苷酸。
37.權利要求30的RNA分子，其中除了5』端修飾外，所述過客鏈不包含任何經修飾的核苷酸。
38.權利要求30的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、20、21、22、和23處的經修飾的核苷酸。
39.權利要求30的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、3、4、22、和23處的經修飾的核苷酸。
40.權利要求30的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、19、20、22、和23處的經修飾的核苷酸。[A-1D 206/P-1D 215]
41.權利要求31的RNA分子，其中除了5』端修飾外，所述過客鏈不包含任何經修飾的核苷酸。
42.權利要求31的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、21、22、和23處的經修飾的核苷酸。
43.權利要求31的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、3、4、22、和23處的經修飾的核苷酸。
44.權利要求31的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID N0:4和相對於SEQ ID NO:4在位置1、2、19、20、22、和23處的經修飾的核苷酸。
45.權利要求1-44中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈的末端修飾包含低級烷基胺基團。
46.權利要求1-45中任一項的RNA分子，其中所述經修飾的核苷酸具有糖修飾。
47.權利要求46的RNA分子，其中所述糖修飾是2』-OMe0
48.一種長度為20-23個鹼基對的雙鏈RNA分子，其中所述RNA分子在兩端都是平端的，包含具有SEQ ID N0:2序列的活性鏈和在5』端具有經修飾的核苷酸的分開的且完全互補的過客鏈，其中所述活性鏈包含至少一個經修飾的內部核苷酸，且其中與缺乏任何內部核苷酸修飾的雙鏈平端RNA分子相比，所述雙鏈RNA分子更穩定。
49.一種藥物組合物，其包含權利要求1-48中任一項的RNA分子。
50.一種用於對細胞提供miR-34a活性的方法，其包括對所述細胞施用權利要求1_48中任一項的RNA分子。
51.一種用於降低細胞增殖的方法，其包括對所述細胞施用有效量的權利要求1-48中任一項的RNA分子。
52.一種用於在細胞中誘導凋亡的方法，其包括對所述細胞施用有效量的權利要求1-48中任一項的RNA分子。
53.一種用於治療患者中的癌症的方法，其包括對所述患者施用包含權利要求1-48中任一項的RNA分子的藥物組合物。
54.權利要求54的方法，其進一步包括對所述患者施用別的癌症療法。
55.權利要求53的方法，其中所述患者已經診斷為患有癌症。
56.一種長度為23或24個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含: a)活性鏈,該活性鏈包含: i)從5』 至 3』 的 SEQ ID NO:5，和 ii)至少一個經修飾的內部核苷酸；和 b)完全互補的過客鏈，該過客鏈包含5』端的末端核苷酸修飾。
57.權利要求56的RNA分子，其中所述分子的長度是23個鹼基對。
58.權利要求56的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:6在位置I (G)、2 (C)、3 (A)、21 (C)、22 (C)、和/或23 (U)處的經修飾的核苷酸。
59.權利要求56-58中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含位於子集位置處的經修飾的核苷酸，其中所述子集是相對於SEQ ID勵:6的丨)1(4)、2(八)、和3(0和/或ii)22(C)、和 23(A)。
60.權利要求56-59中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:6位於位置i) I (A)、2 (A)、和3 (C)處的經修飾的核苷酸。
61.權利要求56-60中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:6位於位置ii) 22 (C)、和23 (A)處的經修飾的核苷酸。
62.權利要求59的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO: 6位於位置I (A)、2 (A)、3 (C)、22 (C)、和23 (A)處的經修飾的核苷酸。
63.權利要求59的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:6位於位置i)或ii)處，但不在位置i)和ii)兩者處的經修飾的核苷酸。
64.權利要求56-63中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈進一步包含相對於SEQIDNO:6 位於位置 4(A)、7(A)、8(G)、9(C)、10(U)、11(A)、12(A)、13(C)、14(U)、19(U)、和 / 或21(C)處的經修飾的核苷酸。
65.權利要求56的RNA分子，其中所述過客鏈沒有相對於SEQID NO: 6位於位置5 (U)、6 (C)、15 (A)、和/或16 (C)處的經修飾的核苷酸。
66.權利要求56的RNA分子，其中所述過客鏈中經修飾的核苷酸的數目是2至8。
67.權利要求66的RNA分子，其中所述過客鏈中經修飾的核苷酸的數目是3至5。
68.權利要求56的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:6在位置I (A)、2(A)、3 (C)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、和 23 (A)處的經修飾的核苷酸。`
69.權利要求56的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:6在位置I (A)、2(A)、3 (C)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、21 (C)、22 (C)、和 23 (A)處的經修飾的核苷酸。
70.權利要求56的RNA分子，其中所述過客鏈包含相對於SEQID NO:6在位置I (A)、2(A)、3 (C)、11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、17 (A)、18 (C)、21 (C)、22 (C)、和 23 (A)處的經修飾的核苷酸。
71.權利要求56-70中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈包含至少兩個經修飾的核苷酸，其中所述經修飾的核苷酸不在5』端的前兩個位置中。
72.權利要求56-70中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈在5』端的前兩個位置中沒有經修飾的核苷酸。
73.權利要求56的RNA分子，其中所述活性鏈在距離末端的前或後兩個位置中不包含經修飾的核苷酸。
74.權利要求71-73中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO:5在位置 3 (G)、4 (C)、11 (G)、12 ⑶、13 ⑷、14 (G)、15 (C)、16 (C)、17 (U)、和 / 或 18 (G)處的經修飾的核苷酸。
75.權利要求74的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO:5在位置11 (G)和12 (U)處的經修飾的核苷酸。
76.權利要求74的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 5在位置17 (U)和18(G)處的經修飾的核苷酸。
77.權利要求74的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 5在位置11 (G)、12(U)、17(U)、和18(G)處的經修飾的核苷酸。
78.權利要求77的RNA分子，其中所述活性鏈進一步包含相對於SEQID NO: 5在位置3(G)、4 (C)、13 (A)、14 (G)、15 (C)、和 / 或 16 (C)處的經修飾的核苷酸。
79.權利要求74-78中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈不包含任何經修飾的核苷酸。
80.權利要求68的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 5在位置11 (G)、12(U)、17(U)、和18(G)處的經修飾的核苷酸。
81.權利要求69的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 5在位置11 (G)、12(U)、17(U)、和18(G)處的經修飾的核苷酸。
82.權利要求70的RNA分子，其中所述活性鏈包含相對於SEQID NO: 5在位置11 (G)、12(U)、17(U)、和18(G)處的經修飾的核苷酸。
83.權利要求56-82中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈的末端修飾包含低級烷基胺基團。
84.權利要求56-83中任一項的RNA分子，其中所述經修飾的核苷酸具有經修飾的糖。
85.權利要求84的RNA分子，其中所述糖修飾是2』-OMe0
86.—種長度為23或24個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含: a)活性鏈,該活性鏈包含: i)從5』 至 3』 的 SEQ ID NO:5，和 ii)至少一個經修飾的內部核苷酸；和 b)完全互補的過客鏈，其包含5』端的末端核苷酸修飾和相對於SEQID N0:6在位置1(G)、2(C)、3(A)、21(C)、22(C)和 / 或 23 (U)處的至少一個糖修飾。
87.—種長度為23或24個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含: a)活性鏈，該活性鏈至少包含從5』至3』的SEQID NO:5的鹼基1_23 ;和 b)完全互補的過客鏈，該過客鏈包含: i)在5』端的末端核苷酸修飾； ii)在前三個和後三個核苷酸中的糖修飾；和 iii)相對於SEQ ID N0:6 在位置 11 (A)、12 (A)、13 (C)、14 (U)、17 (A)、和 / 或 18 (C)之一處或多處的核苷酸的糖修飾。
88.一種藥物組合物，其包含權利要求56-87中任一項的RNA分子。
89.一種用於對細胞提供miR-34c活性的方法，其包括對所述細胞施用權利要求56-86中任一項的RNA分子。
90.一種用於降低細胞增殖的方法，其包括對所述細胞施用有效量的權利要求56-86中任一項的RNA分子。
91.一種用於在細胞中誘導凋亡的方法，其包括對所述細胞施用有效量的權利要求56-86中任一項的RNA分子。
92.一種用於治療患者中的癌症的方法，其包括對所述患者施用包含權利要求56-86中任一項的RNA分子的藥物組合物。
93.權利要求92的方法，其進一步包括對所述患者施用別的癌症療法。
94.權利要求92的方法，其中所述患者已經診斷為患有癌症。
95.一種長度為22或23個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含: a)活性鏈,該活性鏈包含:i)從5』 至 3』 的 SEQ ID NO:7，和 ii)至少一個經修飾的內部核苷酸；和 b)完全互補的過客鏈，該過客鏈包含在5』端的末端核苷酸修飾。
96.權利要求95的RNA分子，其中所述分子的長度是23個鹼基對。
97.權利要求95-96中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈包含所述活性鏈中在位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、和/或18處的經修飾的核苷酸。
98.權利要求95-97中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈包含至少兩個經修飾的內部核苷酸。
99.權利要求98的RNA分子，其中所述活性鏈包含不超過11個經修飾的內部核苷酸。
100.權利要求95-99中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含至少一個經修飾的內部核苷酸。
101.權利要求100的RNA分子，其中所述過客鏈包含所述過客鏈中在位置1、2、3、4、9、10、11、12、13、14、19、21、和/或22處的經修飾的核苷酸。
102.權利要求95-101中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈沒有位置15和/或16處的經修飾的核苷酸。`
103.權利要求95-102中任一項的RNA分子，其中所述過客鏈包含SEQID NO:3。
104.權利要求103的RNA分子，其中所述過客鏈包含所述過客鏈中在位置1、2、3、5、6、9、10、11、12、13、14、17、18、19、20、21、和 / 或 22 處的經修飾的核苷酸。
105.權利要求95-102中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈包含SEQID NO:5。
106.權利要求105的RNA分子，其中所述過客鏈包含所述過客鏈中在位置1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、14、19、21、22、和/或23處的經修飾的核苷酸。
107.權利要求95-106中任一項的RNA分子，其中所述活性鏈包含SEQID NO:9的序列。
108.—種長度為22或23個鹼基對的雙鏈平端RNA分子，其包含: a)活性鏈,該活性鏈包含: i)從5』 至 3』 的 SEQ ID NO:9，和 ii)在位置3、4、11、12、13、14、15、16、17、和/或18處的經修飾的核苷酸； b)完全互補的過客鏈，其包含在5』端的末端核苷酸修飾。
【文檔編號】C12N15/113GK103476931SQ201280016251
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年2月3日 優先權日:2011年2月3日
【發明者】K.凱爾納, D.布朗 申請人:米爾納醫療股份有限公司