一種抗B型肝炎病毒x蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒及其製備方法

2023-06-26 16:06:56 5

一種抗B型肝炎病毒x蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種抗B型肝炎病毒x蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒，所述檢測試劑盒包括：1)重組B型肝炎病毒X蛋白；2)HBx蛋白抗體陰、陽性對照品；3)酶標記結合物；4)顯色底物；以及5)濃縮洗滌液。本發明的試劑盒檢測靈敏度高，檢測耗時短，有助於儘早地診斷肝癌患者，及時治療，提高生存率。並且，與僅檢測AFP標誌物相比，在檢測AFP標誌物的同時採用本發明的試劑盒檢測HBx蛋白抗體可顯著提高肝癌的診斷敏感性。
【專利說明】一種抗B型肝炎病毒X蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒及其 製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術和免疫學領域，具體涉及檢測肝癌標誌物B型肝炎病毒X蛋 白（HBx)抗體的試劑盒。

【背景技術】
[0002] 人體我國每年約有11?13萬人死於原發性肝癌，佔全球肝癌死亡數的半數之多。 近年來，通過提高肝癌早期診斷率、改進肝癌切除方法和實施肝移植等手段，我國部分肝癌 高發地區的死亡率有所下降，但是肝癌總體的發病率仍然呈上升趨勢。
[0003] 目前，影像學診斷、細胞與組織學診斷及化學診斷是腫瘤診斷的三大主要方法。影 像學診斷在肝癌診斷中起重要的作用，但是在診斷小肝癌及區分良惡性結節中均具有一 定的局限。超聲檢查或CT陽性結果，結合血清甲胎蛋白（a-fetoprotein，AFP)水平高於 400ng/ml的檢測結果，可對肝癌做出確診。但是，通常當這些條件都符合時，己經錯過了治 療的最佳時機。無論是超聲波檢查、CT掃描還是核磁共振，對小病灶的鑑定都有一定的局 限性，尤其是肝硬化結節在影象學上與小肝癌結節有許多的相似之處。因此，雖然影像學技 術在今年來取得了巨大的進步，但臨床上仍需結合肝癌的分子標誌物，在較為複雜的病例 中將良惡性肝病進行區分。
[0004] 目前肝癌診斷最常用的標誌物是甲胎蛋白（AFP)，在症狀和影像學改變發生前數 月即可出現異常。正常人血清中AFP含量一般小於10ng/ml。當AFP的診斷值定為20ng/ ml時，其敏感性為50 % -60 %，但在腫瘤較小的病例中，敏感性顯著降低，有報導僅為40 %。 單獨使用AFP作為肝癌診斷標誌物的另一個問題是缺乏特異性，在相當多的慢性肝炎患者 尤其是肝硬化患者中，AFP含量也達20-200ng/ml。目前認為可與AFP互補診斷的標誌物有 AFP異質體、Y -穀氨酞轉移酶同工酶II和異常凝血酶原等，但由於它們在敏感性和特異性 上的不足，以及檢測方法的繁瑣複雜，使其始終停留在實驗室研究水平，未能轉化成臨床常 規檢查項目。因此，探索新的腫瘤分子標誌物，以及建立相應的易於推廣的檢測方法，仍是 當今肝癌研究領域的重要課題之一。
[0005] 隨著對HBV和原發性肝癌研究的深入，人們發現HBV中的X基因表達產物（HBx) 在肝癌形成過程中起著關鍵的作用。在誘發肝細胞癌的眾多因素中，B型肝炎病毒感染佔 到50%以上。最新的研究顯示，HBx具有廣泛的基因轉錄調控作用，與慢性HBV感染者發展 成為HCC密切相關。X基因位於HBV基因組的1374-1836位置，編碼155個胺基酸的多肽， 即HBx。X基因常隨HBV基因組一同整合於肝細胞的染色體中，利用宿主細胞轉錄和翻譯 體系合成HBx。HBx具有廣泛的基因轉錄調控作用，不僅能夠激活病毒基因調控序列，而且 能夠與宿主細胞多種蛋白相互作用，從而影響宿主細胞周期、影響細胞增殖分化與凋亡、使 肝細胞發生惡性轉化。HBx可與轉錄因子XPA-1、DDB1、RPB5和TFIIB結合，以提高基因轉 錄水平、抑制DNA的修復、促進病毒自身複製；HBx還具有反式激活作用，可上調多種細胞因 子及其受體，如血管內皮生長因子（VEGF)、胰島素樣生長因子（IGF)及其受體的表達；激活 C-myt、N-ras等癌基因，與抑癌基因 p53結合，抑制P53的核轉移及正常的轉錄調節功能。 此外，HBx還可上調Η印G-2的細胞端粒酶活性，改變抑癌基因 p55負調控功能，抑制細胞凋 亡，四細胞發生惡性轉化，與HCC的發生密切相關。近幾年國外研究顯示，在HBV感染後約 60%肝癌患者血清中可檢測到HBx抗體。血清HBx抗體水平可能成為一種新型的肝癌標誌 物。
[0006] 目前，免疫分析技術在B型肝炎病毒X蛋白抗體免疫分析產品的應用方面仍未 見。因此，本領域迫切需要開發可靈敏檢測B型肝炎病毒X蛋白抗體的檢測系統及檢測方 法，為臨床腫瘤的診斷提供良好的途徑。


【發明內容】

[0007] 本發明提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩定地檢測B型肝炎病毒X蛋白抗體的 試劑盒，該試劑盒適於在產業上有效地推廣應用。
[0008] 本發明提供了一種抗B型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒及其制 備方法。
[0009] 該抗B型肝炎病毒X蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒包括：1)重組B型肝炎病毒X 蛋白；2)抗B型肝炎病毒X蛋白抗體陰、陽性對照品；3)酶標記結合物；4)顯色底物；5)濃 縮洗漆液。
[0010] 在本發明中，重組B型肝炎病毒X蛋白包含至少一個B型肝炎病毒X蛋白的抗原 表位，以便結合於抗B型肝炎病毒X蛋白的抗體。該重組B型肝炎病毒X蛋白可進一步含 有B型肝炎病毒X蛋白的全長或部分胺基酸序列，以增加特異性免疫反應。並且各個該乙 型肝炎病毒X蛋白的抗原表位之間、各個該B型肝炎病毒X蛋白的部分胺基酸序列之間以 及B型肝炎病毒X蛋白的抗原決定位與B型肝炎病毒X蛋白的部分胺基酸序列之間可進 一步由連接片段連接。在本發明的一個實施例中，重組B型肝炎病毒X蛋白序列如SEQ ID No. 1所示。
[0011] 理想的固相載體應與重組B型肝炎病毒X蛋白有較高的結合容量，且結合穩定極 少脫落；並且其可結合抗原或抗體免疫反應物，以及如親和素或鏈黴親和素等大分子蛋白 質；重組B型肝炎病毒X蛋白固相化後仍應保持活性，而且為有利於反應充分進行，最好其 活性基團朝向反應溶液；此外，固相化方法應簡便易行、快速經濟。在本發明中，固相載體 可以採用塑料製品，使得重組B型肝炎病毒X蛋白可通過非共價或物理吸附機制結合到固 相載體表面，比如：聚苯乙烯製成的小試管、小珠和微量反應板。固相載體也可以採用微顆 粒，此類固相載體系由高分子單體聚合成的微球或顆粒，其直徑多為微米（μ m)，由於帶有 能與蛋白質結合功能團（如一 NH2、一 C00H、一 0H、一 CH0或一 NH - NH2等），易與抗體（抗 原）形成化學偶聯，且結合容量大。並且，固相載體還可以採用膜載體，包括硝酸纖維素膜 (nitrocellulose, NC)玻璃纖維素膜及尼龍膜等微孔濾膜。優選地，在本發明的一個實施 例中，包被所述重組B型肝炎病毒X蛋白的固相載體為微孔板。
[0012] 在本發明中，酶標記結合物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記 結合物質量的好壞直接關係到免疫酶技術的成功與否，因此被稱為關鍵的試劑。優選地，酶 標記結合物為酶標記抗體，其將酶與特異性抗體經適當方法連接而成。更優選地，酶標記結 合物為辣根過氧化物酶（HRP)、鹼性磷酸酶（AP)、葡萄糖氧化酶、β -半乳糖苷酶、溶菌酶和 蘋果酸脫氫酶等。進一步優選地，酶標記結合物為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶標記的檢 測抗體。
[0013] 在本發明中，顯色底物可以是易於配製、保存且產生的信號產物易於觀察和檢測 並且對人無害且價廉、易得等特點的任何顯色底物。優選地，顯色底物為鄰苯二胺（0PD)、四 甲基聯苯胺（TMB)和對硝基苯磷酸酯（p-NPP)。更優選地，顯色底物為3, 3'，5, 5' -四甲基 聯苯胺。
[0014] 在本發明中，還提供了抗B型肝炎病毒X (HBx)蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒在 檢測抗B型肝炎病毒X蛋白抗體中的應用。
[0015] 在本發明中，又提供了抗B型肝炎病毒X (HBx)蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒在 製備用於肝癌診斷的試劑盒中的應用。
[0016] 此外，本發明還進一步提供了一種製備抗B型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗體酶聯免 疫測定試劑盒的方法，包括以下步驟：1)通過原核載體表達重組B型肝炎病毒X蛋白；2) 製備包被所述重組B型肝炎病毒X蛋白的固相載體；3)以抗B型肝炎病毒X蛋白抗體陰、 陽性血清製備對照品；4)以酶標記檢測抗體；5)配製顯色底物；6)配製濃縮洗滌液；7)分 裝所述抗B型肝炎病毒X蛋白抗體陰、陽性對照品、酶標記結合、顯色底物及濃縮洗滌液； 8)組裝為成品。
[0017] 其中，製備包被所述重組B型肝炎病毒X蛋白的固相載體的步驟2)採用以下方 法：1)包被：用〇. 02M PH值為8. 5的磷酸緩衝液配製成所需濃度的所述重組B型肝炎病毒 X蛋白包被液，並將包被液負載於固相載體上；2)封閉：用含5%酪蛋白或5%脫脂奶粉PH 值為6. 8-7. 3,濃度為0. 01M的磷酸鹽緩衝液作為封閉液封閉所述固相載體。
[0018] 在本發明中，優選地，包被重組B型肝炎病毒X蛋白的固相載體為微孔板、 塑料珠、塑料管；酶為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶標記的檢測抗體；顯色底物為 3, 3'，5, 5'-四甲基聯苯胺。
[0019] 本發明的抗B型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒採用間接酶聯免 疫分析法，檢測HBx抗體。樣品中的抗體首先被包被於微孔板上的B型肝炎病毒重組抗原 捕獲，在洗掉樣品的其它部分，再加入辣根過氧化物酶（HRP)標記的羊抗人抗體，就可以形 成標記物複合物，洗板加入顯色液A、顯色液B以及加入終止液後，用酶聯免疫分析儀測量 吸光值，吸光值與樣本中抗體濃度呈正相關，與臨界值相比較，從而判斷陰陽性。
[0020] 為了提高本發明的抗B型肝炎病毒x(HBx)蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒的性能 穩定性，本發明首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質量鑑定，包括標記抗體與包被抗 體的活性、載體（微孔板）的吸附性能和變異大小、酶的活性、顯色底物的靈敏度及穩定性 等，從而提高本發明的試劑盒的靈敏度和穩定性。並且還對包被方法進行了研究，用不同的 包被緩衝液和保護液進行實驗，選擇出最適合的包被緩衝液和保護液，通過抗原不同包被 濃度實驗找到最佳的濃度條件。對於HRP的標記可以有不同的方法，通過反覆探索和對比 實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，並對不同的酶稀釋液進行了 長期的考察實驗，配製出了能夠使酶標記物長期保持活性穩定的稀釋液。本發明對試劑盒 的各個組件進行了優化，使得試劑盒在應用中每個步驟都發揮最優的效果，綜合上提高試 劑盒特異及高效的檢測效果。
[0021] 本發明的HBx抗體免疫分析測定試劑盒可以非常專一地檢測出感染B型肝炎病 毒後人體中的HBx抗體，可以根據HBx抗體變化情況判斷治療效果及其病情的變化。它具 有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。且根據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需 要昂貴的全自動分析儀，更能適合廣大的中小醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供 一種非常有價值的檢測手段。
[0022] 此外，本發明還證實了 HBx抗體與AFP在肝癌中表達無相關性。因此，可以採用本 發明的試劑盒和HCC腫瘤標記物AFP二者聯合檢測，並且通過本發明的實施例證實二者聯 合檢測能夠將敏感性提高到75. 95%，漏診率降至24. 05%。因此，本發明在作為新型肝癌 檢測手段的同時，還可以通過腫瘤標誌物的聯合應用能提高肝癌的檢出率，是解決AFP假 陽性和假陰性問題的有效途徑，是肝癌血清學診斷方法發展的必然趨勢。
[0023] 此外，本發明還提供了一種用於肝癌診斷的定量檢測試劑盒，包括相互獨立的抗 B型肝炎病毒X蛋白抗體定量檢測單元和甲胎蛋白定量檢測單元。在本發明中，可以分別 採用抗B型肝炎病毒X蛋白抗體定量檢測單元和甲胎蛋白定量檢測單元對樣品進行檢測， 從而提高肝癌的檢出率，解決AFP假陽性和假陰性問題。
[0024] 在本發明的一個實施例中，抗B型肝炎病毒X蛋白抗體定量檢測單元可以至少包 括包被抗B型肝炎病毒X蛋白的固相載體和抗B型肝炎病毒X蛋白抗體陰、陽性對照品；甲 胎蛋白定量檢測單元可以至少包括包被甲胎蛋白抗體的固相載體和甲胎蛋白陰、陽性對照 品。其中，抗B型肝炎病毒X蛋白抗體定量檢測單元還可以包括酶標記結合物、顯色底物和 濃縮洗滌液。甲胎蛋白定量檢測單元還可以包括酶標記結合物、顯色底物和濃縮洗滌液。通 過抗B型肝炎病毒X蛋白抗體定量檢測單元定量檢測抗B型肝炎病毒X蛋白抗體，判斷肝 癌陽性的情況，並通過甲胎蛋白定量檢測單元定量檢測甲胎蛋白，判斷肝癌陽性的情況。由 於HBx抗體與AFP在肝癌中表達無相關性，因此二者聯合檢測能夠最終提高肝癌的檢出率， 解決AFP假陽性和假陰性問題。
[0025] 其中，所述抗B型肝炎病毒X蛋白抗體定量檢測單元可以是如權利要求1-4所述 的抗B型肝炎病毒X蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒。
[0026] 在本發明中，還提供了用於肝癌診斷的定量檢測試劑盒在製備用於肝癌診斷的免 疫測定試劑盒中的應用。
[0027] 本發明證實了 HBx抗體與AFP在肝癌中表達無相關性。因此，可以採用本發明的聯 合檢測試劑盒對HBx抗體與AFP二者聯合檢測，並且能夠提高肝癌診斷的敏感性，解決AFP 假陽性和假陰性問題。本發明的聯合檢測試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩定等優點。且根 據本發明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動分析儀，更能適合廣大 的中小醫院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1示出純化HBx的SDS-PAGE圖。
[0029] 圖2示出HBx抗體濃度與吸光度線性關係。

【具體實施方式】
[0030] 以下通過實施例並結合附圖來進一步詳細說明本發明，但不用來限制本發明的範 圍。
[0031] 實施例ΙΗΒχ重組蛋白誘導表達和純化
[0032] HBx的誘導表達：將已轉化了含有HBx蛋白的PET-30a_X重組質粒的菌體挑單菌 落接種於15ml含卡那抗性的LB溶液中，37°C振蕩培養過液。次日，取10ml菌液轉種於 1000ml卡那抗性的LB培養液中，37°C繼續振蕩培養約2-3小時。當0D_達到0. 4-0. 6之 間時，加入200mg/ml的IPTG 583μ 1，繼續培養4小時以上。
[0033] 其中，HBx 重組蛋白的胺基酸序列（SEQ ID No. 1)為：MAARLCCQLDPARDVLCLRPVGAE SRGRPVSGPFGPLPSPSSSAVPADHGAHLSLRGLPVCAFSSAGPCALRFTSARSMETTVNAHQVLPKVLHKRTLGLS AMSTTDLEAYFKDCLFKDWEELGEEIRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNFFPSA 〇
[0034] HBx融合蛋白的純化：8000r/min，10分鐘離心收集經過IPTG誘導表達的菌體於 50ml離心管中，倒去上清，用30ml洗滌緩衝液（緩衝液A)洗滌沉澱。洗滌兩次後，10000r/ min離心約10分鐘，冰上超聲破碎菌體，再離心，收集上清。沉澱即為包涵體，用於下一步的 處理。
[0035] 取適量的包涵體製備過程中的上清和包涵體沉澱，用2XSDS-PAGE緩衝液進行 SDS-PAGE電泳。用考馬斯亮藍染色，確定目的蛋白位置。
[0036] 包涵體的溶解：取部分製備好的包涵體沉澱，稱溼重。每克菌體加入5ml緩衝液B， 於室溫輕輕混合，降低粘稠度，直至液體變透明狀為止。離心除去殘餘的細胞碎片，取上清。 置於冰上或-20°C保存。
[0037] 親和層析純化HBx融合蛋白：採用PET系統表達出帶6個組氨酸標記的融合蛋白 是以包涵體形式存在，所以需在變性條件下用Ni-NTA樹脂從包涵體中純化帶His-Tag的融 合蛋白。
[0038] 1)取4ml製得的包涵體的溶液，加入1ml 50%的Ni-NTA樹脂，室溫輕輕混合約30 分鐘。將以上混合液輕輕轉移至一個空的層析柱管中。
[0039] 2)除去柱管的底帽，收集流出液體，留待SDS-PAGE檢測。
[0040] 3)用4ml緩衝液C清洗2次，收集每一次流出液體，留待SDS-PAGE檢測。
[0041] 4)用0. 5ml緩衝液D清洗4次，取樣留待SDS-PAGE檢測。
[0042] 5)最後，用0. 5ml緩衝液E清洗4次，取樣留待SDS-PAGE檢測。
[0043] SDS-PAGE電泳：用SDS-PAGE確定目標蛋白在洗脫液中的分布情況，通過對凝膠的 掃描，檢測純化出蛋白的純度。
[0044] 通過SDS-PAGE電泳判斷（圖1)，將HBx重組載體在宿主菌中進行了高效表達。經 過鎳柱親和層析純化並透析復性脫鹽，得到高純度的HBx，純度可達95%以上。
[0045] 實施例2製備本發明的HBx抗體免疫分析測定試劑盒
[0046] 在本發明的研究過程中，本發明的發明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和 質量鑑定，包括標記抗體與包被抗體的活性、載體（微孔板）的吸附性能和變異大小、酶的 活性、顯色底物的靈敏度及穩定性等。然後對包被方法進行了研究，用不同的包被緩衝液和 保護液進行實驗，選擇出最適合的包被緩衝液和保護液，通過抗原不同包被濃度實驗找到 最佳的濃度條件。對於HRP的標記可以有不同的方法，通過反覆探索和對比實驗最終找到 了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，並對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實 驗，配製出了能夠使酶標記物長期保持活性穩定的稀釋液。
[0047] 一、酶標抗體製備
[0048] 捕獲抗體用高碘酸鈉法與辣根過氧化物酶偶聯，用PBS充分透析，加等體積甘 油，-20°C以下保存。
[0049] 二、HBx抗體陰、陽性對照品的製備
[0050] 混合6份以上經western blot檢測HBx抗體陽性血清或陰性血清，經HIV、TP以 及HCV抗體測定均為陰性血清，60°C滅活1小時，過濾除菌、適度稀釋、分裝，低溫凍存。
[0051] 三、固相包被板的製備
[0052] (1)包被：將純化的HBx用50mmol/L碳酸鹽緩衝液稀釋，稀釋至12 μ g/ml，然後加 入包被板條各孔內，37°C放置1?2小時後2?8°C過夜,甩幹；
[0053] ⑵封閉：按150 μ 1/孔用含5%酪蛋白或5%脫脂奶粉的PH7. 4的磷酸鹽緩衝液， 37°C封閉1小時，甩幹；
[0054] (3)保護：按150 μ 1/孔用含20%蔗糖的PH7. 4的磷酸鹽緩衝液室溫保護3小時；
[0055] (4)乾燥：置乾燥室乾燥後，按48?96孔/包來裝入含乾燥劑的包裝袋中，封口 並冷藏備用。
[0056] 四、酶標抗體濃度選定
[0057] 酶標抗體稀釋液：為硼砂1. 43049、硼酸5. 25649、小牛血清200ml、甘油20ml、 Proclin3001ml，雙蒸水溶解，定溶 1000ml。
[0058] 採用方陣法選擇酶標抗體的工作濃度1:10000。
[0059] 五、試劑配製
[0060] (1)濃縮洗滌液：含 1 % Tween-20 的 PH7. 4Tris-HCl 緩衝液；
[0061] ⑵樣品稀釋液：以三蒸水配內含0. 5%?2% BSA的PH7. 4磷酸鹽緩衝液；
[0062] (3)酶標工作液：以三蒸水配PH7. 2的磷酸鹽緩衝液，內含0. 5%?2% BSA ;0. 5% 酶保護劑；〇. 05% PiOclin-300及以0. 1% Tween-20,以適當的濃度稀釋凍存標記的酶；
[0063] (4)顯色劑A :以三蒸水配PH 5. 0醋酸鹽緩衝液，內含0. 05%過氧化脲；
[0064] (5)顯色劑B :用甲醇配0. 16%四甲基聯苯胺，溶解後對倍加甘油；
[0065] (6)終止液：以三蒸水配2mol/L硫酸溶液；
[0066] (7)陽性對照：取篩出的陽性血清（0D彡0· 500)加少量紅色染料並按1000單位/ ml加青黴素和鏈黴素，無菌過濾；
[0067] (8)陰性對照：取篩出的陰性血清（0D < 0. 100)，按1000單位/ml加青黴素和鏈 黴素，無菌過濾。
[0068] 六、半成品及成品組成
[0069] 按每盒1包48?96孔/包的抗原預包被條、1瓶濃縮洗滌液、1瓶樣品稀釋液、1 瓶酶結合物工作液、1瓶顯色劑A、1瓶顯色劑B、1瓶終止液、1瓶陽性對照、1瓶陰性對照和 1份使用說明書組裝。
[0070] 上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩定 性檢定合格才能組裝成HBx抗體測定試劑盒。組裝成試劑盒後還需抽檢合格後才能出廠。
[0071] 實施例3本發明試劑盒的使用方法
[0072] 以上實施例2製備的HBx抗體測定試劑盒的具體操作如下：
[0073] (1)洗滌液：濃縮洗液以1: 20稀釋作為工作洗滌液備用；
[0074] (2)將試劑及所需數量的微孔反應條置室溫平衡；
[0075] (3)吸取100μ 1B型肝炎病毒HBx抗體陰陽性對照品及待檢樣本，按順序加入微 孔反應條小孔中並加貼封片；
[0076] (4) 37 °C水浴孵育30分鐘；
[0077] (5)在第一次孵育結束後，小心將微孔反應條上的封片揭下並棄掉，將微孔反應條 放入洗板機吸乾各孔並每孔注入洗滌液200 μ 1，再吸乾各孔，重複以上洗滌5次，最後一次 將微孔反應條拍幹；
[0078] (6)每孔中加入100 μ 1標記物工作液，並加貼封片；
[0079] (7) 37 °C水浴孵育30分鐘；
[0080] (8)第二次孵育結束後，小心將微孔反應條上的封片揭下並棄掉，將微孔反應條放 入洗板機吸乾各孔並每孔注入洗滌液200 μ 1，再吸乾各孔，重複以上洗滌6次，最後一次將 微孔反應條拍幹；
[0081] (9)每孔加顯色液Α -滴（約50 μ 1),加顯色液Β -滴（約50 μ 1)。封板膜封板 後37 °C避光顯色10分鐘；
[0082] (10)每孔加終止液一滴（約50 μ 1)，終止反應。用空白孔調零，於450nm波長（建 議使用雙波長，參考波長為620nm)酶標儀上讀取0D值；
[0083] (11)與臨界值比較後判斷結果。
[0084] 實施例4本發明試劑盒的方法學鑑定
[0085] 按照本領域中常規的製造及檢定規程對實施例2中製備的試劑盒進行檢定，見下 表1:
[0086] 表1 HBx抗體檢測試劑盒性能分析
[0087]

【權利要求】
1. 一種抗B型肝炎病毒X蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒，包括： 1) 重組B型肝炎病毒X蛋白； 2) 抗B型肝炎病毒X蛋白抗體陰、陽性對照品； 3) 酶標記結合物； 4) 顯色底物； 5) 濃縮洗滌液。
2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述重組B型肝炎病毒X蛋白序列如SEQ ID No. 1 所示。
3. 如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，包被所述重組B型肝炎病毒X蛋白的固相 載體為微孔板。
4. 如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述酶標記結合物為辣根過氧化物酶或 鹼性磷酸酶標記的檢測抗體。
5. 如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述顯色底物為3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯 胺。
6. 權利要求1-5任一項所述的試劑盒在檢測抗B型肝炎病毒X蛋白抗體中的應用。
7. 權利要求1-5任一項所述的試劑盒在製備用於肝癌診斷的試劑盒中的應用。
8. -種製備權利要求1-5所述試劑盒的方法，其特徵在於包括以下步驟： 1) 通過原核載體表達重組B型肝炎病毒X蛋白； 2) 製備包被所述重組B型肝炎病毒X蛋白的固相載體； 3) 以抗B型肝炎病毒X蛋白抗體陰、陽性血清製備對照品； 4) 以酶標記檢測抗體； 5) 配製顯色底物； 6) 配製濃縮洗滌液； 7) 分裝所述抗B型肝炎病毒X蛋白抗體陰、陽性對照品、酶標記結合、顯色底物及濃縮 洗滌液； 8) 組裝為成品。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，製備包被所述重組B型肝炎病毒X蛋白的固 相載體的步驟2)採用以下方法： 1) 包被：用〇. 02M PH值為8. 5的磷酸緩衝液配製成所需濃度的所述重組B型肝炎病 毒X蛋白包被液，並將包被液負載於固相載體上； 2) 封閉：用含5%酪蛋白或5%脫脂奶粉PH值為6. 8-7. 3,濃度為0.01M的磷酸鹽緩衝 液作為封閉液封閉所述固相載體。
10. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述包被重組B型肝炎病毒X蛋白的固相 載體為微孔板、塑料珠、塑料管。
11. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述酶為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶標 記的檢測抗體；所述顯色底物為3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺。
12. -種用於肝癌診斷的定量檢測試劑盒，包括相互獨立的抗B型肝炎病毒X蛋白抗 體定量檢測單元和甲胎蛋白定量檢測單元。
13. 如權利要求12所述的試劑盒，其特徵在於，所述抗B型肝炎病毒X蛋白抗體定量檢 測單元至少包括包被抗B型肝炎病毒X蛋白的固相載體和抗B型肝炎病毒X蛋白抗體陰、 陽性對照品；所述甲胎蛋白定量檢測單元至少包括包被甲胎蛋白抗體的固相載體和甲胎蛋 白陰、陽性對照品。
14. 如權利要求12所述的試劑盒，其特徵在於，所述抗B型肝炎病毒X蛋白抗體定量檢 測單元是如權利要求1-4所述的抗B型肝炎病毒X蛋白抗體酶聯免疫測定試劑盒。
15. 如權利要求12-14所述的試劑盒在製備用於肝癌診斷的免疫測定試劑盒中的應 用。
【文檔編號】G01N33/68GK104297494SQ201410637265
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年11月12日 優先權日:2014年11月12日
【發明者】張曉東, 葉麗虹 申請人:天津託普法瑪生物科技有限公司