用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微鏡檢查的痰塗片及其製備方法和用途的製作方法

2023-06-15 09:43:06

專利名稱：用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微鏡檢查的痰塗片及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及衛生檢疫、衛生監管、醫藥技術、公共衛生領域，具體地說是涉及一種 痰塗片，尤其涉及一種用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微鏡檢查的痰塗片；此外，本發明還 涉及該痰塗片的製備方法和用途。
背景技術：
作為WT0的成員國，2002年4月我國建立了與國際慣例接軌的合格評定體系，其中 包括實驗室國家認可體系。建立質量管理體系的基本作用是幫助實驗室提供持續滿足要求的數據和報告、提 高競爭力、增強顧客滿意。(1)實驗室為顧客持續提供滿意的服務需要質量管理體系。質量 管理體系方法鼓勵實驗室分析顧客要求，規定滿足顧客要求的檢測/校準實現過程及相關 的支持過程，並使其持續受控。質量管理體系能提供持續改進的框架，以增加顧客和其它相 關方滿意的機會。(2)質量管理體系也是顧客的需要。顧客可通過質量管理體系評價實驗 室的能力，選擇滿意的供方。一、能力驗證能力驗證(Proficiency Testing)是利用實驗室間比對來判定實驗室和檢查機構 能力的活動，也是認可機構加入和維持國際相互承認協議(MRA)的必要條件之一。室間質量評估是根據與其他網絡實驗室比較批量測試和盲法復檢結果評價實驗 室能力及操作質量的過程。室內質量控制是指實驗室內部的各操作過程的內部檢查與監測。認證是指由認證機構證明產品、服務、管理體系符合相關技術規範、相關技術規範 的強制性要求或者標準的合格評定活動。認可是由權威機構對檢測/校準實驗室及其人員有能力進行特定類型的檢測/校 準做出正式承認的程序。所謂權威機構，是指具有法律或行政授權的職責和權力的政府或 民間機構。這種承認，意味著承認檢測/校準實驗室有管理能力和技術能力從事特定領域 的工作。因而，實驗室認可的實質是對實驗室開展的特定的檢測/校準項目的認可，並非實 驗室的所有業務活動。進行實驗室認可可以提高實驗室自身的管理水平和技術能力，確保 出具數據的準確性和可靠性，增加顧客對實驗室的信任。具體而言，可以歸納為以下幾個方(1)表明實驗室具備了按有關國際準則開展校準/檢測的技術能力。(2)增強實驗室在校準/檢測市場的競爭能力，贏得政府部門和社會各界的信任。(3)參與國際間實驗室認可雙邊、多邊合作，得到更廣泛的承認。(4)列入《國家實驗室認可名錄》，提高實驗室的知名度。(5)可在認可項目範圍內使用認可標誌。根據中國實驗室國家認可委員會(CNAL)的要求，申請認可的檢測/校準實驗室必
4須滿足的條件包括具有明確的法律地位，即實驗室或所在母體應是一個能夠獨立承擔法 律責任的實體；按認可準則及其應用說明建立質量管理體系，且各要素(過程)都已運行並 有相應記錄，包括完整的內部審核和管理評審；質量管理體系運行至少六個月；在申請後 三個月內可接受CNAL的現場評審；具有申請認可範圍內的檢測/校準能力，並在可能時至 少參加過一次CNAL或其承認的能力驗證活動；具有支配所需資源的權力；遵守CNAL認可 規則、認可政策等有關規定，包括支付認可費用，履行相關義務。CNAL能夠向實驗室提供全面的認可，包括對產品或材料進行監測、測試或評價的 實驗室，以及對檢測儀器或測量裝置進行校準的實驗室。實驗室認可機構許諾不對申請認 可的實驗室有任何的歧視行為，即不論其屬性，為私有的，股份制的、行業的或政府的，也不 論其人員數量的多少，規模的大小或檢測/校準活動範圍的大小，都一視同仁地提供認可 服務。國際上實驗室認可採用的四項原則是自願申請、非歧視性、專家評審和國家認可。自願申請原則是指實驗室是否申請認可，是根據其需求自主決定的，即認可機構 不會強制任何一個實驗室申請。但對於實驗室而言，這一自願性原則實際上會受到顧客需 求的制約，即當顧客提出實驗室必須通過認可方可承擔起檢測/校準業務，而實驗室又希 望承接這項業務時，申請認可便可成為一種強制行為；另外，當實驗室的母體機構或其管理 機構由要求時，申請認可也會成為一種強制要求。無論基於上述哪一種情況，強制的要求都 不會來自認可機構。對於檢測/校準實驗室而言，應選擇IS0/IEC 17025實驗室認可。二、痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測「痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測」作為發現結核病的傳染源、確定診斷和制定 化療方案、考核療效、評價防治效果的重要方法，是結核病細菌學檢查中效率_成本比最高 的檢測技術。結核病細菌學檢測是結核病控制目標的重要組成部分，對於加強結核病控制 工作，實現全球結核病控制目標具有重要意義，在現代結核病控制工作中起著不可或缺的 重要作用。「痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測」也是結核病實驗室檢查中的最重要項目， 開展痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測項目的能力驗證活動是為具有該檢測項目的實驗 室進行該項目的實驗室認可提供了依據，也是幫助實驗室提供持續滿足結核病實驗室診斷 要求的數據和報告、提高競爭力、增強顧客滿意的一種重要途徑。實施該項目能力驗證活動 不僅可以了解參評實驗室在該項檢測能力上的水平，促進抗酸染色操作技術、顯微鏡檢測 技術的規範化，以持續提高實驗室的工作效率和可靠性，並通過採取一系列措施改進和不 斷提高實驗室痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測的能力，加強對結核病檢測實驗室的監督 管理，提高我國結核病檢測實驗室的水平，確保結核病細菌學檢測中痰塗片抗酸染色查找 抗酸桿菌檢測的質量，促進結核病防治工作的發展。也為國內各地區實驗室在痰塗片檢測 抗酸桿菌項目的工作中提供一個技術、質量管理的交流平臺。抗酸桿菌(acid-fast bacillus, AFB)主要指分枝桿菌由於細胞結構和細胞成分 的特殊性，具有經鹼性染料染色後能夠耐受酸性介質脫色的特性，具備相應染色特徵的細 菌習慣上被稱為抗酸菌。抗酸染色法是指抗酸菌具有耐受酸性介質脫色的生物性狀，此類細菌在石碳酸 (苯酚)的協同作用下，被復紅染色劑著色，能夠耐受酸性乙醇脫色，顯微鏡觀察時保持紫
5紅色，而其他脫落細胞或標本中的非抗酸菌被酸性乙醇脫色後，可被復染劑亞甲藍染為藍 色。為紀念方法的發明人抗酸染色法也稱Ziehl-Neelson染色法，Z_N染色法，萋-尼氏染 色。抗酸桿菌主要包括分枝桿菌和少數具有抗酸染色特徵的細菌。分枝桿菌包括結核分枝桿菌複合群和非結核分枝桿菌。結核分枝桿菌多數為 杆狀、稍彎曲；菌體寬度0.3-0. 6 ym(微米)；菌體長度不一，在0.5-8 ym之間，多數在 1.5-3. 5pm;少數菌體較長者可呈螺旋狀；染色良好的結核分枝桿菌菌體內，能夠發現著 色較深的異染顆粒。含結核分枝桿菌較多的新鮮標本經抗酸染色在1000倍放大的顯微鏡 下，既能發現單個存在的細菌，也能看到聚集成簇或分支狀排列的細菌。多數非結核分枝杆 菌的形態較結核分枝桿菌短且粗，呈棒狀、短棒狀，甚至顆粒狀。痰塗片是指用人體分泌出的痰液直接或經過處理後，取一定量均勻塗抹於清潔的 載玻片上，乾燥後而成的痰膜。合格的痰液是人體在深呼吸後，由肺部深處咳出的分泌物。抗酸桿菌顯微鏡檢查的目的1、傳染性肺結核病的診斷指標，2、評價傳染性結核 病的化療效果，3、為結核病流行病學指標服務。目前制約痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測項目的能力驗證活動開展的關鍵的 瓶頸就是樣品的製備，其難度在於1、分枝桿菌細菌懸液是顆粒物的懸濁液，在大規模樣品製備過程中如何保證每個 樣品的均勻性符合要求是難點。2、痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測是一項半定量的微生物形態學項目，其診斷 依據是根據顯微鏡下1000倍放大後觀察到平均視野中痰塗片裡含有抗酸桿菌的數量給予 半定量的檢測結果，如0條/300個視野未發現抗酸桿菌-報告陰性；發現1-2條抗酸桿菌 /300個視野-報告可疑；發現3-9條抗酸桿菌/100個視野-報告1+ ；發現1-9條抗酸杆 菌/10個視野_報告2+ ；發現1-9條抗酸桿菌/個視野-報告3+ ；發現> 9條抗酸桿菌 /個視野-報告4+;如何保證大規模樣品中每個樣品的半定量濃度的一致是難點。痰塗片 抗酸染色查找抗酸桿菌檢測報告方式參見GB15987-1995傳染性肺結核診斷標準及處理 原則附錄B痰結核桿菌檢查(補充件)。3、由於樣品的檢測結果來源於平均視野的細菌含量，因此主觀因素客觀存在，如 何克服主觀因素對能力驗證結果的評估的影響，是難點。由於樣品製備和結果判定的困難，所以覆蓋各種半定量濃度的痰塗片抗酸染色查 找抗酸桿菌檢測能力驗證活動或室間質量評估或室內質量控制沒有在我國進行過。

發明內容
本發明要解決的技術問題在於提供一種用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微鏡檢 查的痰塗片。該痰塗片的均勻性和穩定性較高，採用這種痰塗片可以應用於結核病檢測能 力驗證活動或實驗室室間質量評估、室內質量控制的工作中，從而對痰塗片抗酸染色查找 抗酸桿菌檢測這個項目進行質量控制和技術人員的培訓。為此，本發明還提供了該痰塗片 的製備方法和用途。為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現在本發明的一方面，提供一種用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微鏡檢查的痰塗 片，其包括陰性、1+、2+、3+、4+共五種抗酸桿菌含量的痰塗片，該陰性痰塗片的抗酸桿菌含
6量為0條/300個視野；該1+痰塗片的抗酸桿菌含量為3-9條抗酸桿菌/100個視野；該2+ 痰塗片的抗酸桿菌含量為1-9條抗酸桿菌/10個視野；該3+痰塗片的抗酸桿菌含量為1-9 條抗酸桿菌/個視野；該4+痰塗片的抗酸桿菌含量為> 9條抗酸桿菌/個視野；所述的抗 酸桿菌來源於痰液或者培養細菌菌落。在本發明的另一方面，提供一種上述痰塗片的製備方法，所述痰塗片含有的抗酸 桿菌來源於痰液，該方法包括如下步驟1)取不同結核病患者的晨痰，放置於無菌痰標本採集容器中，細菌滅活處理(可 採用80°C水浴，30分鐘-120分鐘)；2)自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，使痰液液化並用PBS稀釋後，離心，使細 菌集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入PBS混勻作為痰懸液，用痰塗片抗酸染色顯微 鏡鏡檢法檢測細菌數量作為初始等級濃度，然後根據抗酸桿菌目的等級濃度計算稀釋倍 數，並用PBS稀釋至目的等級濃度的痰稀釋液；3)取上述痰稀釋液於載玻片上塗抹成橢圓形痰膜，自然乾燥，火焰固定；在載玻 片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，室溫保存。在步驟2)中，所述痰稀釋液中抗酸桿菌的目的等級濃度為0條/ml，0. 8-2. 2 X 104 條/ml，0. 3-2. 2父105條/1111，0. 3-2. 2X 106 條/ml，或者> 2. 2X106 條/ml。在步驟3)完成後，還包括如下包裝步驟痰塗片採用三層包裝，第一層將痰塗片 放置在專用的載玻片盒中，第二層在載玻片盒外用抗震隔膜包裹，第三層是外用防水紙箱 包裝。步驟3)中，所述樣品編號是計算機編程設計一組無重複數字的隨機序列號，將該 數字對應於每個痰塗片，使每個樣品獲得唯一的數字標識，該數字標識中的數字表示製備 地區、製備時間及痰塗片序列號。在本發明的另一方面，提供另一種上述痰塗片的製備方法，所述痰塗片含有的抗 酸桿菌來源於培養細菌菌落，該方法包括如下步驟1)卡介苗菌懸液的製備取卡介苗的初生長兩周的細菌菌落放入玻璃磨菌器底 部或具有玻璃珠的離心管內，其中加入含0.5%吐溫-80的PBS，經細菌滅活處理(可採用 80°C水浴，30分鐘-120分鐘)；自然冷卻後，充分攪拌振蕩使菌液呈乳酪樣，以含0. 5%吐 溫-80的生理鹽水或者PBS磨菌並稀釋，與標準麥氏比濁管比濁，配成lmg/ml的菌懸液；2)取不同非結核病患者的晨痰，放置於無菌痰標本採集容器中，經細菌滅活處理 (可採用80°C水浴，30分鐘-120分鐘)；3)自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，使痰液液化並用PBS稀釋，離心，使痰中 固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作為痰懸液；4)用痰塗片抗酸染色顯微鏡鏡檢法檢測細菌數量作為初始等級濃度，然後根據抗 酸桿菌目的等級濃度計算稀釋倍數，用步驟3)製成的痰懸液將步驟1)製成的菌懸液稀釋 至目的等級濃度的含菌痰稀釋液；取上述含菌痰稀釋液於載玻片上塗抹成橢圓形痰膜，自 然乾燥，火焰固定；在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，室溫保存。在步驟4)中，所述含菌痰稀釋液中抗酸桿菌的目的等級濃度為0條/ml， 0. 8-2. 2X104 條 /ml，0. 3-2. 2X 105 條 /ml，0. 3-2. 2X 106 條 /ml，或者> 2. 2X 106 條 /ml。步驟4)完成後，還包括如下包裝步驟痰塗片採用三層包裝，第一層將痰塗片放
7置在專用的載玻片盒中，第二層在載玻片盒外用抗震隔膜包裹，第三層是外用防水紙箱包裝。步驟4)中，所述樣品編號是計算機編程設計一組無重複數字的隨機序列號，將該 數字對應於每個痰塗片，使每個樣品獲得唯一的數字標識，該數字標識中的數字表示製備 地區、製備時間及痰塗片序列號。在本發明的另一方面，提供一種上述痰塗片的均勻性檢測方法，包括如下步驟
1)從相同等級濃度的痰塗片中隨機抽取需要數量的痰塗片，用抗酸染色法對抽樣 的痰塗片進行抗酸染色，並對抽取的各痰塗片進行顯微鏡檢測，記數並報告1-300個視野 下觀察到的抗酸桿菌的數量；2)檢測結果為根據每個痰塗片中的抗酸桿菌量判定得到的分級值陰性、1+、2+、 3+、4+ ；將檢測結果與預期結果進行比較；陰性痰塗片抽樣痰塗片結果均為陰性，則說明 被抽樣的總體均勻；1+痰塗片抽樣痰塗片結果均為1+或2+或1-8條/300視野，則說明 被抽樣的總體均勻；2+痰塗片抽樣痰塗片結果均為1+或2+或3+，則說明被抽樣的總體均 勻；3+痰塗片抽樣痰塗片結果均為2+或3+或4+，則說明被抽樣的總體均勻；4+痰塗片 抽樣痰塗片結果均為3+或4+，則說明被抽樣的總體均勻；「1+」以上的痰塗片出現陰性結 果，說明被抽樣的總體不均勻。在本發明的另一方面，提供一種上述痰塗片的穩定性檢測方法，包括如下步驟1)隨機抽取需要數量的痰塗片，包裝後快遞到不同地區實驗室，室溫保存至計劃 返回日期，以快遞方式返回，用抗酸染色法對返回痰塗片進行抗酸染色後，用顯微鏡法查找 抗酸桿菌；或者隨機抽取需要數量的痰塗片，用抗酸染色法進行痰塗片抗酸染色後快遞到 不同地區實驗室，室溫保存至計劃返回日期，以快遞方式返回，用顯微鏡法查找抗酸桿菌；2)將檢測的結果與預期結果進行比較，陰性痰塗片檢測結果均為陰性，則說明 痰塗片穩定性合格；1+痰塗片檢測結果為1+或2+或1-8條/300視野，則說明痰塗片穩 定性合格；2+痰塗片檢測結果為1+或2+或3+，說明痰塗片穩定性合格；3+痰塗片檢測 結果為2+或3+或4+，說明痰塗片穩定性合格；4+痰塗片檢測結果為3+或4+，說明痰塗 片穩定性合格；「1+」以上的痰塗片出現陰性結果，說明痰塗片不穩定；若結果有差異，說明 痰塗片不穩定，需查找痰塗片不穩定的原因，重新製備痰塗片或改變貯藏、運輸方式。在本發明的另一方面，提供一種上述痰塗片在能力驗證中的應用。在本發明的另一方面，提供一種上述痰塗片在實驗室室間質量評估和室內質量控 制中的應用。本發明用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微鏡檢查的痰塗片，是進行「痰塗片抗酸 染色查找抗酸桿菌檢測」項目的能力驗證活動的關鍵。用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微 鏡檢查的痰塗片與其它類型痰塗片的差別在於1、它必須是由不同抗酸桿菌含量的痰塗片 組成，2、每一種抗酸桿菌含量的痰塗片數量要具有一定規模並且各痰塗片間的抗酸桿菌數 量要均勻，能滿足能力驗證活動的要求，3、痰塗片的穩定性要能滿足能力驗證活動的要求， 4、痰塗片的生物安全方面要能滿足能力驗證活動的要求。進行能力驗證痰塗片的製備可以 保證該項目能力驗證得以實施。本發明的有益效果在於2009年4月-2010年2月，申請人採用上述方法製備了痰 塗片，對全國43家專業實驗室進行了 「痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測」的能力驗證活動。結果顯示本次能力驗證共發送440個檢測樣品，回報了 430個樣品的檢測結果，有414 個樣品檢測結果正確，佔回報樣品數的96.3%。在回報結果的43家實驗室中，有30家實驗 室獲得100分，10家實驗室獲得95分，1家實驗室獲得90分，2家實驗室獲得85分。43家 參加實驗室評分均在80分以上，全部合格。共有16個檢測結果出現低假陽性(4個)和量 化誤差(12個)的不符合情況，涉及13家實驗室。不符合結果中存在系統性偏高的情況涉 及3家實驗室。其中9038實驗室回報結果中4個陰性樣本中存在1個低假陽性誤判，6個 陽性樣本中存在2個量化誤差誤判。本次能力驗證的結果說明了本發明痰塗片的製備方法 是科學的、合理的也是可實施的，且均勻性和穩定性符合能力驗證活動的要求，是一種實用 性很強的痰塗片和痰塗片製備方法。


圖1是實施例中4+痰塗片經抗酸桿菌染色後在顯微鏡下放大1000倍的示意圖；圖2是實施例中3+痰塗片經抗酸桿菌染色後在顯微鏡下放大1000倍的示意圖；圖3是實施例中2+痰塗片經抗酸桿菌染色後在顯微鏡下放大1000倍的示意圖；圖4是實施例中1+痰塗片經抗酸桿菌染色後在顯微鏡下放大1000倍的示意圖；圖5是實施例中陰性痰塗片經抗酸桿菌染色後在顯微鏡下放大1000倍的示意圖。
具體實施例方式以下實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例中未註明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。1.目的開展本次實驗室檢測能力驗證工作的目的是了解該檢測領域的整體水平，本次能 力驗證的結果是實驗室痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測能力的客觀反映。通過此次能力 驗證項目的實施，可加強對實驗室進行結核病病原體檢測工作的監督管理，促進結核病防 治工作的發展。2.實驗方案本次能力驗證計劃方案的設計遵循IS0/IEC導則43-1 1997《利用實驗室間對比 的能力驗證》與GB/T15483. 1-1999《利用實驗室間對比的能力驗證》。對每個參加實驗室 進行唯一性編碼。在報告中只出現實驗室代碼，從而對參加實驗室的有關信息進行保密。2.1樣品的設計本次能力驗證方案製備不同濃度的10組樣品，其中陰性抗酸桿菌濃度3組、1+抗 酸桿菌濃度3組、2+抗酸桿菌濃度2組、3+抗酸桿菌濃度1組、4+抗酸桿菌濃度1組，每組 中有150張含菌量相同的樣品，賦予每張樣品唯一性編號。從10組樣品中各隨機抽取一個 檢測樣品，組成檢測樣品組，分發到參加實驗室。各參加實驗室收到的檢測樣品編號不同， 確保樣品的保密性，如實反映各實驗室的檢測水平，保證了能力驗證的嚴肅性。2. 2樣品的製備2.2. 1、載玻片的準備將新載玻片浸泡於95 %的乙醇中，過夜，取出自然乾燥，備用。2. 2. 2、陰性痰塗片的製備方法
陰性樣品製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提 供)，放置於無菌痰標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘-120分鐘)；自然 冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC (氫氧化鈉-N乙醯半胱氨 酸)混勻20分鐘後，用PH6. 8 PBS (磷酸緩衝液)稀釋至50ml，離心3000g(離心力)，30分 鍾，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清取沉澱物加入與痰標本等體積的PBS混勻，取上 述濃度的痰處理懸液混勻，後取30 yl於載玻片上塗抹成IX 2cm左右的橢圓形痰膜，自然 乾燥，火焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，製備成陰性痰 塗片，放置於樣品盒中，室溫保存。2. 2. 3、陽性痰塗片的製備方法實施例1抗酸桿菌來源於痰液的製備方法a) 1+痰塗片的製備方法取不同結核病患者的晨痰(上海疾病預防控制中心提供)，放置於無菌痰標本採 集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，加 入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g，30分 鍾，使結核菌集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入lml PBS混勻作為痰懸液，用抗酸染 色顯微鏡鏡檢法檢測其中細菌數量，用PBS稀釋至終濃度為2. 2X104條/ml的痰稀釋液， 取上述痰稀釋液30 yl於載玻片上塗抹成lX2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥，火焰固定。 在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室溫保存。b) 2+痰塗片的製備方法取不同結核病患者的晨痰(上海疾病預防控制中心提供)，放置於無菌痰標本採 集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，120分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，加 入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g，30分 鍾，使結核菌集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入lml PBS混勻作為痰懸液，用抗酸染 色顯微鏡鏡檢法檢測其中細菌數量，用PBS稀釋至終濃度為2. 2X 105條/ml的痰稀釋液， 取上述痰稀釋液30 yl於載玻片上塗抹成lX2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥，火焰固定。 在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室溫保存。c) 3+痰塗片的製備方法取不同結核病患者的晨痰(上海疾病預防控制中心提供)，放置於無菌痰標本採 集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，80分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，加 入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g，30分 鍾，使結核菌集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入lml PBS混勻作為痰懸液，用抗酸染 色顯微鏡鏡檢法檢測其中細菌數量，用PBS稀釋至終濃度為2. 2X 106條/ml的痰稀釋液， 取上述痰稀釋液30 yl於載玻片上塗抹成lX2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥，火焰固定。 在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室溫保存。d) 4+痰塗片的製備方法取不同結核病患者的晨痰(上海疾病預防控制中心提供)，放置於無菌痰標本採 集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，加 入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8 PBS稀釋至50ml，離心3000g，30分 鍾，使結核菌集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入lml PBS混勻作為痰懸液，用抗酸染色顯微鏡鏡檢法檢測其中細菌數量，用PBS稀釋至終濃度為2. 3X 106條/ml的痰稀釋液， 取上述痰稀釋液30 yl於載玻片上塗抹成lX2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥，火焰固定。 在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室溫保存。實施例2抗酸桿菌來源於培養細菌菌落的製備方法1、卡介苗菌懸液的製備取上海生物製品研究所提供的卡介苗的初生長兩周的細菌菌落放入玻璃磨菌器 底部，其中加入100 ill含0.5%吐溫-80的PBS，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘)；自 然冷卻後，插入磨菌棒捻動使呈乳酪樣，以含0. 5%吐溫-80的生理鹽水磨菌稀釋，與標準 麥氏比濁管(MacFarland No. 1)比濁，配成lmg/ml的菌懸液。2、陽性痰塗片的製備a) 1+痰塗片的製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提供)，放置於無菌痰 標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，70分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管 內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g， 30分鐘，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作 為痰懸液；用上述痰懸液將lmg/ml的菌懸液稀釋至終濃度為0. 8X 104條/ml的含菌痰稀 釋液，取上述含菌痰稀釋液30 u 1於載玻片上塗抹成1 X 2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥， 火焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室 溫保存。b) 2+痰塗片的製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提供)，放置於無菌痰 標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管 內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g， 30分鐘，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作 為痰懸液；用上述痰懸液將lmg/ml的菌懸液稀釋至終濃度為0. 3X 105條/ml的含菌痰稀 釋液，取上述含菌痰稀釋液30 u 1於載玻片上塗抹成1 X 2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥， 火焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室 溫保存。c) 3+痰塗片的製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提供)，放置於無菌痰 標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管 內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g， 30分鐘，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作 為痰懸液；用上述痰懸液將lmg/ml的菌懸液稀釋至終濃度為0. 3X 106條/ml的含菌痰稀 釋液，取上述含菌痰稀釋液30 u 1於載玻片上塗抹成1 X 2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥， 火焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室 溫保存。d) 4+痰塗片的製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提供)，放置於無菌痰標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管 內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g， 30分鐘，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作 為痰懸液；用上述痰懸液將lmg/ml的菌懸液稀釋至終濃度為2. 25X 106條/ml的含菌痰稀 釋液，取上述含菌痰稀釋液30 u 1於載玻片上塗抹成1 X 2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥， 火焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室 溫保存。實施例3抗酸桿菌來源於培養細菌菌落的製備方法1、卡介苗菌懸液的製備取卡介苗的初生長兩周的細菌菌落(上海生物製品研究所提供)放入2ml離心管 內，其中加入4-5顆玻璃珠和lOOiil含0. 5%吐溫-80的PBS，經細菌滅活處理(80°C水浴， 120分鐘)；自然冷卻後，振蕩研磨細菌，使菌液呈乳酪樣，以含0. 5%吐溫-80的PBS稀釋 後，與標準麥氏比濁管(MacFarland No. 1)比濁，配成lmg/ml的菌懸液。2、陽性痰塗片的製備a) 1+痰塗片的製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提供)，放置於無菌痰 標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，70分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管 內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g， 30分鐘，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作 為痰懸液；用上述痰懸液將lmg/ml的菌懸液稀釋至終濃度為2X 104條/ml的含菌痰稀釋 液，取上述含菌痰稀釋液30 u 1於載玻片上塗抹成1 X 2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥，火 焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室溫 保存。b) 2+痰塗片的製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提供)，放置於無菌痰 標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管 內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g， 30分鐘，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作 為痰懸液；用上述痰懸液將lmg/ml的菌懸液稀釋至終濃度為2X 105條/ml的含菌痰稀釋 液，取上述含菌痰稀釋液30 u 1於載玻片上塗抹成1 X 2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥，火 焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室溫 保存。c) 3+痰塗片的製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提供)，放置於無菌痰 標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°C水浴，30分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管 內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g， 30分鐘，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作 為痰懸液；用上述痰懸液將lmg/ml的菌懸液稀釋至終濃度為2X 106條/ml的含菌痰稀釋 液，取上述含菌痰稀釋液30 u 1於載玻片上塗抹成1 X 2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥，火焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室溫 保存。d) 4+痰塗片的製備方法取不同非結核病患者的晨痰(上海國際旅行衛生保健中心提供)，放置於無菌痰 標本採集容器中，經細菌滅活處理(80°c水浴，30分鐘)；自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管 內，加入2倍痰液體積的NaOH-NALC混勻20分鐘後，用PH6. 8PBS稀釋至50ml，離心3000g， 30分鐘，使痰中固體物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作 為痰懸液；用上述痰懸液將lmg/ml的菌懸液稀釋至終濃度為2. 3X 106條/ml的含菌痰稀 釋液，取上述含菌痰稀釋液30 u 1於載玻片上塗抹成1 X 2cm左右的橢圓形痰膜，自然乾燥， 火焰固定。在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，放置於樣品盒中，室 溫保存。2. 3檢測結果評價方法目前，實驗室檢測痰液中抗酸桿菌都採用抗酸染色法，鏡檢時發現抗酸桿菌的數 量是非常重要的參考依據。痰塗片鏡檢結果，不僅是對疾病的定性，也是對疾病嚴重程度的 半定量。首先判斷樣品中抗酸桿菌存在與否，如果存在，報告顯微鏡下平均每個視野中的抗 酸桿菌量，結果用「陰性」、「具體細菌數/300視野」、「1+」、「2+」、「3+」和「4+」表示(結果 報告依據參見GB 15987-1995傳染性肺結核診斷標準及處理原則)。檢測樣品的預期結果在樣品製備時予以確定，各實驗室返回檢測結果後，確定實 驗室每個樣品的檢測結果與預期結果的符合情況。如果檢測結果與預期結果符合，則該樣 品檢測結果為10分；如果檢測結果與預期結果不符合，我們會對檢測樣品進行覆核以確定 檢測結果的準確性，並給予評分；每個樣品最高得分為10分，每個實驗室總計得80分及以 上為合格，表示該實驗室檢測項目能力評價為合格；實驗室總計不到80分為不合格，表示 該實驗室檢測項目能力評價為不合格；「1+」以上的陽性痰塗片出現假陰性結果，判定為不 合格。檢測結果評價依據參見(1)GB 15987-1995《傳染性肺結核診斷標準及處理原則》; (2)《痰塗片鏡檢質量保證手冊》2004，中國疾病預防控制中心編制。2. 4樣品的均勻性檢驗為了保證每組中的樣品間無顯著性差異，確保能力驗證活動中出現的不滿意結果 不歸咎於樣品之間的變異，保證能力驗證計劃的公平和科學，對製備好的樣品進行均勻性 檢驗。從每組150個檢測樣品中隨機抽取10個樣品，用抗酸染色法對樣品進行抗酸染色， 由兩個專業實驗室分別對各樣品進行顯微鏡檢測，記數並報告1-300個視野下觀察到的抗 酸桿菌的數量。檢測結果為根據每個樣品抗酸桿菌量判定得到的分級值(陰性、1+、2+、3+、 4+)。將檢測結果與預期結果進行比較。陰性樣品組(見圖5) :10個抽樣樣品結果均為陰 性，則說明本組樣本均勻；1+樣品組(見圖4) :10個抽樣樣品結果均為1+或2+或1-8條 /300視野，則說明本組樣本均勻；2+樣品組(見圖3) :10個抽樣樣品結果均為1+或2+或 3+，則說明本組樣本均勻；3+樣品組(見圖2) :10個抽樣樣品結果均為2+或3+或4+，則說 明本組樣本均勻；4+樣品組(見圖1) :10個抽樣樣品結果均為3+或4+，則說明本組樣本均 勻。「1+」以上的痰塗片出現陰性結果，說明被抽樣的總體不均勻。本次能力驗證活動設計了 1-10組樣品，每組150張痰塗片。從各組中隨機抽取10
13張塗片進行檢測，結果與預期結果相符合。故本次製備的樣品均勻性符合要求。2. 5樣品的穩定性檢驗為了檢驗樣品在運輸、貯藏過程中的穩定性及包裝、運輸方式的可靠性，保證樣品 從製備到檢測整個過程中的穩定性符合要求，對所製備的樣品進行能力驗證樣品發放前的 穩定性檢驗和能力驗證實施全過程中的穩定性檢驗。2. 5. 1未染色痰塗片的穩定性檢驗隨機抽取需要數量的痰塗片，按照上述包裝 方式包裝後快遞到不同地區實驗室(國內或國外)，室溫保存至計劃返回日期，以快遞方式 返回。用抗酸染色法對返回痰塗片進行抗酸桿菌檢測。將檢測的結果與預期結果進行比較， 陰性痰塗片檢測結果均為陰性，則說明痰塗片穩定性合格；1+痰塗片檢測結果為1+或 2+或1-8條/300視野，則說明痰塗片穩定性合格；2+痰塗片檢測結果為1+或2+或3+， 說明痰塗片穩定性合格；3+痰塗片檢測結果為2+或3+或4+，說明痰塗片穩定性合格；4+ 痰塗片檢測結果為3+或4+，說明痰塗片穩定性合格；「1+」以上的痰塗片出現陰性結果， 說明痰塗片不穩定；若結果有差異，說明痰塗片不穩定，需查找痰塗片不穩定的原因，重新 製備痰塗片或改變貯藏、運輸方式。2. 5. 2染色痰塗片的穩定性檢驗隨機抽取需要數量的痰塗片，用抗酸染色法進 行痰塗片抗酸染色後快遞到不同地區實驗室(國內或國外)，室溫保存至計劃返回日期， 以快遞方式返回。用顯微鏡法查找抗酸桿菌，將檢測的結果與預期結果進行比較，陰性痰 塗片檢測結果為陰性，說明痰塗片穩定性合格；1+痰塗片檢測結果為1+或2+或1-8條 /300視野，說明痰塗片穩定性合格；2+痰塗片檢測結果為1+或2+或3+，說明痰塗片穩定 性合格；3+痰塗片檢測結果為2+或3+或4+，說明痰塗片穩定性合格；4+痰塗片檢測結 果為3+或4+，說明痰塗片穩定性合格；「1+」以上的痰塗片出現陰性結果，說明痰塗片不穩 定；若結果有差異，說明痰塗片不穩定，需查找痰塗片不穩定的原因，重新製備痰塗片或改 變貯藏、運輸方式。本次能力驗證活動選取的兩地區往返的未染色樣品及染色樣品的檢測結果與預 期結果相符合，可以認為樣品是穩定的，符合本次能力驗證計劃的要求。2. 6樣品的標識計算機編程設計一組含1-2000數字且無重複數字的隨機序列號。按照150個數 字為一組，共選了 10組數字，將每組中的數字對應於每組樣品，使每個樣品獲得唯一的數 字標識。本次能力驗證樣品的數字標識中第1到4為表示上海地區、第5、6位表示製備時 間、從第七位數字開始為樣品序列號。2. 7樣品的包裝與發送考慮到運輸安全和樣品的穩定性，檢測樣品均採用三層包裝第一層將樣品(痰 塗片)放置在專用的載玻片盒中，第二層在載玻片盒外用抗震隔膜包裹，第三層是外用防 水紙箱包裝。隨樣品一同發送的還有能力驗證活動說明、樣品接收狀態確認表和檢測結果 報告表。樣品發送前，由專人審核樣品狀態是否完好，記錄實驗室代碼和對應的樣品號。參 加實驗室收到樣品後，填寫樣品接收狀態確認表，籤字後傳真或郵寄回本次能力驗證聯繫 人，以確認檢測樣品的狀態完好。如果出現樣品破損等影響檢測的情況，要求儘快聯繫本次能力驗證聯繫人，以便補發檢測樣品。2. 8樣品的回收為了準確、公正地評價每個參加實驗室的檢測能力，保證能力驗證結果的可靠性， 要求將檢測樣品在檢測完畢後隨結果報告單一同寄回。參加實驗室返回的檢測樣品通過與預期結果比對和專家審核方式進行結果評估， 一方面可以確保結果的準確和公正，另一方面可以發現各參加實驗室檢測結果存在的問題 和部分操作的規範程度。2. 9檢測結果統計方法痰塗片抗酸染色法查找抗酸桿菌的檢測結果的判定採取定性結合半定量的方式。 檢測痰塗片的預期結果在其製備時予以確定，受測實驗室或個人報告檢測結果後，確定實 驗室每個痰塗片的檢測結果與預期結果的符合情況。陰性痰塗片檢測結果為陰性，說明檢測結果與預期結果符合；1+痰塗片檢測結 果為1+或2+或1-8條/300視野，說明檢測結果與預期結果符合；2+痰塗片檢測結果為1+ 或2+或3+，說明檢測結果與預期結果符合；3+痰塗片檢測結果為2+或3+或4+，說明檢 測結果與預期結果符合；4+痰塗片檢測結果為3+或4+，說明檢測結果與預期結果符合； 「1+」以上的痰塗片出現陰性結果，說明檢測結果與預期結果不符合。檢測結果評價依據參見(1)GB 15987-1995《傳染性肺結核診斷標準及處理原則》; (2)《痰塗片鏡檢質量保證手冊》2004，中國疾病預防控制中心編制。3實驗室檢測結果及其評價3.1檢測結果匯總本次能力驗證對檢測結果的判定採取定性結合半定量的方式。每個參加實驗室共 收到10個檢測樣品。參加實驗室對10個樣品的判定結果應該與預期結果或實際覆核的結 果相符，並且綜合得分80分及以上時，該項目的檢測能力判定為合格，否則判定為不合格； 「1+」以上的陽性痰塗片出現假陰性，判定為不合格。本次能力驗證共有43家實驗室報告了 樣品的檢測結果。3. 2結果評價在回報結果的43家實驗室中，有30家實驗室獲得100分，10家實驗室獲得95分， 1家實驗室獲得90分，2家實驗室獲得85分。43家參加實驗室評分均在80分以上，全部合 格。共有16個檢測結果出現低假陽性(4個)和量化誤差(12個)的不符合情況，涉及13
家實驗室。本次能力驗證共發送440個檢測樣品，回報了 430個樣品的檢測結果，有414個樣 品檢測結果正確，佔回報樣品數的96. 3%。4技術分析和建議4. 1檢測過程的質量控制塗片染色法檢測痰液中抗酸桿菌能力驗證對檢測過程的質量控制要求高。環境， 尤其是水質和空氣中灰塵會引起樣品的汙染，檢測中如使用的顯微鏡維護不當會影響檢測 結果。所以，實驗室一定要注意檢測用水和環境清潔，嚴格防止操作汙染，這是保證檢測結 果正確的基礎。4. 2檢測方法與試劑
本次能力驗證項目的檢測方法涉及痰塗片抗酸染色法和顯微鏡檢測技術，抗酸染 色法與使用的抗酸染色試劑的質量密切相關。在參加的43家實驗室中，有38家實驗室使 用了同一品牌的抗酸染色試劑，有2家使用不同品牌的抗酸染色試劑，有3家實驗室未報所 用檢測試劑的品牌。此次能力驗證活動中沒有發現試劑對檢測結果的顯著影響。5 總結本次能力驗證項目中有多個創新點。首先，痰塗片抗酸染色查找抗酸桿菌檢測項 目是結核病實驗室檢測項目中最基礎、應用最廣泛的一個項目，但類似本項目這樣由多個 不同細菌含量、相同細菌含量樣品重複多次的檢測樣品組合而進行的實驗室能力驗證項目 在國內還是首次，而且醫學實驗室的微生物專業形態學檢測項目的能力驗證實施在國內也 是首次開展。其次，在能力驗證實施中，我們採用了將檢測樣品回收的結果處理方式，以排除樣 品原因造成的結果不符合，盡最大可能保證了結果的準確性和計劃實施的公平性，而且可 操作性強。另外，本能力驗證中樣品均勻性檢驗和穩定性檢驗的方法也是首次在醫學形態 學的能力驗證項目上使用，從統計結果來看，均滿足了對檢測樣品進行均勻性和穩定性評 估的作用。
1權利要求
一種用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微鏡檢查的痰塗片，其特徵在於，其包括陰性、1+、2+、3+、4+共五種抗酸桿菌含量的痰塗片，該陰性痰塗片的抗酸桿菌含量為0條/300個視野；該1+痰塗片的抗酸桿菌含量為3-9條抗酸桿菌/100個視野；該2+痰塗片的抗酸桿菌含量為1-9條抗酸桿菌/10個視野；該3+痰塗片的抗酸桿菌含量為1-9條抗酸桿菌/個視野；該4+痰塗片的抗酸桿菌含量為＞9條抗酸桿菌/個視野；所述的抗酸桿菌來源於痰液或者培養細菌菌落。
2.一種如權利要求1所述的痰塗片的製備方法，其特徵在於，所述痰塗片含有的抗酸 桿菌來源於痰液，該方法包括如下步驟1)取不同結核病患者的晨痰，放置於無菌痰標本採集容器中，細菌滅活處理；2)自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，使痰液液化並用PBS稀釋後，離心，使細菌集 中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入PBS混勻作為痰懸液，用痰塗片抗酸染色顯微鏡鏡 檢法檢測細菌數量作為初始等級濃度，然後根據抗酸桿菌目的等級濃度計算稀釋倍數，並 用PBS稀釋至目的等級濃度的痰稀釋液；3)取上述痰稀釋液於載玻片上塗抹成橢圓形痰膜，自然乾燥，火焰固定；在載玻片一 端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，室溫保存。
3.如權利要求2所述的痰塗片的製備方法，其特徵在於，在步驟2)中，所述痰稀釋 液中抗酸桿菌的目的等級濃度為0條/ml，0. 8-2. 2 X IO4條/ml，0. 3-2. 2 X IO5條/ml， 0. 3-2. 2X106 條/ml，或者> 2. 2X IO6 條/ml。
4.如權利要求2所述的痰塗片的製備方法，其特徵在於，在步驟3)完成後，還包括如下 包裝步驟痰塗片採用三層包裝，第一層將痰塗片放置在專用的載玻片盒中，第二層在載玻 片盒外用抗震隔膜包裹，第三層是外用防水紙箱包裝。
5.如權利要求2所述的痰塗片的製備方法，其特徵在於，步驟3)中，所述樣品編號是計 算機編程設計一組無重複數字的隨機序列號，將該數字對應於每個痰塗片，使每個樣品獲 得唯一的數字標識，該數字標識中的數字表示製備地區、製備時間及痰塗片序列號。
6.一種如權利要求1所述的痰塗片的製備方法，其特徵在於，所述痰塗片含有的抗酸 桿菌來源於培養細菌菌落，該方法包括如下步驟1)卡介苗菌懸液的製備取卡介苗的初生長兩周的細菌菌落放入玻璃磨菌器底部或 具有玻璃珠的離心管內，其中加入含0. 5%吐溫-80的PBS，經細菌滅活處理；自然冷卻後， 充分攪拌振蕩使菌液呈乳酪樣，以含0. 5%吐溫-80的生理鹽水或者PBS磨菌並稀釋，與標 準麥氏比濁管比濁，配成lmg/ml的菌懸液；2)取不同非結核病患者的晨痰，放置於無菌痰標本採集容器中，經細菌滅活處理；3)自然冷卻後，盛於無菌痰液處理管內，使痰液液化並用PBS稀釋，離心，使痰中固體 物集中於試管底部，棄上清液，沉澱物中加入等痰液體積的PBS混勻作為痰懸液；4)用痰塗片抗酸染色顯微鏡鏡檢法檢測細菌數量作為初始等級濃度，然後根據抗酸杆 菌目的等級濃度計算稀釋倍數，用步驟3)製成的痰懸液將步驟1)製成的菌懸液稀釋至目 的等級濃度的含菌痰稀釋液；取上述含菌痰稀釋液於載玻片上塗抹成橢圓形痰膜，自然幹 燥，火焰固定；在載玻片一端1/3處粘貼防腐防脫落標籤並註明樣品編號，室溫保存。
7.如權利要求6所述的痰塗片的製備方法，其特徵在於，在步驟4)中，所述含菌痰稀 釋液中抗酸桿菌的目的等級濃度為0條/ml，0. 8-2. 2X IO4條/ml，0. 3-2. 2X IO5條/ml，；0.3-2. 2X106 條/ml，或者> 2. 2X IO6 條/ml。
8.如權利要求6所述的痰塗片的製備方法，其特徵在於，步驟4)完成後，還包括如下包 裝步驟痰塗片採用三層包裝，第一層將痰塗片放置在專用的載玻片盒中，第二層在載玻片 盒外用抗震隔膜包裹，第三層是外用防水紙箱包裝。
9.如權利要求6所述的痰塗片的製備方法，其特徵在於，步驟4)中，所述樣品編號是計 算機編程設計一組無重複數字的隨機序列號，將該數字對應於每個痰塗片，使每個樣品獲 得唯一的數字標識，該數字標識中的數字表示製備地區、製備時間及痰塗片序列號。
10.一種如權利要求1所述的痰塗片的均勻性檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟1)從相同等級濃度的痰塗片中隨機抽取需要數量的痰塗片，用抗酸染色法對抽樣的痰 塗片進行抗酸染色，並對抽取的各痰塗片進行顯微鏡檢測，記數並報告1-300個視野下觀 察到的抗酸桿菌的數量；2)檢測結果為根據每個痰塗片中的抗酸桿菌量判定得到的分級值陰性、1+、2+、3+、 4+ ；將檢測結果與預期結果進行比較；陰性痰塗片抽樣痰塗片結果均為陰性，則說明被抽 樣的總體均勻；1+痰塗片抽樣痰塗片結果均為1+或2+或1-8條/300視野，則說明被抽 樣的總體均勻；2+痰塗片抽樣痰塗片結果均為1+或2+或3+，則說明被抽樣的總體均勻； 3+痰塗片抽樣痰塗片結果均為2+或3+或4+，則說明被抽樣的總體均勻；4+痰塗片抽樣 痰塗片結果均為3+或4+，則說明被抽樣的總體均勻；「1+」以上的痰塗片出現陰性結果，說 明被抽樣的總體不均勻。
11.一種如權利要求1所述的痰塗片的穩定性檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟1)隨機抽取需要數量的痰塗片，包裝後快遞到不同地區實驗室，室溫保存至計劃返回 日期，以快遞方式返回，用抗酸染色法對返回痰塗片進行抗酸染色後，用顯微鏡法查找抗酸 桿菌；或者隨機抽取需要數量的痰塗片，用抗酸染色法進行痰塗片抗酸染色後快遞到不同 地區實驗室，室溫保存至計劃返回日期，以快遞方式返回，用顯微鏡法查找抗酸桿菌；2)將檢測的結果與預期結果進行比較，陰性痰塗片檢測結果均為陰性，則說明痰塗 片穩定性合格；1+痰塗片檢測結果為1+或2+或1-8條/300視野，則說明痰塗片穩定性 合格；2+痰塗片檢測結果為1+或2+或3+，說明痰塗片穩定性合格；3+痰塗片檢測結果 為2+或3+或4+，說明痰塗片穩定性合格；4+痰塗片檢測結果為3+或4+，說明痰塗片穩 定性合格；「1+」以上的痰塗片出現陰性結果，說明痰塗片不穩定；若結果有差異，說明痰塗 片不穩定，需查找痰塗片不穩定的原因，重新製備痰塗片或改變貯藏、運輸方式。
12.—種如權利要求1所述的痰塗片在能力驗證中的應用。
13.—種如權利要求1所述的痰塗片在實驗室室間質量評估和室內質量控制中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用於能力驗證活動中抗酸桿菌顯微鏡檢查的痰塗片，其包括陰性、1+、2+、3+、4+共五種抗酸桿菌含量的痰塗片，該陰性痰塗片的抗酸桿菌含量為0條/300個視野；該1+痰塗片的抗酸桿菌含量為3-9條抗酸桿菌/100個視野；該2+痰塗片的抗酸桿菌含量為1-9條抗酸桿菌/10個視野；該3+痰塗片的抗酸桿菌含量為1-9條抗酸桿菌/個視野；該4+痰塗片的抗酸桿菌含量為＞9條抗酸桿菌/個視野；所述抗酸桿菌來源於痰液或者培養細菌菌落。此外，本發明還公開了上述痰塗片的製備方法和用途。經驗證，本發明痰塗片的均勻性和穩定性較高，採用這種痰塗片可以應用於結核病檢測能力驗證活動或實驗室內部和外部質量控制。
文檔編號C12Q1/04GK101852694SQ201010142820
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月9日 優先權日2010年4月9日
發明者葉魏, 張曉航, 方筠, 王健, 章琪, 閻俊, 韓曉輝 申請人:上海國際旅行衛生保健中心