一種可降解聚合物磁性納米粒子及其製備方法與流程

2023-06-14 23:53:36

本發明屬於可降解聚合物磁性納米粒子及其製備技術領域，具體涉及一種在磁性納米粒子外殼包裹可降解聚合物材料作為藥物載體及其製備方法，特別涉及一種在磁性納米粒子外殼包裹可降解聚合物材料作為具有靶向功能的藥物載體及其製備方法。

背景技術：

近年來，基於fe3o4的磁性納米粒子具有超順磁性、細胞毒性小等優點，在藥物傳遞(治療)以及磁共振成像(醫學診斷)一體化研究方面得到了廣泛的應用。為提高磁性納米粒子的穩定性，本領域技術人員通常採用的技術解決手段是在磁性納米粒子包裹一層聚合物材料外殼來製備聚合物磁性納米粒子。該外殼不僅可保護fe3o4內核不受外部化學環境的氧化或酸蝕等影響；同時也防止了磁性納米粒子發生聚集。然而，隨著對聚合物磁性納米粒子的深入研究，發現其在實現診斷治療過程中還存在一些制約磁性納米粒子大規模臨床應用的缺陷：

(1)聚合物外殼無法降解。用聚合物材料作為外殼包裹磁性納米粒子來形成聚合物磁性納米粒子的技術，雖然具有方法簡單，納米粒子結構清楚等優點，但其形成的聚合物外殼一般無降解功能，很容易在人體中發生聚集，從而引起對肝、腎等器官的毒性(fangc.,kievitf.m.,veiseho.,stephenz.r.,wangt.,leed.,ellenbogenr.g.,zhangm.fabricationofmagneticnanoparticleswithcontrollabledrugloadingandreleasethroughasimpleassemblyapproach.journalofcontrolledrelease.2012,162:233–241)。

(2)納米粒子穩定性不足。傳統技術一般是利用聚合物材料與磁性納米粒子之間的非共價鍵作用來形成聚合物磁性納米粒子。這一技術雖然簡便，但是由於形成的非共價鍵作用本身不夠穩定，使得所製備的聚合物磁性納米粒子會在人體體液稀釋作用下，在溫度、離子濃度、ph值等影響因素下易崩解，使聚合物外殼與磁性納米粒子容易分離，穩定性很差，不能實現其在人體內長期循環的要求。另一方面，傳統技術中一般採取透析法，利用聚合物的親疏水性、氫鍵等弱作用力來包裹藥物，實現對藥物分子的傳遞。由於這種技術手段所形成的藥物與聚合物之間的相互作用力較弱，藥物的負載穩定性也較差，常常會在正常組織和細胞處將較多的藥物提前釋放，故此類磁性納米粒子普遍存在對正常組織細胞的毒副作用(chenj.,shim.,liup.,koa.,zhongw.,liaow.,xingm.,m.q.reduciblepolyamidoamine-magneticironoxideself-assemblednanoparticlesfordoxorubicindelivery.biomaterials,2014,35:1240–1248)。

(3)無靶向功能，使載藥後聚合物磁性納米粒子不能進行準確釋藥。由於傳統上一般是採用聚乙二醇、聚(n-異丙基丙烯醯胺)等親水性聚合物作為聚合物磁性納米粒子的外殼，從而保持其在溶液中的穩定性。雖然該技術具有製備方法簡單的優點，但其製備的聚合物磁性納米粒子無靶向功能，不能將聚合物磁性納米粒子有效傳遞進入靶向細胞，釋藥殺傷腫瘤細胞。因此，載藥的聚合物磁性納米粒子在正常組織和細胞處易發生聚集，存在毒副作用的風險(尚樂,周慶翰.多功能磁性納米藥物載體的製備及表徵.西南民族大學學報(自然科學版),2016,42(5):531-537)。

(4)造影效果不佳。傳統技術製備的聚合物磁性納米粒子，因聚合物材料與磁性納米粒子之間的相互作用力較弱(如疏水鍵、氫鍵等非共價鍵力)，其包裹的磁性納米粒子含量偏少，導致橫向弛豫性能(r2)偏低，造影效果不佳，影響了聚合物磁性納米粒子作為磁性造影的臨床應用(liuy.,yangk.,chengl.,zhuj.,max.,xuh.,liy.,guol.,guh.,liuz.pegylatedfept@fe2o3core-shellmagneticnanoparticles:potentialtheranosticapplicationsandinvivotoxicitystudies.nanomedicine:nanotechnology,biology,andmedicine,2013,9:1077–1088)。

技術實現要素：

本發明的目的是針對上述現有聚合物磁性納米粒子存在的問題，提供一種可降解聚合物磁性納米粒子，即其聚合物外殼可降解，且與磁性納米粒子通過配位鍵結合穩定，藥物的負載穩定性好，具有靶向功能以及造影效果好的特點。

本發明另一目的是提供上述可降解聚合物磁性納米粒子的製備方法。

本發明提供的一種可降解聚合物磁性納米粒子，該納米粒子是以含雙乙烯基二硫鍵的化合物作為偶聯劑，將多巴胺、抗腫瘤藥物基團、靶向功能基團通過共價鍵連接的方式與該偶聯劑主鏈相連，並聚合製成可降解外殼，再通過可降解外殼上的多巴胺與四氧化三鐵納米粒子表面進行配位鍵結合，將可降解外殼化學包裹在四氧化三鐵納米粒子外表面上，該可降解聚合物磁性納米粒子最高載藥量為857μg抗腫瘤藥物每毫克鐵，且在加入穀胱甘肽(gsh)的條件下藥物累計釋放量最高為79.1％。

上述含雙乙烯基二硫鍵的化合物為n,n'-雙(丙稀醯)胱胺(bacy)。

上述抗腫瘤藥物基團為鹽酸阿黴素(dox)基團。

上述靶向功能基團為葉酸聚乙二醇(fa-peg-nh2)基團。

本發明提供的製備上述可降解聚合物磁性納米粒子方法的工藝步驟和條件如下：

(1)參照現有技術製備得四氧化三鐵納米粒子；

(2)按質量份數計，將含雙乙烯基二硫鍵的偶聯劑5～15份，鹽酸多巴胺(da)2～10份，抗腫瘤藥物2～10份，氨基聚乙二醇(mpeg-nh2)10～50份，靶向修飾劑2～10份混合均勻，同時將三乙胺溶解於溶劑i中配置成體積濃度為0.5～1％的三乙胺溶液，然後再將三乙胺溶液滴加入上述混合物中，並在氮氣保護下於20～50℃反應20～48小時，所得粗產物用溶劑i洗滌沉澱，沉澱物溶解於去離子水中透析，冷凍乾燥得到的暗紅色固體即為可降解聚合物；

(3)按質量份數計，將步驟(2)所得可降解聚合物10～20份溶解在溶劑ii中配置成質量體積濃度為0.05～0.10g/l的溶液，並加入2～10份步驟(1)所得四氧化三鐵納米粒子混合，然後將混合物溶解於四氫呋喃形成以可降解聚合物質量計濃度為0.6～1.4mg/ml的溶液，於氮氣保護下，室溫避光攪拌反應24～48小時，離心分離混合溶液得到粗產品，利用去離子水對粗產品進行洗滌、透析，冷凍乾燥後得到可降解聚合物磁性納米粒子；

其中，所述的溶劑i為n,n-二甲基甲醯胺(dmf)、四氫呋喃(thf)、二甲基亞碸(dmso)、乙酸乙酯、二氯甲烷或乙醚中的任一種；

其中，所述的溶劑ii為n,n-二甲基甲醯胺(dmf)、n,n-二甲基乙醯胺或二甲基亞碸(dmso)中的任一種。

上述步驟(1)中所述參照現有技術製備得四氧化三鐵納米粒子具體是參照文獻(陳亭汝，孫瑾.fe3o4磁性納米粒子的共沉澱法製備研究[j].應用化工，2009，38(2):227-228.)中所記載的方法製備的，為了適應本發明，調整其工藝參數如下：

將fecl3·6h2o和feso4按照摩爾比為1:(1～10)混合，並溶解於去離子水中配製成0.5～2g/ml的溶液，然後在氮氣氣氛且溫度為50～90℃下，邊攪拌邊加入以去離子水體積計2～10％的鹼液，反應30～60min，再加入以去離子水體積計2～6％的油酸，繼續反應3～6h，所得粗產品經磁鐵收集後，再用去離子水洗滌、離心分離、乾燥即得四氧化三鐵納米粒子。其中所用鹼液為市售濃度為25～28％的濃氨水或配製的濃度為10％的氫氧化鈉溶液。

上述步驟(2)中所述的含雙乙烯基二硫鍵的偶聯劑為n,n'-雙(丙稀醯)胱胺(bacy)，其是參考文獻(pany.j.,cheny.y.,wangd.r.,weic.,guoj.,lud.r.,chuc.c.,wangc.c.redox/phdualstimuli-responsivebiodegradablenanohydrogelswithvaryingresponsestodithiothreitolandglutathioneforcontrolleddrugrelease.biomaterials,2012,33:6570–6579)所公開的方法製備的。

上述步驟(2)中所述的抗腫瘤藥物為鹽酸阿黴素(dox)。

上述步驟(2)中所述的靶向修飾劑為葉酸聚乙二醇(fa-peg-nh2)。

本發明具有以下有益效果：

(1)由於本發明製備工藝中所採用含雙乙烯基二硫鍵偶聯劑是由胱胺二鹽酸鹽與丙烯醯氯進行縮合反應而製得，其不僅可作為直鏈式偶聯劑，在磁性粒子聚合物外殼上形成主鏈，並與dox、葉酸聚乙二醇進行連結，而且因其上含有二硫鍵結構，還可在穀胱甘肽(gsh)作用下被還原成-sh基，因而可使得其製成的聚合物外殼既能同時承載藥物和靶向修飾劑，又具有還原響應性，解決了傳統聚合物磁性納米粒子載藥體在人體內難以降解的問題。

(2)由於本發明在製備可降解聚合物外殼的技術方案中，其合成原理是採用的麥可(michael)加成反應技術，即是直接將多巴胺與聚合物主鏈進行連結，而連結的多巴胺又能夠與四氧化三鐵納米粒子表面通過配位鍵進行牢固結合，因而使得聚合物外殼與磁性納米粒子的聯結具有良好的穩定性，解決了傳統聚合物磁性納米粒子在人體體液稀釋、溫度、離子濃度、ph值等影響因素下容易崩解、診斷效率低的問題。

(3)由於本發明能夠通過麥可加成反應技術，將藥物鹽酸阿黴素(dox)與聚合物主鏈通過共價鍵進行連結，因而使得藥物負載穩定性較高，不僅在正常生理條件下聚合物外殼負載的藥物不釋放，且當聚合物磁性納米粒子進入細胞後就可在穀胱甘肽(gsh)作用下降解，快速釋放鹽酸阿黴素(dox)，殺傷腫瘤細胞，解決了傳統聚合物磁性納米粒子載藥穩定性差、提前釋藥的問題。

(4)由於本發明通過麥可加成反應技術還能將葉酸聚乙二醇與聚合物主鏈進行連結，而葉酸基團可與腫瘤細胞表面的葉酸受體結合，因而使得聚合物磁性納米粒子能夠有效傳遞進入靶向腫瘤細胞，解決了現有技術中聚合物磁性納米粒子無靶向功能，易在正常組織和細胞處發生聚集，存在毒副作用的問題。

(5)由於本發明製備方法能將可降解聚合物與四氧化三鐵納米粒子二者間利用配體交換反應技術製備得到可降解聚合物磁性納米粒子，這不僅使四氧化三鐵納米粒子可在聚合物外殼包裹作用下形成磁性粒子簇，進而發生磁耦合現象，因而可有效提高其作為磁共振成像造影劑的橫向弛豫性能(r2)，解決了傳統聚合物磁性納米粒子磁共振成像造影效果不佳的問題。

(6)由本發明提供方法製備所得的聚合物磁性納米粒子不僅載藥量可達857μgdox每毫克鐵，優於同類產品，且在gsh條件下藥物累計釋放量最高可達79.1％，也高於同類產品。

(7)本發明提供的製備方法簡單，條件溫和，可控性強，易於操作，便於推廣應用。

附圖說明

圖1是用胱胺二鹽酸鹽和丙烯醯氯製備得到的含雙乙烯基二硫鍵偶聯劑的核磁氫譜圖。其中，δ(ppm)：6.6(c：醯胺鍵上的氫)，δ(ppm)：6.2(b：雙鍵中靠近羰基的碳上的氫)，δ(ppm)：5.6和6.4(a：雙鍵中遠離羰基的碳上的氫)，δ(ppm)：2.9(靠近二硫鍵亞甲基上的氫)，δ(ppm)：3.6(靠近醯胺亞甲基上氫)。結果表明所製備的偶聯劑與預期一致。

圖2是用鹽酸多巴胺，鹽酸阿黴素，偶聯劑，甲氧基聚乙二醇氨基和葉酸聚乙二醇氨基製備得到的可降解聚合物的核磁氫譜圖。其中，δ(ppm)：8.5-8.8(多巴胺上酚羥基氫)，δ(ppm)：8.2(多巴胺上氨基氫)，δ(ppm)：7-7.8(葉酸苯環上的氫)，δ(ppm)：6.3-6.6(b、c：多巴胺苯環上的氫)，δ(ppm)：5.4(阿黴素上酚羥基氫)，δ(ppm)：4.0(阿黴素上甲氧基上的氫)δ(ppm)：3.5(聚乙二醇上的氫)，δ(ppm)：3.3(多巴胺上氨基相鄰碳氫)，δ(ppm)：2.7(偶聯劑二硫鍵旁碳上的氫)。結果表明所製備的可降解聚合物與預期一致。

圖3是含雙乙烯基二硫鍵的偶聯劑、四氧化三鐵納米粒子和可降解聚合物磁性納米粒子的紅外光譜譜圖。在可降解聚合物磁性納米粒子的譜圖中1650cm-1附近出現的明顯醯胺鍵-羰基特徵吸收峰，表明已成功製備可降解聚合物磁性納米粒子。在可降解聚合物磁性納米粒子的譜圖中580cm-1附近有明顯的fe-o鍵的特徵吸收峰，結果表明已成功製備可降解聚合物磁性納米粒子。

圖4是可降解聚合物磁性納米粒子在10mm的gsh作用下降解後的粒徑變化圖。由圖可以看出，加入gsh後，其粒徑呈現出先逐漸增大的趨勢，這是因為gsh使聚合物中的二硫鍵斷裂，納米粒子發生溶脹，粒徑增大。結果表明所製備的可降解聚合物磁性納米粒子對gsh具有很好的還原響應性。

圖5為實施例1中可降解聚合物磁性納米粒子在室溫、ph＝7.4條件下，用動態光散射(dls)測得的一周內粒徑變化圖。結果表明，隨著時間的增加，膠束的粒徑沒有明顯變化，說明該納米粒子在室溫下結構穩定。

圖6為可降解聚合物磁性納米粒子在水中的透射電鏡照片，從照片中可見納米粒子呈球形分布，其平均粒徑約120nm左右。結果表明所製備的可降解聚合物磁性納米粒子在水中分散良好，符合本發明中對納米粒子的要求。

圖7為可降解聚合物磁性納米粒子在阿黴素/pbs(ph＝7.4)/gsh環境下的藥物釋放曲線圖。從圖中可見在pbs緩衝液中，載藥的可降解聚合物磁性納米粒子的藥物累計釋放量只有25.4％，加入gsh後藥物累計釋放量最高可達79.1％。結果表明，載藥的可降解聚合物磁性納米粒子在gsh作用下，能夠快速高效釋藥。

具體實施方式

下面給出實施例以對本發明作進一步說明。有必要在此指出的是以下實施例不能理解為對本發明保護範圍的限制，如果該領域的技術熟練人員根據上述本發明內容對本發明作出一些非本質的改進和調整，仍屬於本發明保護範圍。

特別說明的是，以下實施例中產品所用表徵與處理方法：(1)紅外表徵所用傅立葉轉換紅外光譜儀(ftir)型號為thermo公司的nicoletis50，測試時用kbr磨成粉，壓片，測試範圍400～4000cm-1。(2)核磁表徵所用核磁共振譜儀(nmr)的型號為bruker-400mhz，測試時以tms為內標，氘代氯仿(cdcl3)或氘代dmso為溶劑。(3)動態光散射(dls)所用儀器型號為nano-zs90，測量時溫度25℃。紫外可見光光度計(uv-vis)：tu1950，測量波長為480nm。透射電子顯微鏡(tem)為日立h-600，加速電壓為75kv，納米粒子濃度2mg/ml。(4)處理和分析數據所用軟體為chemdraw，mestrenova，origin等。(5)以下實施例中所用的濃氨水為濃度25～28％的市售濃氨水，所述氫氧化鈉溶液為配製的濃度為10％的氫氧化鈉溶液。

實施例1

將摩爾比為1:2的fecl3·6h2o和feso4，加入50ml去離子水中配製成0.7g/ml的溶液，通入氮氣並在80℃下進行機械攪拌，然後加入5ml濃氨水反應50min後，再加入油酸1ml，繼續反應6h。所得粗產品經磁鐵收集後，再用去離子水洗滌、離心分離、乾燥即得產品四氧化三鐵納米粒子。

將含雙乙烯基二硫鍵的偶聯劑130mg、da72mg、dox70mg、mpeg-nh2328mg、fa-peg-nh252mg混合均勻，同時將50μl三乙胺溶解於10mldmso配置成體積濃度為0.5％的溶液，再滴加入上述混合物中，並在氮氣保護下於20℃反應20小時。反應結束後粗產品用乙醚洗滌沉澱，沉澱物溶解於去離子水中透析，冷凍乾燥得到暗紅色固體即為可降解聚合物。

將可降解聚合物20mg溶解於200μldmso中，並加入2mg四氧化三鐵納米粒子混合，然後將混合物溶解於20ml的thf中，於氮氣保護下，室溫避光攪拌反應24小時，離心分離得到粗產品，利用去離子水對粗產品進行洗滌、透析、冷凍乾燥後得到可降解聚合物磁性納米粒子。

實施例2

將摩爾比為1:3的fecl3·6h2o和feso4，加入50ml去離子水中配製成0.5g/ml的溶液，通入氮氣並在50℃下進行機械攪拌，然後加入4ml濃氨水反應40min後，再加入油酸1ml，繼續反應4h。所得粗產品經磁鐵收集後，再用去離子水洗滌、離心分離、乾燥即得產品四氧化三鐵納米粒子。

將含雙乙烯基二硫鍵的偶聯劑50mg、da20mg、dox20mg、mpeg-nh2100mg、fa-peg-nh220mg混合均勻，同時將80μl三乙胺溶解於10mldmso配置成體積濃度為0.8％的溶液，再滴加入上述混合物中，並在氮氣保護下於30℃反應48小時。反應結束後粗產品用乙醚洗滌沉澱，沉澱物溶解於去離子水中透析，冷凍乾燥得到暗紅色固體即為可降解聚合物。

將可降解聚合物10mg溶解於200μldmso中，並加入10mg四氧化三鐵納米粒子混合，然後將混合物溶解於14ml的thf中，於氮氣保護下，室溫避光攪拌反應48小時，離心分離得到粗產品，利用去離子水對粗產品進行洗滌、透析、冷凍乾燥後得到可降解聚合物磁性納米粒子。

實施例3

將摩爾比為1:4的fecl3·6h2o和feso4，加入50ml去離子水中配製成1g/ml的溶液，通入氮氣並在90℃下進行機械攪拌，然後加入1ml氫氧化鈉溶液反應30min後，再加入油酸3ml，繼續反應5h。所得粗產品經磁鐵收集後，再用去離子水洗滌、離心分離、乾燥即得產品四氧化三鐵納米粒子。

將含雙乙烯基二硫鍵的偶聯劑150mg、da100mg、dox100mg、mpeg-nh2500mg、fa-peg-nh2100mg混合均勻，同時將90μl三乙胺溶解於10mldmf配置成體積濃度為0.9％的溶液，再滴加入上述混合物中，並在氮氣保護下於50℃反應36小時。反應結束後粗產品用乙醚洗滌沉澱，沉澱物溶解於去離子水中透析，冷凍乾燥得到暗紅色固體即為可降解聚合物。

將可降解聚合物14mg溶解於200μldmf中，並加入5mg四氧化三鐵納米粒子混合，然後將混合物溶解於10ml的thf中，於氮氣保護下，室溫避光攪拌反應36小時，離心分離得到粗產品，利用去離子水對粗產品進行洗滌、透析、冷凍乾燥後得到可降解聚合物磁性納米粒子。

實施例4

將摩爾比為1:1的fecl3·6h2o和feso4，加入50ml去離子水中配製成1.5g/ml的溶液，通入氮氣並在70℃下進行機械攪拌，然後加入3ml氫氧化鈉溶液反應30min後，再加入油酸2ml，繼續反應3h。所得粗產品經磁鐵收集後，再用去離子水洗滌、離心分離、乾燥即得產品四氧化三鐵納米粒子。

將含雙乙烯基二硫鍵的偶聯劑110mg、da36mg、dox35mg、mpeg-nh2164mg、fa-peg-nh226mg混合均勻，同時將100μl三乙胺溶解於10mldmf配置成體積濃度為1.0％的溶液，再滴加入上述混合物中，並在氮氣保護下於40℃反應40小時。反應結束後粗產品用乙醚洗滌沉澱，沉澱物溶解於去離子水中透析，冷凍乾燥得到暗紅色固體即為可降解聚合物。

將可降解聚合物12mg溶解於200μldmso中，並加入8mg四氧化三鐵納米粒子混合，然後將混合物溶解於20ml的thf中，於氮氣保護下，室溫避光攪拌反應40小時，離心分離得到粗產品，利用去離子水對粗產品進行洗滌、透析、冷凍乾燥後得到可降解聚合物磁性納米粒子。

實施例5

將摩爾比為1:10的fecl3·6h2o和feso4，加入50ml去離子水中配製成2g/ml的溶液，通入氮氣並在60℃下進行機械攪拌，然後加入1ml氫氧化鈉溶液反應60min後，再加入油酸3ml，繼續反應6h。所得粗產品經磁鐵收集後，再用去離子水洗滌、離心分離、乾燥即得產品四氧化三鐵納米粒子。

將含雙乙烯基二硫鍵的偶聯劑130mg、da56mg、dox65mg、mpeg-nh2204mg、fa-peg-nh266mg混合均勻，同時將50μl三乙胺溶解於10mlthf配置成體積濃度為0.5％的溶液，再滴加入上述混合物中，並在氮氣保護下於50℃反應24小時。反應結束後粗產品用乙醚洗滌沉澱，沉澱物溶解於去離子水中透析，冷凍乾燥得到暗紅色固體即為可降解聚合物。

將可降解聚合物18mg溶解於200μldmso中，並加入6mg四氧化三鐵納米粒子混合，然後將混合物溶解於20ml的thf中，於氮氣保護下，室溫避光攪拌反應24小時，離心分離得到粗產品，利用去離子水對粗產品進行洗滌、透析、冷凍乾燥後得到可降解聚合物磁性納米粒子。