檢測泰妙菌素藥物的酶聯免疫試劑盒及其應用的製作方法

2023-06-15 11:06:31

專利名稱：：檢測泰妙菌素藥物的酶聯免疫試劑盒及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及酶聯免疫檢測技術，具體涉及一種用於檢測泰妙菌素藥物的酶聯免疫試劑盒，其特別適於雞肉、豬肉中泰妙菌素藥物殘留的檢測。
背景技術：
：泰妙菌素(Tiamulin，又稱硫姆林，泰妙黴素，泰妙靈，枝原淨，泰牧黴素)是一種雙萜類動物專用抗生素，結構式如圖l，主要用於防治家畜家禽呼吸系統疾病和動物促生長，是世界十大獸用抗生素之一。泰妙菌素的抗菌作用為抑制感受性細菌蛋白質的合成，在高濃度下才有殺菌作用。它對許多革蘭氏陽性菌及支原體有特效，特別是對金黃色葡萄球菌，鏈球菌，多種黴形體及某些螺旋體具有較強的作用。泰妙菌素有較強剌激性，副作用很多，過量引起短暫流涎、嘔吐和中樞神經系統抑制，其藥理作用複雜，副作用極多，使得其在應用同時受到了殘留監控的重視。目前，檢測泰妙菌素殘留量的方法主要是高效液相色譜法(HPLC)，由於複雜的儀器設備和繁瑣的過程以及對檢驗人員的高技能要求，不適合現場監控和大量樣本的篩查。
發明內容本發明的目的在於針對上述不足提供一種用於泰妙菌素檢測的酶聯免疫試劑盒，其操作簡單適合現場大批量樣品的篩選。本發明試劑盒，它含有(1)包被有包被原的酶標板(包被原為抗原、抗體或抗抗體)；(2)酶標記物(為酶標記半抗原、酶標記抗體或酶標記抗抗體)；(3)泰妙菌素特異性抗體工作液(當酶標板上包被抗原且酶標記物為酶標記抗抗體或酶標板上包被抗抗體且酶標記物為酶標記抗原時含有)；(4)泰妙菌素標準品溶液；(5)底物顯色液；(6)終止液;(7)濃縮洗滌液；(8)濃縮復溶液。本發明所提供的檢測泰妙菌素的酶聯免疫試劑盒，包括泰妙菌素特異性抗體工作液及預包被包被原的酶標板和酶標記物工作液；所述酶標記物為酶標記的抗抗體，酶標記泰妙菌素半抗原或酶標記泰妙菌素特異性抗體；所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體。所述泰妙菌素半抗原通過泰妙菌素和琥珀酸酐反應得到的。所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酯酶，其中優選辣根過氧化物酶；酶標記的羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體是採用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯得到的；酶標記泰妙菌素半抗原是採用混合酸酐或碳化二亞胺法將標記酶與泰妙菌素半抗原偶聯得到的；酶標記特異性抗體是採用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與特異性抗體偶聯得到的，辣根過氧化物酶可採用現有技術中的多種方法將其與抗抗體進行偶聯，如戊二醛法，過碘酸鈉法等，本發明經過長期的勞動創造將過碘酸鈉法進行了改良，使其省時、降低辣根過氧化物酶(HRP)與抗抗體的濃度比率，節省了原材料。所述泰妙菌素特異性抗體可為泰妙菌素單克隆抗體或泰妙菌素多克隆抗體；它們均是用泰妙菌素半抗原與載體蛋白採用混合酸酐法或碳化二亞胺法得到的偶聯物作為免疫原得到的；所述泰妙菌素多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述泰妙菌素單克隆抗體優選為泰妙菌素鼠單克隆抗體，所述泰妙菌素多克隆抗體優選為泰妙菌素兔多克隆抗體。所述泰妙菌素單克隆抗體優選為泰妙菌素的單克隆雜交瘤細胞株D-1-1CGMCCNo.3357分泌的單克隆抗體。所述泰妙菌素單克隆雜交瘤細胞株D-1-1CGMCCNo.3357(分類命名對泰妙菌素藥物的單克隆雜交瘤細胞株)已於2009年10月28日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)。以上抗體均可以用泰妙菌素半抗原與載體蛋白的偶聯物作為免疫原製備。所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白等常用載體蛋白；所述泰妙菌素半抗原與載體蛋白的偶聯物可通過將泰妙菌素半抗原和載體蛋白用混合酸酐法或碳化二亞胺法進行偶聯得到。為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括泰妙菌素標準品溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液。所述濃縮洗滌液優選為pH7.1-7.7，含有0.8%1.2%吐溫80和0.03-0.05%0硫柳汞防腐劑、0.02-0.04mol/L磷酸鹽緩衝液，所述百分比為重量體積百分比。當標記酶為辣根過氧化物酶時，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，終止液為終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩衝液；當標記酶為鹼性磷酸酯酶時，顯色液為對硝基磷酸鹽緩衝液、終止液為12mol/L氫氧化鈉溶液。所述濃縮復溶液為含有O.08%-0.12%吐溫20、3_8%卵清蛋白、0.2-0.5mol/L磷酸鹽緩衝液，所述百分比為重量體積百分比。其中酶標板在製備過程中所用的包被緩衝液可以為pH值為7.2-7.8,0.010.03mol/L磷酸鹽緩衝液，所用封閉液為pH值為7.0-7.6、0.3-0.6%的人血清白蛋白、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩衝液和0.5%的脫脂奶粉，所述百分比為重量體積百分比。本發明中酶標板的製備過程為用包被緩衝液將包被原稀釋成0.20.3iig/ml，每孔加入100ii1，37t:溫育2h或fC過夜，傾去包被液，用稀釋後的洗滌液洗滌2次，每次30s，拍幹，然後在每孔中加入150200iU封閉液，37t:溫育12h，傾去孔內液體拍幹，乾燥後用鋁膜真空密封保存。本發明中抗原的合成過程為1.半抗原的合成泰妙菌素半抗原是將泰妙菌素和琥珀酸酐通過反應得到的，技術路線如圖2。2.泰妙菌素抗體的製備將泰妙菌素半抗原與載體蛋白採用碳化二亞胺法進行偶聯得到免疫原。免疫原的具體製備方法泰妙菌素是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發機體產生免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯後才具有免疫原性。因此將泰妙菌素和琥珀酸酐通過反應得到的合成泰妙菌素半抗原，這樣突出了泰妙菌素分子結構中的特徵基團，使製備的泰妙菌素抗體對泰妙菌素的特異性很高。泰妙菌素鼠單克隆抗體的製備動物免疫程序採用Balb/c小鼠作為免疫動物，以泰妙菌素半抗原與載體蛋白偶聯物為免疫原，得到較好的多抗血清後，取出脾臟進行細胞融合。細胞融合與克隆化取免疫Balb/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選細胞株，直到得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。泰妙菌素兔多克隆抗體的製備採用紐西蘭大白兔作為免疫動物，以泰妙菌素半抗原與載體蛋白偶聯物為免疫原對紐西蘭大白兔進行免疫，多次免疫後測定血清抗體效價得到多克隆抗體。本發明抗抗體的製備過程羊抗鼠抗抗體是以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體是以羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病菌體羊進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。本發明所述試劑盒中泰妙菌素標準品溶液標準品溶液6瓶，Og/L、0.3yg/L，0.9iig/L，2.7iig/L，8.1iig/L，24.3iig/L。本發明的檢測原理為當在微孔條上預包被泰妙菌素偶聯抗原時，加入樣本溶液或標準品溶液後，隨即加入酶標二抗，再加入泰妙菌素特異性抗體溶液，樣本中殘留的泰妙菌素藥物與酶標板上包被的泰妙菌素偶聯抗原競爭泰妙菌素特異性抗體，酶標記抗抗體進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光值與泰妙菌素藥物的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中泰妙菌素的殘留量。同時根據酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的泰妙菌素標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中泰妙菌素殘留量的濃度範圍。當在微孔條上預包被泰妙菌素特異性抗體時，加入樣本溶液或標準品溶液後，再加入酶標記泰妙菌素半抗原溶液，樣本中殘留的泰妙菌素藥物與酶標記半抗原競爭包被在酶標板上的泰妙菌素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與泰妙菌素藥物的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中泰妙菌素的殘留含量。同時根據酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的泰妙菌素標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中泰妙菌素殘留量的濃度範圍。當在微孔條上預包被泰妙菌素偶聯抗原時，加入樣本溶液或標準品溶液後，再加入酶標記泰妙菌素特異性抗體溶液，樣本中殘留的泰妙菌素藥物與酶標板上包被的泰妙菌素偶聯抗原競爭泰妙菌素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與泰妙菌素藥物的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中泰妙菌素的殘留含量。同時根據酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的泰妙菌素標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中泰妙菌素殘留量的濃度範圍。當在微孔條上預包被抗抗體時，加入泰妙菌素抗體孵育後，加入樣本溶液或標準品溶液後，再加入酶標記泰妙菌素半抗原溶液，樣本中殘留的泰妙菌素藥物與酶標記泰妙菌素半抗原競爭泰妙菌素特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與泰妙菌素藥物的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中泰妙菌素的殘留含量。同時根據酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的泰妙菌素標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中泰妙菌素殘留量的濃度範圍。本發明還提供了一種應用上述酶聯免疫試劑盒檢測泰妙菌素藥物的方法，它包括步驟(1)樣品前處理；[OO47](2)用試劑盒進行檢測；[OO48](3)分析檢測結果。樣品的前處理主要是為了從樣品中獲得泰妙菌素溶液，從而用於後續的檢測。樣品的前處理方法稱取2.0士0.05g均質物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5-8ml乙酸乙酯，振蕩器振蕩10min，3000g以上離心5min;取上清液l_3ml至10ml乾淨的玻璃試管中，於5060°C水浴氮氣流下吹乾；加入l-3ml樣本復溶液，用渦旋儀渦動lmin，取50iU用於分析。本發明中用試劑盒檢測時當包被原為泰妙菌素偶聯抗原時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液，隨即加入酶標二抗，再加入抗體工作液，溫育後洗滌拍幹，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；當包被原為泰妙菌素偶聯抗原時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液再加入酶標記抗體，溫育後洗滌拍幹，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；當包被原為泰妙菌素特異性抗體時，向酶標板微孔中加入標準品溶液或樣本溶液再加入酶標記泰妙菌素半抗原，溫育後洗滌拍幹，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值；當包被原為抗抗體時，向酶標板微孔中加入泰妙菌素抗體，溫育後洗滌拍幹，再加入標準品溶液或樣品溶液後加入酶標泰妙菌素半抗原，溫育後洗滌拍幹，顯色、終止，用酶標儀測定吸光度值。本發明中檢測結果分析過程為用所獲得的每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準溶液(O標準)的吸光度值(B。)再乘以100%，即百分吸光度值。計算公式為百分吸光度值(％)=(B/BO)X100%以泰妙菌素標準品溶液的濃度(yg/L)的半對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪製標準曲線圖。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應每一個樣品的濃度則可從標準曲線上讀出樣本中泰妙菌素的殘留量。本發明中檢測結果的分析也可以採用回歸方程法，計算出樣品溶液濃度。本發明中檢測結果的分析還可以利用計算機專業軟體，此法更便於大量樣品的快速分析，整個檢測過程只需不足1小時可以完成。本發明檢測泰妙菌素的酶聯免疫試劑盒主要採用間接競爭ELISA方法定性或定量檢測樣品中泰妙菌素的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣品；採用高特異性的泰妙菌素單克隆抗體，主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準確度高等特點。本發明的酶聯免疫試劑盒，結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便利、檢測方法高效、準確、簡便、適於大批量樣品篩選檢測。本發明的試劑盒將在泰妙菌素的檢測中發揮重要作用。圖1:泰妙菌素化學結構通式；圖2:泰妙菌素半抗原合成技術路線；圖3:泰妙菌素偶聯物為包被原、酶標抗抗體為酶標記物的試劑盒的標準曲線圖。具體實施例方式下面結合具體的實施例來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明，而不用來限制本發明的範圍。實施例1試劑盒組分的製備1.抗原的合成a.半抗原的合成將泰妙菌素和琥珀酸酐通過反應得到泰妙菌素半抗原。合成半抗原的具體步驟取延泰妙菌素500mg、琥珀酸酐lOOmg放入50ml圓底燒瓶中，加入8ml丙酮和8ml吡啶溶解完全，水浴加熱冷凝回流反應18h，用旋轉蒸發儀將反應液旋蒸乾，得淡黃色微粘稠液體，然後再加入丙酮10ml振蕩後旋轉蒸發儀蒸乾，重複三次。用TLC對丙酮液進行監測，有未反應完的原料，用微量二氯甲烷溶解。展開劑為乙酸乙酯石油醚=1:2，過矽膠柱。用TLC進得監測，選出目標液，用旋轉蒸發儀將反應液旋蒸乾，得固體物即為泰妙菌素半抗原產物。b.免疫原合成取上述製備的泰妙菌素半抗原10mg，10mgNHS，和12.5mgEDC充分溶解於lmLDMF中，於室溫下攪拌24h，即可得到反應液A;稱取BSA50mg，使之充分溶解在3mLPBS(PH=7.2)中，得到B液；將反應液A逐滴緩慢滴加到B液中，並於室溫下攪拌3h，用0.Olmol/1PBS透析3d，每天換2次透析液，以除去未反應的小分子物質，以12000rpm/min室溫離心30min，收集上清，得到泰妙菌素免疫原，分裝，於_201:保存備用。c.包被原泰妙菌素偶聯抗原的製備泰妙菌素半抗原與血藍蛋白偶聯得到包被原。包被原的製備過程取製備的泰妙菌素半抗原10mg，用0.5mlDMF溶解，冷卻至10°C，加入氯甲酸異丁酯5iil，10。C攪拌反應30min，即可得到反應液A。稱取36mg0VA充分溶解在2ml50mmol/L碳酸鈉溶液中，得到反應B液；將反應液A逐滴緩慢滴加到B液中，10°C反應4h，然後fC過夜；用0.Olmol/1PBS透析3d，每天換2次透析液，以除去未反應的小分子物質，12000rpm/min室溫離心30min，收集上清，得到泰妙菌素包被原，分裝，置於-2(TC保存備用。單克隆抗體的製備a.動物免疫將免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為100yg/只，使其產生多克隆抗體血清。b.細胞融合和克隆化小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按7:1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，採用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。經篩選得到泰妙菌素的單克隆雜交瘤細胞株D-1-1CGMCCNo.3357泰妙菌素的單克隆雜交瘤細胞株可以無限量的產生泰妙菌素特異性抗體，且該抗體特異性是針對泰妙菌素的，針對豬肉、雞肉樣品中泰妙菌素檢測限可達到2iig/L。c.細胞凍存和復甦將泰妙菌素的單克隆雜交瘤細胞株用凍存液製成1X109個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37t:水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。d.單克隆抗體的生產與純化將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天後腹腔注射泰妙菌素的單克隆雜交瘤細胞株5X107個/只，7天後採集腹水。用辛酸_飽和硫酸銨法進行腹水純化，-20°C保存。2.多克隆抗體的製備採用紐西蘭大白兔作為免疫動物，以泰妙菌素與牛血清白蛋白偶聯物為免疫原，免疫劑量為1.5mg/kg，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合製成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔34周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最後一次不加佐劑。最後一次免疫10天後採血，測定血清抗體效價，心臟採血，用硫酸銨分級沉澱得到純化的多克隆抗體。3.羊抗鼠抗抗體的製備過程以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；羊抗兔抗抗體的製備以羊作為免疫動物，以兔源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗兔抗抗體。4.酶標板的製備用包被緩衝液將泰妙菌素偶聯抗原、抗體或抗抗體稀釋成0.20iig/ml，每孔加入100ii1，37t:溫育2h，傾去包被液，用稀釋的濃縮洗滌液洗滌2次，每次30s，拍幹，然後再每孔中加入200iU封閉液，37t:溫育2h，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。5.酶標記羊抗鼠抗抗體的置備將抗抗體與辣根過氧化物酶(HRP)採用改良後的過碘酸鈉法進行偶聯。傳統的過碘酸鈉法要求反映體系中酶與抗抗體的摩爾濃度比為4:1;由於辣根過氧化物酶在強氧化的作用下產生許多與抗抗體結合的位點，這樣活化的辣根過氧化物酶分子充當了連接各分子的橋梁，降低了酶標記物的酶活性，使製備的偶聯物中混有許多聚合體，為了解決這個問題，我們將傳統的方法進行了改良，即1)省去了氨基的封閉過程，因為能產生自身氨基連接的氨基實際很少。2)降低了辣根過氧化物酶抗抗體的摩爾濃度比率至2:l，改良後的方法比傳統的方法簡便，對酶的活性的損失減少。實施例2檢測泰妙菌素的酶聯免疫試劑盒的組建組建檢測泰妙菌素的酶聯免疫試劑盒，使其包含下述組分(1)包被泰妙菌素偶聯抗原的酶標板；(2)用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗抗體；(3)泰妙菌素單克隆抗體工作液；(4)泰妙菌素標準品溶液6瓶，濃度分別為0iig/L、0.3iig/L、0.9iig/L、2.7iig/L、8.1iig/U4.3iig/1;(5)底物顯色液由A液和B液組成，底物顯色液A液為過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯苯胺；(6)終止液為2mol/L鹽酸；(7)濃縮洗滌液為pH7.1-7.7，含有0.8%1.2%吐溫80和0.03-0.05%。硫柳滎防腐劑、0.02-0.04mol/L磷酸鹽緩衝液，所述百分比為重量體積百分比。(8)濃縮復溶液為含有0.08%-0.12%吐溫20、3-8%卵清蛋白、0.2-0.5mol/L磷酸鹽緩衝液，所述百分比為重量體積百分比。實施例3樣品中泰妙菌素的檢測1.樣品前處理稱取2.0士0.05g均質物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5-8ml乙酸乙酯，振蕩器振蕩10min，3000g以上離心5min;取上清液l_3ml至10ml乾淨的玻璃試管中，於5060°C水浴氮氣流下吹乾；加入l-3ml樣本復溶液，用渦旋儀渦動lmin，取50iU用於分析。2.用試劑盒檢測向包被有泰妙菌素偶聯抗原的酶標板微孔中加入泰妙菌素標準品溶液或樣品溶液50iU，隨即加入酶標二抗50ia，再加入泰妙菌素單克隆抗體工作液50ia，用蓋板模封板，37°C恆溫箱中反應30min，倒出孔內液體，每孔加入250y1洗滌液，30s後倒出孔內液體，如此重複操作共洗板5次，用吸水紙拍幹。每孔加入底物顯色液A液過氧化脲，底物顯色液B液四甲基聯苯胺(TMB)，輕輕振蕩混勻，37t:恆溫箱避光顯色15min，每孔加入2mo1/L終止液鹽酸50ii1，輕輕振蕩混勻，用酶標儀波長設定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。3.檢測結果分析用所獲得的每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(O標準)的吸光度值(BO)再乘以100%，得到百分吸光度值。以泰妙菌素標準品濃度(Pg/L)的半對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪製標準曲線圖，見圖3。用同樣的辦法計算樣品溶液的百分吸光度值，相對應每一個樣品的濃度，則可從標準曲線上讀出泰妙菌素的殘留量。實驗例1標準品精密度試驗分別從三個不同的時間段製備的酶標板中各抽出一批酶標板，每批各抽取10個試劑盒，每板各抽出20個微孔，測定2.7iig/L標準溶液的吸光度值，計算變異係數。表1標準可重複性試驗(CV%)tableseeoriginaldocumentpage10通過上述試驗結果可以得出，每批試劑盒各IO次標準品變異係數在5.8%-11.6%之間，符合精密度小於或等於25%的規定。實驗例2樣本精密度和準確度試驗1.樣品精密度試驗以5iig/L濃度的泰妙菌素對雞肉、豬肉樣品進行添加測定，分別取三個不同批次的試劑盒各五個，每個濃度重複5次，分別計算變異係數，結果見表2。表2雞肉樣本可重複性試驗tableseeoriginaldocumentpage10表2豬肉樣本可重複性試驗tableseeoriginaldocumentpage11結果表明雞肉、豬肉樣本的變異係數均在5.9%-12.1%之間，符合了《農業部文件》農醫發200517號附件2試劑盒備案參考評判標準中精密度標準。b.樣本準確度試驗取兩個濃度的泰妙菌素標準品溶液分別為10iig/kg、20iig/kg，分別對樣品進行添加回收試驗，每個濃度做4個平行，分別計算準確度。表5試劑盒的準確度tableseeoriginaldocumentpage11結果表明雞肉、豬肉樣本添加回收率在82.0%-88.9%之間。實驗例3交叉反應率試驗選擇與泰妙菌素有類似結構和類似功能的藥物測定交叉反應率，通過各種藥物的標準曲線分別得到其50%抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反應率。交叉反應率越大，那麼此試劑盒對泰妙菌素的檢測的特異性就越好。交叉反應率(％)=(引起50%抑制泰妙菌素的濃度/引起50%抑制的類似物濃度)X100%表6試劑盒的特異性tableseeoriginaldocumentpage12實驗例4試劑盒保存條件為28°C，經過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50%抑制濃度、泰妙菌素添加實際測定值均在正常範圍之內。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37t:保存條件下放置6天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發生，將試劑盒放入-2(TC冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2『C至少可以保存6個月以上。權利要求一種檢測泰妙菌素藥物的酶聯免疫試劑盒，其特徵在於它含有(1)包被有包被原的酶標板；(2)酶標記物；(3)泰妙菌素標準品溶液；(4)底物顯色液；(5)終止液；(6)濃縮洗滌液；(7)濃縮復溶液，所述包被原為泰妙菌素偶聯抗原、泰妙菌素抗體或抗抗體，所述酶標記物為酶標記泰妙菌素半抗原、酶標記泰妙菌素抗體或酶標記抗抗體，當酶標板上包被抗原且酶標記物為酶標記抗抗體或酶標板上包被抗抗體且酶標記物為酶標記抗原時還含有泰妙菌素特異性抗體工作液。2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述泰妙菌素偶聯抗原是由泰妙菌素半抗原與載體蛋白偶聯得到，所述泰妙菌素抗體是由所述偶聯抗原製備獲得，其中所述泰妙菌素半抗原是通過將泰妙菌素與琥珀酸酐反應得到的。3.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於所述泰妙菌素抗體為單克隆抗體。4.如權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於所述泰妙菌素抗體由雜交瘤細胞株D-1-1CGMCCNo.3357分泌產生。5.如權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述載體蛋白為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血藍蛋白。6.如權利要求書1或2所述的試劑盒，其特徵在於所用包被緩衝液可以為pH值為7.2-7.8，0.010.03mol/L磷酸鹽緩衝液，所用封閉液可以為pH值為7.0-7.6、0.3-0.6%的人血清白蛋白、0.1-0.2mol/L磷酸鹽緩衝液和0.5%的脫脂奶粉，所述百分比為重量體積百分比。7.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取鹼性磷酸酯酶，當標記酶為辣根過氧化物酶時，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺，終止液為12mol/L的硫酸或鹽酸緩衝液；當標記酶標記酶為細菌提取鹼性磷酸酯酶時，底物顯色液為對硝基磷酸鹽緩衝液、終止液為12mol/L氫氧化鈉。8.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於濃縮洗滌液為pH7.1-7.7，含有0.8%1.2%吐溫80和0.03-0.05%。硫柳汞防腐劑、0.02-0.04mol/L磷酸鹽緩衝液；濃縮復溶液為含有0.08%-0.12%吐溫20、3-8%卵清蛋白、0.2_0.5mol/L磷酸鹽緩衝液，泰妙菌素標準品溶液的濃度分別為0iig/L，0.3iig/L，0.9iig/L，2.7iig/L，8.1yg/L，24.3yg/L，所述百分比為重量體積百分比。9.權利要求18任一項所述的試劑盒在檢測泰妙菌素藥物殘留中的應用。10.—種檢測樣品泰妙菌素藥物殘留的方法，包括步驟(1)樣品前處理；(2)用權利要求1-8任一項所述的試劑盒進行檢測；(3)分析檢測結果。全文摘要本發明提供了一種檢測泰妙菌素藥物的酶聯免疫試劑盒，它含有包被有包被原的酶標板，酶標記物，泰妙菌素特異性抗體工作液(當酶標板上包被抗原且酶標記物為酶標記抗抗體或酶標板上包被抗抗體且酶標記物為酶標記抗原時含有)，泰妙菌素標準品溶液，底物顯色液，終止液，濃縮洗滌液，濃縮復溶液。本發明還公開了一種應用上述酶聯免疫試劑盒檢測泰妙菌素的方法，它包括步驟首先進行樣品前處理，然後用試劑盒進行檢測，最後分析檢測結果。本發明提供的酶聯免疫試劑盒可用於檢測動物組織如雞肉、豬肉等樣品中泰妙菌素的殘留量，其操作簡便、費用低廉、靈敏度高、能夠現場監控且適合大量樣本的篩查。文檔編號G01N33/543GK101782579SQ20091023782公開日2010年7月21日申請日期2009年11月11日優先權日2009年11月11日發明者萬宇平,何勇,何方洋,餘厚美,馮才偉,馮才茂,馮靜,劉平,崔海峰,張建華,扶勝,李勇,湯慶彩,汪善良,胡德專,趙正苗,陳煒玲申請人:北京望爾康泰生物技術有限公司;北京望爾生物技術有限公司