可同時檢測四種i型糖尿病自身免疫抗體的方法

2023-06-15 01:21:56

可同時檢測四種i型糖尿病自身免疫抗體的方法
【專利摘要】本發明提供一種可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，屬於醫學檢測【技術領域】，將螢光素酶基因與多抗原基因融合成融合載體，然後利用細胞轉化技術，將融合載體導入哺乳細胞系統中，進行螢光素酶—多抗原融合蛋白的表達；裂解基因重組細胞，獲得螢光素酶-多抗原融合蛋白；然後利用免疫沉澱反應，將螢光素酶-多抗原融合蛋白稀釋液與病人血清混合進行特異性結合，獲得融合蛋白-抗體複合物，再加入蛋白A瓊脂糖捕捉融合蛋白-抗體複合物；加入螢光素酶底物，檢測螢光強度。該方法快速簡便、準確率高，克服現有技術使用放射性標記物所引起的放射線輻射和汙染等問題，高靈敏度、高信噪比，測量值穩定可靠。
【專利說明】可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學檢測【技術領域】，具體地說是一種可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法。
【背景技術】
[0002]—般的，I型糖尿病是一種自體免疫疾病，機體受到感染(尤其是病毒感染)、毒物等因素誘發而產生異常自身體液和細胞免疫應答，導致胰島β細胞損傷，胰島素分泌減少，一旦發病需要依賴外源性胰島素補充以維持生命，所以I型糖尿病又稱胰島素依賴性糖尿病。
[0003]此類糖尿病常見於兒童和青年患者，但是它可以在任何年齡段的人群中發生，並且此類糖尿病的患病率約佔總糖尿病病例的10%。可見及早地對I型糖尿病進行診斷以及高危人群中進行預報具有重要的意義。
[0004]對糖尿病的診斷主要通過檢測其自身免疫性抗體，抗體主要包括以下幾種:穀氨酸脫羧酶抗體(GADA)、胰島細胞抗體(ICA)、酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2a、IA_2b)及胰島素自身免疫性抗體(IAA)。目前測定GADA、IA-2A、IAA常用的方法有放射免疫法、酶聯免疫法；用於ICA測定的主要用間接免疫螢光法，另外也有用酶聯免疫法及免疫組化法。
[0005]ELISA技術(enzyme-1 inked immuno sorbent assay酶聯免疫吸附測定)對於酶的活性和靈敏度要求很高，其特異性取決於抗原製備的優劣；且其結合物製備尚未標準化，這使得實驗結果的可重複性不高，需要進行多次檢測。另外，若抗原及酶結合物濃度低，最後吸光度值太小，易出現假陰性。多數國家的臨床檢測已放棄ELISA法，使用放射免疫法(RIA法)。
[0006]放射免疫分析具有許多其它分析方法無可比擬的優點。它既具有免疫反應的高特異性，又具有放射性測量的高靈敏度，並且樣品用量少，常可測至皮摩爾量。但本方法有時會出現交叉反應、假陽性反應、組織樣品處理不夠迅速，不能滅活降解酶和鹽，有時會影響
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[0007]
【發明內容】

[0008]本發明的技術任務是解決現有技術的不足，提供一種快速簡便、準確率高的，並可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法。
[0009]本發明的技術方案是按以下方式實現的，該可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特徵在於:將螢光素酶基因與多抗原基因融合成融合載體，所述多抗原採用能夠免疫應答產生I型糖尿病的病人血清中自身免疫性抗體的抗原，
然後利用細胞轉化技術，將融合載體導入哺乳細胞系統中，進行螢光素酶一多抗原融合蛋白的表達；裂解基因重組細胞，獲得螢光素酶-多抗原融合蛋白；然後利用免疫沉澱反應，將螢光素酶-多抗原融合蛋白稀釋液與病人血清混合進行特異性結合，獲得融合蛋白-抗原-抗體複合物，再加入蛋白A瓊脂糖捕捉融合蛋白-抗原-抗體複合物；加入螢光素酶底物，檢測螢光強度。
[0010]可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，包括以下步驟:
A、突光素酶基因與多抗原基因的融合載體的構建
a、選取螢光素酶基因和多抗原基因的目的序列(GAD65抗原基因序列、IA_2a抗原基因序列、IA-2b抗原基因序列和insulin抗原基因序列)，進行PCR擴增，在kpnl位點(GGTACC)引入限制性內切酶，獲得目的片段，做凝膠電泳進行鑑定；
b、將獲得的目的片段與PA0815載體質粒分別進行kpnl和xbal雙酶切，並使用T4連接酶將目的基因與載體基因連接得到重組質粒；
B、質粒轉化
將重組質粒轉入製備好的感受態哺乳細胞系統中，在氨苄耐藥基因平皿中篩選陽性克隆，從轉化細胞內提取質粒DNA，然後質粒DNA進行PCR鑑定及kpnl和xbal雙酶切鑑定；
C、融合蛋白的獲取
挑取單菌落至含有8%?15% I型糖尿病的病人血清的DMEM培養液中27°C?31°C下培養50?60h，於O?4°C，6000?8000rpm離心15?20min ;將得到的細胞沉澱用磷酸鹽緩衝液洗滌並離心2?3次，最後將收穫的細胞在冰浴中超聲處理15?30 min，然後將細胞裂解液於O?4°C,最大轉速離心15?45 min後取上清液；
D、重組融合蛋白的純化
把步驟C所得上清液，用硫酸銨沉澱法進行分級沉澱，沉澱物經0.05?0.08 mol/LTris-Hcl緩衝液衝洗2?3次，後凍幹備用；
E、將步驟D所得融合蛋白用0.01?0.02mol/L, pH7.0?8.0 PBS磷酸鹽緩衝液進行一定倍數的梯度稀釋得融合蛋白稀釋液，要求融合蛋白稀釋液每微升中有IO7?IO8個螢光單位；
F、向離心管中加入50μ L?80 μ L的融合蛋白稀釋液，然後加入80?140 μ L預處理好的實驗組的病人血清，在室溫下，讓I型糖尿病自身抗體與抗原特異性結合3?5h ;
G、再加入2?8yL蛋白A瓊脂糖，來捕捉融合蛋白-抗體複合物，(TC?4 °C緩慢搖動融合蛋白-抗體複合物過夜或室溫緩慢搖動I?2h，使抗體與蛋白A瓊脂糖偶連得到蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體複合物；
H、免疫沉澱反應後，在O°C?4°C以3000rpm速度離心3?5 min，將蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體複合物離心至管底；將上清小心吸去，沉澱用磷酸鹽緩衝液將蛋白A瓊脂糖-抗體複合物懸起離心洗滌2?5次；
1、用10?40μ L磷酸鹽緩衝液將蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體複合物懸起後，力口入20?100 UL螢光素酶底物，立即用螢光檢測儀檢測螢光強度，判斷血清樣品中是否含有I型糖尿病自身抗體。
[0011]多抗原是能免疫應答產生I型糖尿病的病人血清中抗體的抗原。
[0012]抗體是採用患有I型糖尿病的病人血清中的抗體。抗體是指穀氨酸脫羧酶抗體(GAD65抗體)、酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2a抗體和IA_2b抗體)和胰島素自身抗體(IAA)四種抗體。
[0013]所述多抗原基因採用能夠表達對應:能夠免疫應答I型糖尿病的穀氨酸脫羧酶GAD65抗體、酪氨酸磷酸酶IA-2a抗體、酪氨酸磷酸酶IA_2b抗體和胰島素自身IAA抗體的四種抗體的GAD65抗原、IA-2a抗原、IA_2b抗原和insulin抗原的四種抗原基因。
[0014]GAD65 抗原基因序列是:SEQ ID N0.1 ；
IA-2a抗原基因序列是:SEQ ID N0.2 ；
IA-2b抗原基因序列是:SEQ ID N0.3 ； insulin抗原基因序列是:SEQ ID N0.4。
[0015]以磷酸鹽緩衝液和健康人的血清為空白對照，以排除非特異性結合的幹擾，與空白對照相比，實驗組比空白組螢光明顯強，即為I型糖尿病自身抗體檢測陽性，即可確定實驗組的病人血清含有I型糖尿病自身免疫性抗體。
[0016]PCR擴增的反應條件程序:90°C?95°C變性5?10分鐘；然後93°C?98°C變性45?60秒，45°C?50°C退火30?45秒，65°C?70°C延伸50?60秒，進行25?30個循環；最後70°C?75°C延伸10?15分鐘，O?4°C保溫。
[0017]所述突光素酶基因為Ranilla突光素酶基因。
[0018]哺乳細胞系統為293改良細胞。
[0019]本發明與現有技術相比所產生的有益效果是:
可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法是在放射免疫技術的基礎上，使用螢光素融合蛋白作為標記物，研發出的基因重組螢光素酶一多抗原融合蛋白抗體檢測技術。
[0020]可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法快速簡便、準確率高，克服現有技術使用放射性標記物所引起的放射線輻射和汙染等問題，使用微量螢光檢測儀檢測，與傳統的HPLC相比，操作簡單，直接接受標準0.2mL離心管進行隔離測定，無需開蓋堵截汙染途徑，保證實驗結果可靠和操作人員安全。另外採用不小於25uL樣品量進行測定，達到微量省試劑的要求。並且高靈敏度、高信噪比，測量值穩定可靠。
[0021]該可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法中蛋白A瓊脂糖的使用能夠特異性地結合免疫球蛋白的FC片段，所以能和抗原-抗體結合，減少非特異性結合的吸附。
[0022]螢光素酶基因選用Ranilla螢光素酶基因。所採用的螢光酶底物，是一種Ranilla螢光底物，在螢光酶的作用下可產生螢光，螢光信號強度與螢光素酶濃度成正比。
[0023]該可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法使用微量螢光檢測儀檢測，與傳統的HPLC相比，操作簡單，直接接受標準0.2mL離心管進行隔離測定，無需開蓋堵截汙染途徑，保證實驗結果可靠和操作人員安全。
[0024]該可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法採用不小於25 μ L樣品量進行測定，達到微量省試劑的要求。
[0025]該可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法的實驗組血清中只要含有四種抗體中的一種，即只要有一種抗體檢測為陽性，即可確定樣品含有糖尿病自身抗體，高靈敏度、高信噪比，測量值穩定可靠。
[0026]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]附圖1是本發明的實施例測定結果示意圖。
[0028]【具體實施方式】
[0029]下面對本發明的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法作以下詳細說明。
[0030]實施例:
本發明的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法包括以下步驟:
1、突光素酶基因與多抗原基因的融合載體的構建
(I)選取螢光素酶基因和多抗原基因的目的序列(GAD65抗原基因序列、IA-2a抗原基因序列、IA-2b抗原基因序列和insulin抗原基因序列)，進行PCR擴增，PCR擴增的反應條件程序:90°C?95°C變性5?10分鐘；然後93°C?98°C變性45?60秒，45°C?50°C退火30?45秒，65°C?70°C延伸50?60秒，進行25?30個循環；最後70°C?75°C延伸10?15分鐘，O?4°C保溫。
[0031]在kpnl位點(GGTACC)引入限制性內切酶，獲得目的片段，做凝膠電泳進行鑑定； 多抗原是能免疫應答產生I型糖尿病的病人血清中抗體的抗原。
[0032]抗體是採用患有I型糖尿病的病人血清中的抗體。抗體是指穀氨酸脫羧酶抗體(GAD65抗體)、酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2a抗體和IA_2b抗體)和胰島素自身抗體(IAA)四種抗體。
[0033]所述多抗原基因採用能夠表達對應:能夠免疫應答I型糖尿病的穀氨酸脫羧酶GAD65抗體、酪氨酸磷酸酶IA-2a抗體、酪氨酸磷酸酶IA_2b抗體和胰島素自身IAA抗體的四種抗體的GAD65抗原、IA-2a抗原、IA_2b抗原和insulin抗原的四種抗原基因。
[0034]GAD65 抗原基因序列是:SEQ ID N0.1 ；
IA-2a抗原基因序列是:SEQ ID N0.2 ；
IA-2b抗原基因序列是:SEQ ID N0.3 ； insulin抗原基因序列是:SEQ ID N0.4。
[0035](2)將獲得的目的片段與PA0815載體質粒分別進行kpnl和xbal雙酶切，並使用T4連接酶將目的基因與載體基因連接得到重組質粒。
[0036]2、質粒轉化
將重組質粒轉入製備好的感受態哺乳細胞系統中，在氨苄耐藥基因平皿中篩選陽性克隆，從陽性克隆細胞內提取質粒DNA，然後質粒DNA進行PCR鑑定及kpnl和xbal雙酶切鑑定。
[0037]3、融合蛋白的獲取
挑取單菌落至含有10%血清的DMEM培養液中29°C下培養54h (中間過程進行逐步擴大培養)，於4°C,8000rpm離心15min ;將得到的細胞沉澱用磷酸鹽緩衝液洗漆並離心3次，最後將收穫的細胞在冰浴中超聲處理30 min,然後將細胞裂解液於4°C，最大轉速離心30min後取上清液。
[0038]4、重組融合蛋白的純化
把所得上清液，用硫酸銨沉澱法進行分級沉澱，沉澱物經0.06 mol/L Tris-Hcl緩衝液衝洗3次,後凍幹備用。
[0039]5、將凍幹備用的融合蛋白用0.01mol/L,pH7.4 PBS緩衝液進行一定倍數的梯度稀釋，確保每微升中有IO7個螢光單位。
[0040]6、向離心管中加入75 μ L的融合蛋白稀釋液，然後加入100 μ L預處理好的實驗組的血清，在室溫下，讓糖尿病自身抗體與抗原特異性結合3?5h。
[0041]7、為了保證檢測的準確性，試驗時分別以磷酸鹽緩衝液和健康人的血清為空白對照，以排除某些非特異性結合的幹擾。
[0042]8、再加入5 μ L蛋白A瓊脂糖，來捕捉抗原-抗體複合物，4°C緩慢搖動抗原-抗體複合物過夜或室溫緩慢搖動2h，使抗體與蛋白A瓊脂糖偶連得到蛋白A瓊脂糖-抗原-抗體複合物。
[0043]9、免疫沉澱反應後，在O°C以3000 rpm速度離心5 min，將蛋白A瓊脂糖-抗
原-抗體複合物離心至管底；將上清小心吸去，沉澱用磷酸鹽緩衝液將蛋白A瓊脂糖-抗原-抗體複合物懸起離心洗滌3次。
[0044]10、用30 μ L磷酸鹽緩衝液將蛋白A瓊脂糖-抗原-抗體複合物懸起後，加入80UL螢光素酶底物，立即用螢光檢測儀檢測螢光強度，判斷血清樣品中是否含有糖尿病自身抗體。
[0045]11、與空白對照相比，實驗組比空白組螢光明顯強，即為糖尿病自身抗體檢測陽性，四種抗體只要有一種檢測為陽性，即可確定樣品含有糖尿病自身抗體，樣品來源人體患有I型糖尿病。
[0046]利用上述方法對50例健康血清進行檢測，有49份陰性，一份假陽性，故特異性為49八49+1)*100=98%，對20例I型糖尿病患者進行檢測，全部為陽性，故敏感性為100%。測定結果如附圖1。
【權利要求】
1.可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特徵在於:將螢光素酶基因與多抗原基因融合成融合載體，所述多抗原採用能夠免疫應答產生I型糖尿病的病人血清中自身免疫性抗體的抗原，然後利用細胞轉化技術，將融合載體導入哺乳細胞系統中，進行螢光素酶一多抗原融合蛋白的表達；裂解基因重組細胞，獲得螢光素酶-多抗原融合蛋白；然後利用免疫沉澱反應，將螢光素酶-多抗原融合蛋白稀釋液與病人血清混合進行特異性結合，獲得融合蛋白-抗體複合物，再加入蛋白A瓊脂糖捕捉融合蛋白-抗體複合物；加入螢光素酶底物，檢測螢光強度。
2.根據權利要求1所述的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特徵在於包括以下步驟: A、突光素酶基因與多抗原基因的融合載體的構建 a、選取螢光素酶基因和多抗原基因的目的序列:GAD65抗原基因序列、IA_2a抗原基因序列、IA-2b抗原基因序列和insulin抗原基因序列，進行PCR擴增，在kpnl位點GGTACC引入限制性內切酶，獲得目的片段，做凝膠電泳進行鑑定； b、將獲得的目的片段與PA0815載體質粒分別進行kpnl和xbal雙酶切，並使用T4連接酶將目的基因與載體基因連接得到重組質粒； B、質粒轉化 將重組質粒轉入製備好的感受態哺乳細胞系統中，在氨苄耐藥基因平皿中篩選陽性克隆，從轉化細胞內 提取質粒DNA，然後質粒DNA進行PCR鑑定及kpnl和xbal雙酶切鑑定； C、融合蛋白的獲取 挑取單菌落至含有8%~15% I型糖尿病的病人血清的DMEM培養液中27°C~31°C下培養50~60h，於O~4°C，6000~8000rpm離心15~20min ;將得到的細胞沉澱用磷酸鹽緩衝液洗滌並離心2~3次，最後將收穫的細胞在冰浴中超聲處理15~30 min，然後將細胞裂解液於O~4°C,最大轉速離心15~45 min後取上清液； D、重組融合蛋白的純化 把步驟C所得上清液，用硫酸銨沉澱法進行分級沉澱，沉澱物經0.05~0.08 mol/LTris-Hcl緩衝液衝洗2~3次，後凍幹備用； E、將步驟D所得融合蛋白用0.01~0.02mol/L, pH7.0~8.0 PBS磷酸鹽緩衝液進行一定倍數的梯度稀釋得融合蛋白稀釋液，要求融合蛋白稀釋液每微升中有IO7~IO8個螢光單位； F、向離心管中加入50μ L~80 μ L的融合蛋白稀釋液，然後加入80~140 μ L預處理好的實驗組的病人血清，在室溫下，讓I型糖尿病自身抗體與抗原特異性結合3~5h ; G、再加入2~8yL蛋白A瓊脂糖，來捕捉融合蛋白-抗體複合物，(TC~4 °C緩慢搖動融合蛋白-抗體複合物過夜或室溫緩慢搖動I~2h，使抗體與蛋白A瓊脂糖偶連得到蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體複合物； H、免疫沉澱反應後，在0°C~4°C以3000rpm速度離心3~5 min，將蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體複合物離心至管底；將上清小心吸去，沉澱用磷酸鹽緩衝液將蛋白A瓊脂糖-抗體複合物懸起離心洗滌2~5次； i、用10~40μ L磷酸鹽緩衝液將蛋白A瓊脂糖-融合蛋白-抗體複合物懸起後，加入20~100 UL螢光素酶底物，立即用螢光檢測儀檢測螢光強度，判斷血清樣品中是否含有I型糖尿病自身抗體。
3.根據權利要求1所述的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特徵在於所述多抗原基因採用能夠表達對應: 能夠免疫應答I型糖尿病的穀氨酸脫羧酶GAD65抗體、酪氨酸磷酸酶IA-2a抗體、酪氨酸磷酸酶IA_2b抗體和胰島素自身IAA抗體的四種抗體的GAD65抗原、IA_2a抗原、IA_2b抗原和insulin抗原的四種抗原基因。
4.根據權利要求3所述的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法,其特徵在於所述:
GAD65抗原基因序列是:SEQ ID N0.1 ； IA-2a抗原基因序列是:SEQ ID N0.2 ； IA-2b抗原基因序列是:SEQ ID N0.3 ； insulin抗原基因序列是:SEQ ID N0.4。
5.根據權利要求2所述的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法,其特徵在於以磷酸鹽緩衝液和健康人的血清為空白對照，以排除非特異性結合的幹擾，與空白對照相比，實驗組比空白組螢光明顯強，即為I型糖尿病自身抗體檢測陽性，即可確定實驗組的病人血清含有I型糖尿病自身免疫性抗體。
6.根據權利要求2所述的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法,其特徵在於:PCR擴增的反應條件程序:90°C~95°C變性5~10分鐘；然後93°C~98°C變性45~60秒，45°C~50°C退火30~45秒，65°C~70°C延伸50~60秒，進行25~30個循環；最後70°C~75°C延伸10~15分鐘，O~4°C保溫。
7.根據權利要求1或2所述的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特徵在於:所述螢光素酶基因為Ranilla螢光素酶基因。
8.根據權利要求1或2所述的可同時檢測四種I型糖尿病自身免疫抗體的方法，其特徵在於:哺乳細胞系統為293改良細胞。
【文檔編號】G01N21/64GK103969234SQ201410154456
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月17日 優先權日:2014年4月17日
【發明者】唐東起, 李世武, 吳琦, 蘇紅霞 申請人:山東東興匯智生物科技有限公司