一種治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗、藥物組合物及其應用的製作方法

2023-06-15 09:38:21

專利名稱：一種治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗、藥物組合物及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及同時攜帶人白細胞介素2及人肝細胞生長因子拮抗劑NK4基因的真核共表達質粒載體的減毒沙門氏菌口服菌苗預防和靶向治療實體瘤的應用，特別是涉及同時攜帶人白細胞介素2及人肝細胞生長因子拮抗劑雙基因的重組減毒沙門氏菌疫苗在預防和治療早、中、晚期實體瘤疾病中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類健康與生命的最主要的疾病之一。最新的流行病學調查結果顯示，我國現有癌症病人數300多萬，持續以每年3%的速度遞增。手術、放療和化療是目前惡性腫瘤治療的主要手段。但手術只適合早期且局限的病灶；而放療、化療的「治療窗」較狹窄，在殺傷腫瘤細胞時，對機體的正常細胞特別是造血和免疫系統也造成損害，常常引起貧血、出血感染、胃腸道反應、脫髮等症狀，病人的生活質量較差。目前在我國每年因癌症而死亡的人數約130萬人。從衛生經濟學的角度看，惡性腫瘤是花費最多，治療效果最差的疾病。因此，惡性腫瘤的治療問題一直是醫藥衛生領域亟待解決的重大課題，對於全面提高我國人民的健康水平十分重要。九十年代以來隨著分子生物學的迅猛發展，腫瘤的生物治療已逐漸被人們所認可。近年來，基因治療已成為腫瘤治療的熱點，主要是導入有治療價值的外源基因，從而誘發機體產生有效的抗腫瘤免疫應答。
肝細胞生長因子(h印atocyte growth factor, HGF)是由間質細胞產生的多功能細胞因子，具有強促分裂、組織形成、誘導上皮細胞遷移，侵襲及誘導血管生成等作用，這些都有利於腫瘤組織的發生與發展(Zeng Q，Chen S，You Z，et al =Hepatocyte growthfactor inhibits anoikis in head and neck squamous cell cancinoma cells byactivation of ERK and AKt signaling independ of NK-KB (J), J Biol Chem,2002,277 (28) :25203)。 1997年Date等用胰彈性蛋白酶對重組人HGF進行消化裂解，發現了一種新的全面拮抗 HGF 生物活性功能的拮抗劑-NK4 (Date K, Matsumoto k, ShimuraH, et al. HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions forhepatocyte growth factor 〔 J). FEBS Lett，1997,420 :1-6.)。NK4 作為肝細胞生長因子(h印atocyte growth factor, HGF)的拮抗劑，由HGF α -鏈的N末端發卡結構以及4個kringle結構組成，編碼序列長度1434bp，相對分子量50kDa，它能顯著抑制腫瘤細胞的生長、增殖和轉移、並可抑制血管新生(Date K, Matsumoto K, Shimura H, etal. HGF/NK4 is a specific antagonist for pleiotrophic actions of hepatocyte growthfactor FEBS Lett，1997，420 1~6 ； Date K，Matsumoto K，Kuba K，et al. Inhibition ofturn or growth and invasion by a four-kringle antagonist(HGF/NK4) for hepatocytegrowth factor Oncogene，1998，17 : 3045-3054)，體外實驗也證實NK4可抑制HGF誘導的腫瘤細胞的增殖、迀徙和侵襲(Okasora T，Jo J I，Tabata Y. Augmented anti-tumortherapy through natural targetability of macrophages genetically engineered byNK4 plasmid DNA. Gene Ther，2008，15(7)524-530)。因此NK4在腫瘤基因治療中有潛在的應用前景。
白細胞介素-2(interleukin_2，IL-2)又稱T細胞生長因子，自1976年被發現以來，許多學者對其進行了大量的研究，發現IL-2可通過提高自然殺傷細胞與LAK細胞活性，增強細胞毒性T細胞(cytotoxic tlymphocyte, CTL)對腫瘤細胞的殺傷作用，並激活腫瘤侵潤淋巴細胞從而誘導機體的抗腫瘤免疫反應，使腫瘤生長停止或瘤體減小[孫燕，張弘綱，彭民等.重組白細胞介素-2治療實體瘤及腹水III期臨床研究〔J〕.中國新藥雜誌，1998，7 C3) 171.]；以IL-2為基礎的生物治療主要通過增強機體固有抗腫瘤機制達到抑制、殺滅腫瘤細胞及根治腫瘤的目的。目前隨著分子生物學的發展，IL-2基因已經成為腫瘤基因治療的熱點，其在乳腺癌和黑色素瘤的I期臨床實驗中取得了明顯的療效(Stewart AK, Lassam NJ, Quirt IC, et al :A denovector-mediated genedelivery of interleukin—2 in metastatic breast cancer and melanoma :results ofa phase 1 clintcal trial (J) .Gene Ther，1999 ;6 (3) :350.)。以 IL-2 為基礎的生物療法也已廣泛應用於治療黑色素瘤[Arkins MB, Lotze MT，Duther JP，et al. High-dose recombinant interleukin2 therapy for patients with metastatic melanoma analysis of 270 patients treated betweer，1095 and 1993·JClinOncol，1999，17(7)； 2105-2116] ^ Sifl^ [Atial Μ, Blaise D, Marir G， etal. Consolidation treatment of adult avutilymphoblastic leukemia :a prospective, randomized trial comparing allogenic versus autologous bone marrowtransp1antation and testing the impact of tecombnant interleukin—2 afterautologous bone mattow transplantation. BGMTGroup. Blood, 1995,86(4) :1619-16 ]、腎癌、胃癌及結直腸癌、肝癌等。
腫瘤基因治療的主要障礙是不能特異性將抗腫瘤基因傳遞到腫瘤組織內。減毒沙門氏菌具有直接抗瘤活性，並且具有靶向治療載體的很多優點。Zheng等(Zheng LM, LuoX, Feng M，et al Tumor amplified protein expression therapy Salmonella as atumor-selective protein delivery vector (J. Oncol Res，2000，12(3) :127-135.)應用減毒沙門氏菌做了臨床前實驗，將菌株給多種荷瘤(鼠、人黑色素瘤，人結腸癌、肺癌、乳腺癌、肺肉瘤)小鼠，發現細菌聚集在腫瘤部位(包括轉移瘤)是其他正常部位的200-1000 倍。臨床前研究發現減毒的沙門氏菌能抑制小鼠同系和異系的移植腫瘤生長。為此，本專利綜合了目前國內外腫瘤疫苗設計的各自優勢，將基因治療、免疫治療合起來，構建同時攜帶IL-2及NK4基因的真核共表達載體的減毒沙門氏菌口服疫苗，研究其靶向治療實體瘤的效應。發明內容
本發明旨在發明同時攜帶人白細胞介素2及人肝細胞生長因子拮抗劑NK4基因的真核共表達質粒載體的減毒沙門氏菌，以口服方式進行治療，以達到預防和靶向治療實體瘤的目的，特別是涉及同時攜帶人白細胞介素2及人肝細胞生長因子拮抗劑的重組減毒沙門氏菌疫苗株在預防和靶向治療早、中、晚期結腸癌及肝癌疾病等嚴重危害人類健康的實體瘤的應用。
本發明的第一個目的是公開了一種治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗。
本發明的第二個目的在於公開了一種治療實體瘤的基因藥物組合物。
本發明的第三個目的在於公開了上述重組減毒沙門氏菌疫苗和藥物組合物在製備治療實體瘤藥物中的應用。
本發明的技術方案如下
一種治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其中，所述重組減毒沙門氏菌疫苗包含同時攜帶白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑NK4雙基因的真核表達質粒。
上述技術方案中所述的治療實體瘤的減毒沙門氏菌為臨床已用疫苗減毒沙門氏菌菌株Ty21a或其他功能相似減毒沙門氏菌。
上述技術方案中所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其中，所述真核表達質粒為同時包含白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑NK4基因的真核表達質粒 PCMV-IL-2-IRES-NK4。
上述技術方案中所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其中，所述重組減毒沙門氏菌疫苗為重組減毒沙門氏菌TPIN。
上述技術方案中所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其中，所述白細胞介素2為人白細胞介素2，所述肝細胞生長因子拮抗劑NK4基因為人肝細胞生長因子拮抗劑 NH4基因。
上述技術方案中所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗在製備治療實體瘤藥物中的應用。
一種治療實體瘤的基因藥物組合物，所述藥物組合物包括活性成分和藥學上可接受的載體，其中，所述活性成分為上述技術方案中所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗。
上述技術方案中所述的治療實體瘤的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為口服膠囊。
上述技術方案中所述的治療實體瘤的藥物組合物，其中，所述實體瘤為肝癌、胃癌或結腸癌等。
上述技術方案中所述的治療實體瘤的基因藥物組合物在製備治療實體瘤藥物中的應用。
本發明所涉及的攜帶人IL-2及NK4基因真核共表達質粒的減毒沙門氏菌疫苗株口服免疫後將對實體瘤的靶向治療起到良好的治療效果。相對於其它腫瘤生物治療劑， 我們所發明的此疫苗株最主要的優勢在於其一，選用IL-2基因與NK4基因聯合抗腫瘤 IL-2基因可通過提高機體NK和LAK細胞的活性，增強CTL對腫瘤細胞的殺傷作用，並激活腫瘤浸潤淋巴細胞從而誘導機體抗腫瘤免疫效應，使腫瘤生長停止或腫瘤消退；同時，NK4 基因可通過阻斷人肝細胞生長因子O^patocyte growth factor, HGF)的促血管形成作用進而抑制癌細胞增值、擴散作用；IL-2與NK4基因同時作用，對腫瘤發生發展的複雜的不同階段進行阻斷，使其可以發揮最大的抗腫瘤效應。其二，我們所發明的此減毒沙門氏菌疫苗菌株可特異性的將抗腫瘤基因傳遞到腫瘤組織內，同時以沙門氏菌為載體構建的此疫苗可口股免疫，使得服藥途徑方便、安全，同時該疫苗也具有較高的安全性，不會對機體造成損害。
本發明人發現聯合白細胞介素2和肝細胞因子拮抗劑NK4對於實體瘤具有甚為良好的預防和靶向治療效果。具體地說，本發明發現同時攜帶人白細胞介素2及肝細胞因子拮抗劑NK4基因的重組質粒、重組減毒沙門氏菌的製劑可局部應用或口服全身免疫以轉染 IL-2及NK4基因到腫瘤組織或細胞，得以產生IL-2及NK4，從而對於實體瘤可起到良好的免疫預防和靶向治療效果。此外，本發明通過裸鼠接種結腸癌、肝癌腫瘤及其他腫瘤細胞的動物模型試驗，應用同時攜帶人IL-2及NK4基因的減毒沙門氏菌直接灌胃的方法，發現此口服疫苗對於靶向治療實體瘤有良好的實效。此外，本發明還發現，攜帶人IL-2及NK4基因的減毒沙門氏菌可有效提高裸鼠的免疫力，作用腫瘤組織可有效抑制腫瘤組織及癌旁組織中血管的生成；並且發現攜帶人IL-2及NK4基因的減毒沙門氏菌無誘發腫瘤風險。本發明基於以上發現而得以完成。
概括地說，本發明第一方面提供了同時攜帶人IL-2及NK4基因的減毒沙門氏菌在製備用於預防靶向治療實體瘤的藥物中的用途。具體而言，本發明提供的是以減毒沙門氏菌為載體攜帶IL-2及NK4基因在製備用於基因預防靶向治療惡性腫瘤的藥物中的用途。所述的惡性腫瘤是各種實體瘤特別是結腸癌、肝癌等發病率高、嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤疾病。
在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的同時攜帶人IL-2及 NK4基因的減毒沙門氏菌是以攜帶IL-2及NK4基因的真核共表達重組質粒或重組減毒沙門氏菌的形式使用。換言之，本發明所述的攜帶人IL-2及NK4基因的減毒沙門氏菌是以同時攜帶IL-2及NK4基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌的形式使用。
在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的攜帶人白細胞介素2 和肝細胞生長因子拮抗劑基因的減毒沙門氏菌是人白細胞介素2和人肝細胞生長因子拮抗劑。本發明所述的白細胞介素2當然還可以使用鼠或者其它哺乳動物的白細胞介素2 ； 肝細胞生長因子拮抗劑也可以使用鼠或者其它哺乳動物的肝細胞生長因子拮抗劑。但本發明優選的是使用人白細胞介素2和人肝細胞生長因子拮抗劑，包括人白細胞介素2及人肝細胞生長因子拮抗劑的所有分類，例如亞類、亞組、亞群、亞族等。
在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為 PCMV-IL-2-IRES-NK4或其他攜帶IL-2及NK4基因的真核表達質粒。
在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的減毒沙門氏菌為臨床已用疫苗菌株Ty21a或其他功能相似減毒沙門氏菌。
在本發明第一方面所述用途的一個實施方案中，其中所述的實體瘤包括各種實體腫瘤特別是結腸癌、肝癌等發病率高、嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤疾病。
本發明第二方面提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑的聯合製劑和任選的藥學可接受的載體。根據本發明，所述的藥物組合物可用於預防和/或靶向治療實體腫瘤。所述的實體腫瘤特別是結腸癌、肝癌等發病率高、 嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤。
在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的白細胞介素2 和肝細胞生長因子拮抗劑是以攜帶白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌形式存在於該藥物組合物中。
在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的白細胞介素2 和肝細胞生長因子拮抗劑是人白細胞介素2和人肝細胞生長因子拮抗劑。
在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為PCMV-IL-2-IRES-NK4或其他同時攜帶IL-2及NK4基因的真核表達質粒。
在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的重組減毒沙門氏菌為臨床已用疫苗菌株Ty2Ia或其他功能相似減毒沙門氏菌。
根據本發明第二方面的藥物組合物，其可用於預防和/或靶向治療實體腫瘤特別是結腸癌、肝癌等發病率高的惡性腫瘤。
在本發明第二方面所述藥物組合物的一個實施方案中，其中所述的實體瘤特別是早中晚期結腸癌、肝癌等嚴重威脅人類健康、發病率高的惡性腫瘤。
根據本發明第二方面任一項所述藥物組合物，其為口服膠囊等。
本發明第三方面提供了一種在需要的受試者中預防和/或靶向治療實體腫瘤的方法，該方法包括給所述受試者施用治療有效量的白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑的聯合製劑。
在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑是以同時攜帶白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌的形式使用。
在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑是人白細胞介素2和人肝細胞生長因子拮抗劑。本發明所述的白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑當然還可以使用鼠或者其它哺乳動物的白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑。但本發明優選的是使用人白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑。
在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的重組質粒為 PCMV-IL-2-IRES-NK4或其他同時攜帶IL-2及NK4基因的真核表達質粒。
在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的重組減毒沙門氏菌為臨床已用疫苗菌株Ty21a或其他功能相似減毒沙門氏菌。
在本發明第三方面所述方法的一個實施方案中，其中所述的實體瘤包括各種實體腫瘤特別是結腸癌、肝癌等發病率高、嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤。
在下文中，本發明還提供了白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑基因聯合製劑的醫療用途。
本發明第四方面提供了白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑的聯合製劑在製備用於預防和/或靶向治療實體瘤藥物中的用途。具體而言，本發明提供的是白細胞介素 2和肝細胞生長因子拮抗劑的聯合製劑在製備用於基因預防和/或靶向治療實體瘤藥物中的用途。所述的實體瘤特別是結腸癌、肝癌等發病率高、嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤。
下面對本發明作進一步詳細的描述。
本領域技術人員公知，本發明使用的術語「預防」和「靶向治療，，具有它們的一般意義上的含義。
本發明使用的術語「白細胞介素2」是指哺乳動物例如人的白細胞介素2。本發明優選的白細胞介素2是人白細胞介素2。本領域技術人員清楚，「人白細胞介素2」具有本領域公知的含義。
本發明使用的術語「肝細胞生長因子拮抗劑」是指哺乳動物例如人的肝細胞生長因子拮抗劑。本發明優選的肝細胞生長因子是人肝細胞生長因子。本領域技術人員清楚， 「人肝細胞生長因子」具有本領域公知的含義。
本發明使用的術語「TPIN」是指同時攜帶IL-2基因及NK4基因真核共表達質粒載體的減毒沙門氏菌疫苗株。本發明的TPIN具備腫瘤靶向性，轉染白細胞介素2及NK4基因的效率比質粒要高，且只在局部分泌IL-2和NK4，無進入血流而引起或誘發腫瘤發展的危險和顧慮，因此具有實用的價值。另外，本發明認為聯合IL-2及NK4基因的減毒沙門氏菌 TPIN同時具有調節免疫功能並抑制腫瘤組織血管生長的作用而具有對實體瘤的治療效果， 為此，本發明進行裸鼠接種腫瘤細胞的動物試驗，並應用TPIN直接灌胃的方法觀察和鑑定療效，取得實效。
在本發明中，所述的白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑是以同時攜帶白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌的形式使用。插入的質粒為氨苄抗性的真核表達質粒，例如本發明人自行構建的PCMV-IL-2-IRES-NK4、重組減毒沙門氏菌例如本發明人構建的攜帶IL-2及NK4基因的真核共表達質粒的減毒沙門氏菌 Ty21a 的菌株 TPIN。
本發明提供了用於靶向治療實體瘤的一種新穎方法，該方法包括將同時攜帶白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌，給予癌症患者從而治療該疾病。實體瘤包括很多種，如肝癌、結腸癌等嚴重威脅人類健康的惡性實體腫瘤等。根據本發明的精神，還提供了治療上述實體腫瘤的方法，該方法包括將攜帶白細胞介素 2和肝細胞生長因子拮抗劑基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌，給予癌症患者從而治療該疾病。
本發明的藥物組合物中除了白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑外，根據需要還可含有本領域技術人員已知的製藥中常用的藥用輔助劑，例如賦形劑、穩定劑、防腐劑、 載體等。
本發明具有以下有益效果
應用本發明提供的治療方法比其他的治療手段更具有科學性，安全性、和腫瘤治療的靶向性、療效更明確。在目前尚無針對實體瘤較好臨床治療手段的情況下，本發明提供了一種新的有效治療方法，本發明的治療方法比以往的腫瘤防治手段更具有科學性，靶向性更好、安全性高、療效更明確。


1、圖1為IL-2基因的PCR擴增；
2、圖2為NK4基因的PCR擴增；
3、圖3為pCMV-IL-2酶切鑑定4、圖4為pCMV-IL-2-IRES-NK4質粒的酶切鑑定5、圖5為重組減毒沙門氏菌TPIN的PCR篩選；
6、圖6為腫瘤細胞接種2W後TPIN組和Ty21a組瘤體直徑大小對比7、圖7為PCR檢測TPIN組及Ty21a組真核表達啟動子CMV在組織中的分布8、圖8為PCR檢測TPIN組及Ty21a組真核表達啟動子CMV在組織中的分布；
9、圖9為PCR檢測各組裸鼠組織基因中IL_2基因表達水平；
10、圖10為PCR檢測各組裸鼠組織基因中NK4基因表達水平。
具體實施例方式
為使本發明的技術方案便於理解，以下結合具體實施方式
對本發明作進一步的說明。
為使本發明的技術方案便於理解，以下結合具體實施方式
對本發明作進一步的說明。
下面通過具體實施例進一步說明本發明，但是，應當理解為，這些實施例僅僅是用於更詳細具體地說明之用，而不應理解為用於以任何形式限制本發明。這些實施例描述同時攜帶白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑基因的重組質粒或重組減毒沙門氏菌的製備以及對裸鼠移植腫瘤細胞後的治療作用以進一步闡述本發明。
本發明對試驗中所使用到的材料以及試驗方法進行一般性和/或具體的描述。雖然為實現本發明目的所使用的許多材料和操作方法是本領域公知的，但是本發明仍然在此作儘可能詳細描述。本領域技術人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發明所用材料和操作方法是本領域公知的。
實施例1
ω檇帶白細胞,介素2及肝細胞,牛長因子桔杭劑NK4;S因的重_質粒 PCMV-IL-2-IRES-NK4和重組減毒沙門氏菌TPIN的構津與製備
(A) IL-2 cDNA 的克降
按文獻 艮道(Eizenberg, 0, et al. R Interleukin-2 transcripts in human and rodentbrains :possible expression by astrocytes. J. Neurochem. 1995,64(5) 1928-1936)的人白細胞介素2 (interleukin-2，IL-2) cDNA序列設計引物，在正向引物中引入BioI酶切位點，反向引物中引入MLu I酶切位點。正向引物的寡核苷酸序列為 5-gacctcgagatgtacaggatgcaactc -3, Jx. ( iJ 1^Μ^Μ^^, ψβ] % 5-cgaacgcgttcacagtgt tgagatgatgc-3，用常規分子生物學技術，從人胎盤cDNA文庫(購自Clontech公司，美國) 中通過多聚酶鏈反應(PCR)中複製人白細胞介素2(IL-2)基因。PCR參數為94°C預變性 5min，94°C 30s, 48°C 30s, 72°C lmin，循環數為 30，72°C延伸 lOmin。PCR 產物(如圖 1所示，其中M :Maker2000 ；1 :PCR產物)用Sanger雙脫氧終止法測定人IL_2cDNA序列(上海生工生物工程技術服務公司)。將測得的人IL-2 cDNA序列與文獻報導的人IL-2 cDNA序列進行比較分析表明，我們克隆的人IL-2 cDNA序列與文獻報導的人IL-2 cDNA序列完全一致，IL-2 cDNA(444bp)序列為序列表中序列1所示。
(B) NK4 cDNA 的克隆
根據PUBMED上公布的肝細胞生長因子(h印atocyte growth factor, HGF))拮抗劑NK4 cDNA序列設計引物，在正向引物中引入Ml I酶切位點，反向引物中引入Not I酶切位點。正向引物的寡核苷酸序列為5-CTG GTCGAC ATG TGG GTG ACC AAA CTC-3，反向引物的寡核苷酸序列為5-GCA GCGGCCGC TCAG ACT ATT GTA GGT GTG GT-3，從pcKH質粒中擴增得到NK4 cDNA序列，pcKH質粒為本實驗室先前構建，其構建過程如下用常規分子生物學技術，從人胎盤cDNA文庫(購自Clontech公司，美國)中通過多聚酶鏈反應(PCR)(上遊弓丨物為 5，-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3，，下遊弓丨物為 5，-tgggatccgcggccgc ctatgactgtggtacctt-3，)分離得到人HGF編碼區cDNA Ql84bp)，測序並進行綜合分析，將測得的人HGF全長cDNA序列與Gene Bank已公布的人HGF全長cDNA序列進行比較分析表明，我們克隆的人HGFcDNA序列與Gene Bank已公布的人HGF全長cDNA序列完全一致，然後將其亞克隆至我們自行改構的真核表達載體PcK的多克隆位點(BamH I, Apa I位點)， 獲得攜帶人肝細胞生長因子基因的重組載體pcKH，人肝細胞生長因子基因受CMV啟動子調控。PcK是將商業載體pcDNA3(購自^witrogen公司，美國)的氨卞抗性基因換為卡那黴素抗性基因而改構所得，將PCDNA3載體用kpl (購自！Iomega)及AvrII (購自Promega) 雙酶切，切去氨苄基因(約0. 6kb)，pEGFP-Nl (購自Invitrogen)用AvrII酶切，分別回收大片段(約4. 8kb)及小片段(1. Ikb的DNA片段，該片段含有完整的卡那黴素基因)用T4 DNA連接酶(購自BioLabs)連接，獲得卡那黴素抗性的pcDNA3載體，命名為pcK ；分別用 BamHI (購自！Iomega)和ApaI (購自！Iomega)雙酶切pcK及pSK-HGF，分別回收大片段及小片段(2. 2kb的DNA片段，該片段含有完整的人HGF基因)用T4 DNA連接酶連接，獲得攜帶人肝細胞生長因子基因的真核表達載體，含卡那黴素抗性基因，命名為pcKH。以pcKH為擴增模板通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法擴增得到NK4基因，PCR參數為94°C預變性 5min，94°C 30s,54°C 30s, 72°C 2min，循環數為 30，72°C延伸 10min。PCR產物(如圖2所示，其中M :Maker2000，1 :PCR產物)用Sanger雙脫氧終止法測定人NK4 cDNA 序列(上海生工生物工程技術服務公司)。將測得的人NK4 cDNA序列與文獻報導的人NK4 cDNA序列進行比較分析表明，我們克隆的人NK4 cDNA序列與文獻報導的人NK4 cDNA序列完全一致，NK4 cDNA序列(1434bp)為序列表中序列2所示。(C)檇帶人白細胞,介素2某因的直核表汰裁體DCMV-IL-2的制各將pIRES-SEQ 載體(購自 hvitrogen 公司)用)(ho I (購自 TaKaRa)及 MLu I (購自TaKaRa)雙酶切；同時用)(ho I (購自TaKaRa)及MLu I (購自TaKaRa)雙酶切已純化的白細胞介素2基因；酶切3小時後用凝膠電泳(凝膠回收試劑盒，購自!Iomega)分別回收線性化的PlRES質粒片段(約6. Ikb)及白細胞介素2基因片段G90bp)；回收的pIRES-SEQ 和IL-2以摩爾數比7 1混合，加入T4連接酶及連接8吐作1~，41連接1211，獲得攜帶人肝細胞生長因子基因的真核表達載體，含氨苄青黴素抗性基因，命名為pCMV-IL-2(如圖3所示，其中 M :250bp DNA Ladder ；1 :pIRES_SEQ Xhol 單酶切；2 :pCMV-IL_2 Xhol 單酶切；3 pCMV-IL-2 質粒 Xhol、Mlul 雙酶切)。用本領域的常規技術方法，將pCMV-IL-2質粒轉化常規的感受態細菌(例如大腸桿菌DH5 α )，然後大規模發酵細菌擴增質粒，離心回收菌體，採用鹼變性法提取重組質粒， 柱層析法大規模純化質粒(採用無內毒素質粒大提試劑盒，TIANGEN)，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法確定DNA的純度和含量。獲得所需的質粒用於下述實驗。(D) mm^mm^m 2基因及肝細朐,牛長因子拮抗劑nm基因的真核共表達裁體 PCMV-IL-2-IRES-NK4 的製備將步驟(C)中構建的pCMV-IL-2載體用Ml I (購自TaKaRa)及Not I (購自 TaKaRa)雙酶切；同時用Ml I (購自TaKafci)及Not I (購自TaKafci)雙酶切已純化的肝細胞生長因子拮抗劑NK4基因；酶切3小時後用凝膠電泳(凝膠回收試劑盒，購自 Promega)分別回收線性化的pCMV_IL_2質粒片段(約6. 6kb)及肝細胞生長因子拮抗劑NK4 基因片段(1471bp)；回收的pCMV-IL-2和NK4以摩爾數比5 10 1混合，加入T4連接酶及連接BUffer，4°C連接12h，獲得攜帶人肝細胞生長因子基因的真核表達載體，含氨苄青黴素抗性基因，命名為pCMV-IL-2-IRES-NK4(酶切鑑定如圖4，其中M:250bp DNA Ladder ；1 :pCMV-IL-2 Sail 單酶切；2 :pCMV-IL-2-IRES_NK4 Sail 單酶切；3 :pCMV-IL-2-IRES_NK4 質粒Mil、Notl雙酶切)。用本領域的常規技術方法，將質粒pCMV-IL-2-IRES-NK4轉化常規的感受態細菌 (例如大腸桿菌DH5 α )，然後大規模發酵細菌擴增質粒，離心回收菌體，採用鹼變性法提取重組質粒，柱層析法大規模純化質粒(採用無內毒素質粒大提試劑盒，TIANGEN)，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法確定DNA的純度和含量。獲得所需的質粒用於下述實驗。(E)重組減毒沙門氏菌TPIN的製備i、電穿孔轉化將減毒沙門氏菌Ty21a凍存菌液50 μ L接種於5ml不含抗生素的LB培養液，震蕩培養至對數生長中期(菌液A值約0. 4)，4°C條件下，4000r. mirT1離心收集菌體，用預冷的無菌去離子水洗滌細胞2次，洗滌後的細菌懸於Iml冰預冷的無菌去離子水。用電穿孔法 (Multiporator 4308 Eppendorf 電轉儀)將 pCMV_IL-2-IRES_NK4 質粒 0. 2 μ g 轉化 200 μ L 預處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2. 5kV，電容25 μ F，電阻200 Ω，放電時間0. k。 加入SOC培養基lml，37°C輕柔震蕩培養45min，塗布於含氨苄青黴素(IOOmg.!/1)固體LB 培養基平皿，37°C培養1 後各挑取2個菌落進行鑑定。ii、陽件工稈菌的篩誅從培養板挑取2個單菌落，分別接種於3mL含卡那黴素的LB培養液中，37°C震搖培養。轉入PCMV-IL-2-IRES-NK4的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過氨苄青黴素抗性、 PCR(PCR 篩選如圖 5 所示，其中 M :250bp DNA Ladder ； 1 =TPIN PCR 鑑定 IL-2 基因；2 TPINPCR鑑定NK4基因)(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV及目的基因IL_2、NK4) 及提取質粒後)(hoL、Mlul雙酶切，Sall、Notl雙酶切鑑定。擴增真核表達啟動子CMV的引物為5'-CCC agt aca tga cct tat ggg-3『, 5『-gga gac ttg gaa atcccc gt_3，， PCR 參數為94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，循環數為 30，72°C延伸 5min。擴增 IL-2 1 弓 1. Jlilf 5' -gacctcgagatgtacaggatgcaactc-3', 5' -cgaacgcgttcacagtgttga gatgatgc-3，，PCR 參數為94°C 預變性 5min，94°C 30sec,48°C 30sec,72°C 60sec，循環數為 30，72°C 終延伸 IOmin。擴增 NK4 的引物為上遊 5，-CTG GTCGAC ATG TGG GTG ACC AAA CTC-3，，下遊 5，-GCA GCGGCCGC TCAGACT ATT GTA GGT GTG GT-3，，PCR 參數為94°C預變性 5min，94°C 30sec,56°C 30sec,72°C 2min，循環數為 30，72°C延伸 lOmin。iii、工程菌TPIN的製備將攜帶IL-2及NK4基因的真核共表達載體的減毒沙門氏菌菌種(TPIN)接種於含氨苄青黴素(50yg/mL)的LB培養基中，35 37°C 8% CO2培養箱中培養24h做為一代菌種，將一代菌種接種至含完全培養基的克氏瓶中擴大培養做為二代菌種，並在無菌條件下取一代菌種和二代菌種樣塗片，革蘭氏染色後顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長鏈多，菌形一致。將二代克氏瓶菌種刮於IOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結果為1. 7 X 101°個/ mL，30L發酵罐發酵1 後3000r/min離心20min，收集菌體73g，加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置於不鏽鋼盤中冷凍乾燥，製備成無菌乾粉約23g。以下通過TPIN的藥效學實驗來說明本發明所具有的有益效果試驗例1 :IL-2及NK4重組真核共表達質粒pCMV-IL-2-IRES_NK4及重組減毒沙門氏菌TPIN在肝癌靶向治療中的效果觀察
( 一 ) TPIN對棵鼠肝癌預防效果觀察(1)實驗動物及樽型甘肅省中醫學院實驗動物中心提供的裸小鼠30隻，雄性，體重60 80克。實驗前一周購入，自由飲水與攝食。HEPG2在含10%小牛血清的RPMI1640培養基中培養。培養條件為37°C 5% CO20待小鼠口服免疫6周，空白對照組(Blank)、TPIN組、Ty21a組各取裸小鼠10隻，每隻於右腹部皮下接種5 X IO5個HEP&細胞。(2) TPIN 的應用將模型裸鼠隨機分為三組分別是空白對照組(Blank)、TPIN組、Ty21a組。將 TPIN、Ty21a分別接種於2mL含2uLAmp和無抗生素的LB培養液中，振蕩過夜，次日取50uL 加入50mL含相應抗生素的LB培養液中，池後收集菌體，PBS清洗後，用10% NaHCO3懸浮， 調整細菌數為lX109/mL。各實驗組小鼠用胃管飼服相應細菌0. lmL，Blank組服等量10% NaHCO3溶液。2周1次，共三次。(3)淋巴細胞亞群分析口服免疫6周後作外周血⑶3+⑶4+、⑶3+⑶8+T淋巴細胞亞群分析。與Ty21a組、 空白對照組比較，TPIN免疫組外周血中⑶4+、⑶4+/⑶8+比值有顯著差別(P < 0. 01)。與 Ty21a組、空白對照組比較TPIN免疫組⑶4+、⑶4+/⑶8+比值也有明顯增高(P < 0. 05)。 Ty21a免疫組與空白對照組比較⑶4+/⑶8+比值有所提高(P < 0. 05)。結果見表1。表1 口服免疫後對小鼠外周血⑶4' T、⑶8' T、⑶4' /⑶8 『比值的影響 G 土 s, %)
權利要求
1.一種治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其特徵在於所述重組減毒沙門氏菌疫苗包含同時攜帶白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑NK4雙基因的真核表達質粒。
2.根據權利要求1所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其特徵在於所述減毒沙門氏菌為減毒沙門氏菌Ty21a或其他功能相似減毒沙門氏菌。
3.根據權利要求1所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其特徵在於所述真核表達質粒為同時包含白細胞介素2和肝細胞生長因子拮抗劑NK4基因的真核表達質粒 PCMV-IL-2-IRES-NK4。
4.根據權利要求1所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其特徵在於所述重組減毒沙門氏菌疫苗為重組減毒沙門氏菌TPIN。
5.根據權利要求1 4所述的防治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗，其特徵在於 白細胞介素2為人白細胞介素2，肝細胞生長因子拮抗劑NK4基因為人肝細胞生長因子拮抗劑NH4基因。
6.權利要求1 5中任一權利要求所述的治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗在製備治療實體瘤藥物中的應用。
7.一種治療實體瘤的藥物組合物，所述藥物組合物包括活性成分和藥學上可接受的載體，其特徵在於所述活性成分為權利要求1 5中任一權利要求所述的重組減毒沙門氏菌疫苗。
8.根據權利要求7所述的治療實體瘤的藥物組合物，其特徵在於所述藥物組合物為口服膠囊。
9.根據權利要求7或8所述的治療實體瘤的藥物組合物，其特徵在於所述實體瘤為肝癌、胃癌或結腸癌等。
10.權利要求7 9中任一權利要求所述的治療實體瘤的藥物組合物在製備治療實體瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明名稱為「一種治療實體瘤的重組減毒沙門氏菌疫苗、藥物組合物及其應用」。本發明涉及細胞因子預防和靶向治療實體腫瘤的應用，白細胞介素2聯合肝細胞生長因子拮抗劑基因在製備用於預防和靶向治療實體瘤的藥物中的用途。本發明還涉及包含所述白細胞介素2聯合肝細胞生長因子拮抗劑的基因藥物組合物，以及使用所述白細胞介素2聯合肝細胞生長因子拮抗劑在需要的受試者中預防和靶向治療實體瘤的方法。根據本發明可以有益地預防和靶向治療各種實體腫瘤。
文檔編號A61P35/00GK102526760SQ20111046220
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月22日 優先權日2011年12月22日
發明者哈小琴, 尹強, 張俊, 張尚弟, 張紅賓, 惠玲, 昌業偉, 王曉輝, 王美亮, 賈慶華 申請人:中國人民解放軍蘭州軍區蘭州總醫院