一種基於紅鰭東方魨FoxO1基因的重組蛋白、製備方法及應用的製作方法

2023-06-15 09:21:21

一種基於紅鰭東方魨FoxO1基因的重組蛋白、製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於紅鰭東方魨FoxO1基因的重組蛋白、製備方法及應用，屬於生物【技術領域】。本發明根據紅鰭東方魨FoxO1蛋白的cDNA編碼序列，設計針對紅鰭東方魨FoxO1蛋白編碼序列的引物對，以ISOGEN?Reagent提取紅鰭東方魨肝臟總RNA後進行RT-PCR擴增。RT-PCR產物與pGEM-T載體連接得重組質粒，經雙酶切後目的基因再與表達載體pET-32a(+)連接，獲重組表達質粒並轉化至大腸桿菌Rosetta(DE3)中；通過IPTG誘導實現了重組蛋白的可溶性表達。本發明中的紅鰭東方魨FoxO1重組蛋白能抑制過氧化物酶體增殖體激活受體PPARγ基因的表達，調節紅鰭東方魨體內脂類代謝平衡。純化的重組產物對魚類進行活體注射或飼料添加，能改善養殖魚類的生長及降低魚的脂質含量，使肉質鮮美可口。
【專利說明】—種基於紅鰭東方鈍FoxOI基因的重組蛋白、製備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明具體涉及一種基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白，以及該重組蛋白的製備方法和應用，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]脂質是生物體的主要構成成分，與能量的貯存和細胞內信號傳導途徑等很多生理功能密切相關。魚類的主要脂質沉積部分是肝臟與肌肉，但在這兩種組織中脂質的存在的比例也隨著魚種的不同有著很大的差異，河豚魚和比目魚等魚種的脂質主要貯存在肝臟(瘦魚)，其他的魚種如真鯛和鰻魚等魚類的脂質同時存在於肝臟和肌肉(肥魚)。組織學研究表明鮭科魚的肌肉脂質主要被沉積在脂肪細胞即魚肉的肌膈上。真鯛的脂肪細胞是由前脂脂肪細胞分化而來的，並且過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisomeproliferator-activated receptors, PPARs)參與調控，雖然其參與脂肪細胞分化的詳細機制不太清楚，很可能是瘦魚和肥魚在脂肪細胞的分化過程中有不同的分子調控網絡。PPARs家族有三個成員:PPARa ,PPAR^、PPAR Y，在脂質穩態中發揮重要調控作用。PPARa和PPARP主要參與脂肪酸氧化代謝，PPARy主要參與脂肪生成。PPARy被配體激活調節脂類代謝靶基因的表達，促進脂肪沉積。
[0003]在哺乳動物及其細胞系中，叉頭轉錄因子O亞家族I (forkhead transcriptionfactor group 01，Fox01)是前體脂肪細胞分化過程的重要調控因子，通過多條通路影響細胞增殖、分化、凋亡。FoxOl可以通過阻礙PPAR Y功能複合體與DNA的結合從而抑制PPAR Y的轉錄調控活性。在大鼠脂肪組織中研究還發現FoxOl可以抑制PPAR Y基因的轉錄，降低PPARy的表達量。`
[0004]迄今，關於FoxOl在哺乳動物脂肪代謝中發揮的調節作用的研究已在人、大鼠、小鼠等哺乳動物中開展並取得了許多成果，但尚未見有關FoxOl蛋白用於調節魚類體內脂類代謝平衡的相關研究報導。研究和開發與紅鰭東方飩FoxOl蛋白相關的基因克隆及其重組表達具有極其重要的作用。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白。
[0006]同時，本發明還提供一種基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白的製備方法。
[0007]最後，本發明還提供一種基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白在製備調節紅鰭東方飩脂肪組織PPAR Y表達量的藥物組合物或飼料中的應用。
[0008]為了實現以上目的，本發明所採用的技術方案是:
[0009]一種基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白，其含有如SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列。
[0010]所述的胺基酸序列由如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列編碼。[0011]一種基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白的製備方法，包括以下步驟:
[0012](I)反轉錄PCR (RT-PCR)擴增紅鰭東方飩脂肪組織總RNA，擴增產物與pGEM_T載體連接得重組質粒，經雙酶切後目的基因再與pET-32a (+)表達載體連接，獲得重組表達質粒;
[0013](2)將重組表達質粒轉化入宿主菌，加入誘導劑IPTG誘導表達FoxOl重組蛋白。
[0014]所述的反轉錄PCR擴增的引物對P為:
[0015]h遊引物 Pl:5』 -CGGAATTCATGGCGGAAGCAGCCCA-3』 (見 SEQ ID NO:1)，
[0016]下遊引物P2:5』 -CCGCTCGAGCCCTGACACCCAGCTGTGC-3』 (見 SEQ ID NO: 2)。
[0017]所述步驟(1)中反轉錄PCR擴增的反應條件為:94°C預變性5min後進行94°C變性40s、61°C復性50s、72°C延伸2min的35個循環的擴增，72°C延伸IOmin後保存於4°C。
[0018]所述步驟(1)中反轉錄PCR擴增的反應體系為:cDNA模版Ι.Ομ 1、10μΜΡ11.0μ1、10μΜ Ρ21.Ομ 1U0XPCR Buffer for K0D-Plus_Neo2.5 μ l、dNTP Mixture(各
2.5mM) 2.0 μ 1、ddH2017.Ομ IUU/μ I KOD-Plus-Neo 高保真 DNA 聚合酶 0.5 μ 1，總計25 μ I。
[0019]所述步驟(2)中的宿主菌為大腸桿菌表達菌株Rosetta(DE3)。
[0020]所述步驟(2)中取誘導培養後的菌體裂解，離心，取上清液純化即得重組蛋白。
[0021]一種基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白在製備調節紅鰭東方飩脂肪組織PPARy表達量的藥物組合物或飼料中的應用。
[0022]本發明的有益效果:
[0023]本發明根據紅鰭東方飩FoxOl蛋白的cDNA編碼序列，設計針對紅鰭東方飩FoxOl蛋白編碼序列的引物對，以ISOGEN Reagent提取紅鰭東方飩肝臟總RNA後進行RT-PCR擴增。RT-PCR產物與pGEM-T載體連接得重組質粒，經雙酶切後目的基因再與表達載體pET-32a(+)連接，獲重組表達質粒並轉化至大腸桿菌Rosetta (DE3)中；通過IPTG誘導實現了重組蛋白的可溶性表達。該表達質粒表達的融合蛋白帶有組氨酸標籤，方便了樣品的鑑定和純化，避免了樣品的變性和復性，不但操作簡單，降低了成本，更主要的是蛋白結構不受破壞，重組蛋白純度好，得率高且不易降解，適應於工業化生產，為進一步研究紅鰭東方飩FoxOl蛋白的功能奠定基礎。
[0024]本發明中的紅鰭東方飩FoxOl重組蛋白能抑制過氧化物酶體增殖體激活受體PPARy基因的表達，調節紅鰭東方飩體內脂類代謝平衡。具體的說，有兩方面優點:(1)魚類的主要脂質沉積部分是肝臟與肌肉，但在這兩種組織中脂質的存在的比例也隨著魚種的不同有著很大的差異，FoxOl重組蛋白能夠抑制過氧化物酶體增殖體激活受體PPAR Y基因表達，以維持養殖魚脂肪代謝平衡；(2)本發明中調控魚類脂代謝調控基因表達的紅鰭東方飩FoxOl重組蛋白可應用在魚類養殖上，減少魚類脂肪沉積、改善肉品質，具有重要的經濟價值。
[0025]本發明中的紅鰭東方飩FoxOl重組蛋白具有以下應用前景:(I)紅鰭東方飩FoxOl重組蛋白用於魚類脂質代謝機制的研究。直接使用重組紅鰭東方飩FoxOl蛋白或該蛋白製備的的單克隆抗體或多克隆抗體，進行魚類及其它動物脂質代謝機制的研究。(2)紅鰭東方飩FoxOl重組蛋白用作肉質改良劑。純化的重組產物對魚類進行活體注射或飼料添加，能改善養殖魚類的生長及降低魚的脂質含量，使肉質鮮美可口。【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1為本發明實施例1中重組表達質粒Fox01-pET32的雙酶切電泳鑑定圖；
[0027]圖2為實施例4中重組表達質粒表達產物的SDS-PAGE分析圖；
[0028]圖3為實施例4中重組表達質粒誘導表達的蛋白印跡分析圖；
[0029]圖4為實施例5中FoxOl重組蛋白對紅鰭東方飩PPAR Y表達影響的柱形圖。
【具體實施方式】
[0030]下述實施例僅對本發明作進一步詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
[0031]實施例1
[0032]pET32a-Fox01原核表達質粒的構建與鑑定:
[0033]以ISOGEN Reagent提取新鮮紅鰭東方飩脂肪組織總RNA並反轉錄進行第一鏈的cDNA的合成。
[0034]根據紅鰭東方飩FoxOl蛋白基因保守序列設計針對FoxOl蛋白編碼序列的引物對，以上述第一鏈cDNA進行PCR擴增，引物對P的核苷酸序列為:
[0035]上遊引物P1: 5，~CGGAATTCEcoR 1 ATGGCGGAAGCAGCCCA-3 』，
[0036]下遊引物P2:5，-CCGCTCGAGxho 1 CCCTGACACCCAGCTGTGC-3，；
[0037]RT-PCR 反應體系為:cDNA 模版 1.Ομ IUOyM Pll.Ομ IUOyM Ρ21.Ομ 1U0XPCRBuffer for K0D-Plus_Neo2.5 μ 1、dNTP Mixture (各 2.5mM) 2.0 μ 1、ddH2017.Ομ IUU/μ IKOD-Plus-Neo高保真DNA聚合酶0.5 μ 1，總計25 μ I ;反應條件為:94°C預變性5min後進行94°C變性40s、61°C復性50s、72°C延伸2min的35個循環的擴增，72°C延伸IOmin後保存於4°C。引物對的劃線部分分別為EcoR I酶切位點和Xho I酶切位點。以紅鰭東方飩FoxOl第一鏈cDNA為模板，用PCR技術獲得目的基因，獲得單一的2049bp大小的條帶並進行回收。PCR電泳回收產物與克隆載體pGEM-T (Promaga公司)連接並轉化入大腸桿菌感受態細胞JM109，在含氨卞青黴素的LB固體培養基上培養通過藍白斑法篩選陽性克隆，並進行質粒的抽提；
[0038]用限制性內切酶EcoR I和Xho I分別雙酶切所提取的質粒和表達載體pET-32a(+)，37°C作用 2 小時後，酶切產物用 QIAquick gel extraction kit(QIAGENE 公司)回收，pGEM-T-Fox01質粒酶切產物和載體酶切產物按3:1混合，T4DNA連接酶(promaga公司)16°C過夜連接，轉化大腸桿菌感受態細胞JM109於37°C過夜培養。提取重組表達質粒pET32a_Fox01 ;用EcoR I和Xho I對重組表達質粒雙酶切鑑定，如圖1所示。測序結果表明，所測序列與其他FoxOl編碼序列同源性極高，故初步確認所提取的重組表達質粒為紅鰭東方飩FoxOl的編碼序列。
[0039]實施例2
[0040]FoxOl重組蛋白的誘導表達:
[0041]將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株Rosetta (DE3)內，培養菌株得菌液，挑取單菌落接種5mL Amp LB液體培養基過夜培養，取50 μ L過夜培養的菌液接種5mLAmp LB液體培養基，37°C 200rpm搖菌2.5小時，至0D600為0.8，所搖菌液加誘導劑IPTG至終濃度為lmM，37°C搖菌5小時後，回收菌體，即得到菌種。[0042]將所收集的菌種進行擴大培養，收集菌體。SDS-PAGE檢測對比上清、沉澱。
[0043]實施例3
[0044]FoxOl重組蛋白的分離純化:
[0045]大量誘導表達後的菌體經超聲波裂解菌體，4°C 12000rpm離心20min,分別保留上清和沉澱。上清部分使用鎳柱進行純化，先上低鹽緩衝液平衡柱材，然後上清液上柱，重懸柱材，冰浴30min，棄去流出液，15倍柱體積低鹽緩衝液洗脫，10倍柱體積高鹽緩衝液洗脫，5倍柱體積低鹽緩衝液洗脫,2倍柱體積洗脫液洗脫，收集樣品液。Western Blot檢測純化結果。
[0046]實施例4
[0047]紅鰭東方飩重組FoxOl蛋白的鑑定:
[0048]1.SDS-PAGE 電泳
[0049]配製8%的分離膠和5%的濃縮膠。將誘導前的樣品和誘導後的樣品各取50 μ L分別加入20 μ L2X SDS loading buffer混勻，沸水煮5分鐘，12000rpm離心IOmin,留取上清做SDS-PAGE。120V恆壓電泳2h、考馬斯亮藍R250染色2小時、脫色液脫色。觀察在105kDa處有明顯條帶出現。如圖2所示，圖中M:蛋白Maker ;1:pET32a(+)誘導後表達蛋白；2:pET32a-Fox01誘導裂解後的沉澱；3:pET32a-Fox01誘導裂解後的上清；4:pET32a-Fox01誘導後表達蛋白。
[0050]2.Western Blot 鑑定
[0051 ] 從SDS-PAGE膠上切下需要`轉膜的部分，並剪切6張濾紙和I張PVDF膜。把PVDF膜與濾紙浸沒於轉移緩衝液中，平衡5分鐘。按紙、膜、膠、紙的順序從陽極到陰極擺放正確，連接電源，注意正負極。根據凝膠面積按0.8mA/cm2接通電流，電轉移1.5h。轉移結束後，切斷電源，從上至下拆卸裝置，逐一拆去各層。在PVDF膜上作標記。把凝膠取出進行抗體標記。PVDF放在密封的塑膠袋中，內加封閉液和1:1000稀釋的Ant1-His Antibody (GEHealthcare)，37°C搖床中溫育lh。37°C搖床中溫育lh。取出PVDF膜，用PBS漂洗3次，每次IOmin。濾膜再用TBST漂洗IOmin。
[0052]PVDF膜放在密封的塑膠袋中，內加封閉液和1:2000稀釋的HRP標記的羊抗鼠酶標二抗。37°C搖床中溫育lh。取出PVDF膜，用PBS漂洗4次。將PVDF膜放在底物液中直到有條帶出現(一般l_5min)，取出PVDF在水中漂洗一下，放在PBS中。觀察結果，在105KDa處有一條特異性免疫條帶。如圖3所示，圖中M:蛋白Marker ；1:純化後的pET32a-Fox01。從圖3中可以看出，純化後的重組蛋白和預期的大小一致。
[0053]實施例5
[0054]FoxOl重組蛋白對紅鰭東方飩PPAR Y基因表達的影響:
[0055]對尾均重15-30克紅鰭東方飩進行體腔注射試驗，實驗前禁食24h，將紅鰭東方飩輕微麻醉後立即注射，以不注射任何試劑為陰性對照組，以注射PBS為陽性對照組，以注射重組FoxOl蛋白為試驗組,試驗組注射劑量為3 μ g/g體重,連續注射三天,每天一次,實驗一周後，取三組紅鰭東方飩脂肪組織對PPAR Y表達進行螢光定量分析。具體結果如圖4所示，注射重組FoxOl蛋白的試驗組紅鰭東方飩脂肪組織PPAR Y表達量比陽性和陰性對照組顯著降低。陽性和陰性對照組鰭東方飩PPAR Y表達量差異不顯著。因此注射FoxOl重組蛋白能降低紅鰭東方飩脂肪組織PPAR Y表達量。
【權利要求】
1.一種基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白，其特徵在於:其含有如SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列。
2.根據權利要求1所述的基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白，其特徵在於:所述的胺基酸序列由如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列編碼。
3.一種如權利要求1所述的基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白的製備方法，其特徵在於:包括以下步驟: Cl)反轉錄PCR擴增紅鰭東方飩脂肪組織總RNA，擴增產物與pGEM-T載體連接得重組質粒，經雙酶切後目的基因再與pET-32a(+)表達載體連接，獲得重組表達質粒； (2)將重組表達質粒轉化入宿主菌，加入誘導劑IPTG誘導表達FoxOl重組蛋白； 所述的反轉錄PCR擴增的引物對P為:
上遊引物 P1: 5 』 -CGGAATTCATGGCGGAAGCAGCCCA-3，，
下遊引物 P2:5』 -CCGCTCGAGCCCTGACACCCAGCTGTGC-3，。
4.根據權利要求3所述的基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白的製備方法，其特徵在於:所述步驟(1)中反轉錄PCR擴增的反應條件為:94°C預變性5min後進行94°C變性40s、61°C復性50s、72°C延伸2min的35個循環的擴增，72°C延伸IOmin後保存於4°C。
5.根據權利要求3所述的基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白的製備方法，其特徵在於:所述步驟(1)中反轉錄PCR擴增的反應體系為:cDNA模版Ι.Ομ 1、10μΜ Pll.Ομ 1、10 μ M Ρ21.Ομ 1U0XPCR Buffer2.5 μ 1、2.5mM dNTP Mixture2.0 μ 1、ddH2017.Ομ IUU/μ I DNA 聚合酶(λ 5 μ 1，總·計 25 μ I。
6.根據權利要求3所述的基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白的製備方法，其特徵在於:所述步驟(2)中的宿主菌為大腸桿菌表達菌株Rosetta(DE3)。
7.根據權利要求3所述的基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白的製備方法，其特徵在於:所述步驟(2)中取誘導培養後的菌體裂解，離心，取上清液純化即得重組蛋白。
8.一種如權利要求1所述的基於紅鰭東方飩FoxOl基因的重組蛋白在製備調節紅鰭東方飩脂肪組織PPAR Y表達量的藥物組合物或飼料中的應用。
【文檔編號】C07K14/46GK103709242SQ201310729525
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】楊志軍, 張偉, 何廣傑, 張煜, 倪天軍, 王翠玲, 石如玲 申請人:新鄉醫學院