酸－穩定性枯草蛋白酶在動物飼料中的用途的製作方法

2023-06-10 15:34:11 3

專利名稱：：酸－穩定性枯草蛋白酶在動物飼料中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及酸-穩定性枯草蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶在動物飼料中的(體內)用途，以及這種蛋白酶處理植物蛋白質的(體外)用途。蛋白質是動物和人必不可少的營養因子。大多數牲畜和很多人從植物蛋白質來源中攝取必需的蛋白質。重要的植物蛋白質來源是例如油料種子作物，豆類和穀類。例如，當在單胃動物，如豬和家禽的飼料中含有豆粉時，大部分豆粉固體不能被消化。例如，小豬和處於生長期的豬地表觀迴腸蛋白質消化能力僅為80％左右。單胃動物和多種魚的胃表現出強酸性pH。然而，大多數的蛋白質消化發生在小腸。因此，需要一種在流經胃之後仍能存活的酸-穩定性蛋白酶。
背景技術：
：從下列文獻中可以了解蛋白酶在動物飼料中的用途，或其處理植物蛋白質的用途WO95/28850公開了一種含有植酸酶和蛋白酶的動物飼料添加劑。第7頁詳細說明了多種蛋白酶。WO96/05739公開了含有木聚糖酶和蛋白酶的酶飼料添加劑。第25頁列出了適當的蛋白酶。WO95/02044公開了得自棘孢麴黴(Aspergillusaceleatus)的蛋白酶及其在動物飼料中的用途。US3966971公開了通過用酸性植酸酶並任選一種蛋白酶處理，由植物蛋白質來源獲取蛋白質的方法。第2欄中詳細說明了適當的蛋白酶。US4073884，US5047240，US3868448，US3823072和US3683069描述了得自多個鏈黴菌(Streptomyces)屬菌株的蛋白酶製品及其在動物飼料中的用途。然而，這些蛋白酶不是酸-穩定性的和/或不是枯草蛋白酶家族的蛋白酶。發明簡述本發明鑑定出的幾種蛋白酶具有很好的酸-穩定性，有望在動物飼料中具有改良的性能。這些蛋白酶屬於已知為枯草蛋白酶的蛋白酶組。附圖簡述以下將參照附圖進一步闡明本發明，其中圖1顯示了4種蛋白酶(1種得自芽孢桿菌屬(Nocardiopsis)菌種NCIMB40484的酸-穩定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶(PD498)，和3種參照蛋白酶(得自解澱粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)的Sub.Novo和Sub.Novo(Y217L)，以及SAVINASETM))在溫度為37℃，pH值範圍為pH2至pH11的條件下保溫2小時之後的pH-穩定性曲線，即殘留的蛋白酶活性；所述活性是相對於在pH9.0和5℃下保溫2小時之後的殘留活性而言的；圖2顯示了相同的4種蛋白酶在pH3至pH11的範圍內的pH-活性曲線，即蛋白酶活性，所述活性是相對於最適pH時的蛋白酶活性而言的；和圖3顯示了相同的4種蛋白酶在15℃至80℃的範圍內，pH為9.0時的溫度-活性曲線，即pH為9.0時的蛋白酶活性，所述活性是相對於最適溫度下的蛋白酶活性而言的；圖4顯示了類似於圖1的pH-穩定性曲線，不同的是蛋白酶是6種其它的酸-穩定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶，它們得自嗜鹼芽孢桿菌NCIMB10438，尖孢鐮孢IFO4471，PaecilmyceslilacinusCBS102449，麴黴屬菌種CBS102448，AcremoniumchrysogenumATCC48272，基利支頂孢ATCC20338；圖5顯示了類似於圖2的pH-活性曲線，但蛋白酶與圖4中的相同；和圖6顯示了類似於圖3的，pH為9.0時的溫度-活性曲線，但蛋白酶與圖4中的相同。發明詳述本文所用術語蛋白酶是水解肽鍵(具有蛋白酶活性)的酶。蛋白酶也被稱為例如肽酶，肽水解酶或蛋白水解酶。本發明優選使用的蛋白酶是在多肽鏈內部起作用的內在endo-型蛋白酶(內肽酶)。內肽酶對N-和C-末端被封閉的肽底物顯示出活性，所述肽底物與所述蛋白酶的特異性相關。上述的蛋白酶定義中包括屬於EC目錄(源自NC-IUBMB的酶名稱1992版，1992)EC3.4酶組(包括其13種亞-亞類的每一種)的任何酶，該目錄被定期添加和更新，具體可參見環球網(www)，網址為http∥www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。基於蛋白酶的催化機理將其分為以下幾組絲氨酸蛋白酶(S)，半胱氨酸蛋白酶(C)，天冬氨酸蛋白酶(A)，金屬蛋白酶(M)和未知的，或未被分類的蛋白酶(U)，參見蛋白酶手冊，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(編)，AcademicPress(1998)，尤其是總引言部分。術語絲氨酸蛋白酶指的是上述手冊中定義的絲氨酸肽酶及其異種集團。在1998年版的該手冊中，第1-175章涉及絲氨酸肽酶及其異種集團。在特定的實施方案中，絲氨酸蛋白酶是肽酶，其催化機理依賴於絲氨酸殘基的羥基，所述羥基作為攻擊肽鍵的親核體起作用。本文所用術語枯草蛋白酶或枯草蛋白酶家族欲包括所有SB異種集團的絲氨酸蛋白酶，尤其是其中的S8家族(上述手冊的第93章中涉及SB異種集團)。在枯草蛋白酶中，催化三聯體的順序是Asp-His-Ser。三級結構包括α-螺旋和β摺疊。SB異種集團包括內肽酶和外肽酶。已知這些肽酶可得自細菌，古細菌和真核生物；只有一個代表性例子得自DNA病毒。為了測定給定的蛋白酶是否為枯草蛋白酶，可參考上述手冊和其中所述的原理。這些檢測可對所有類型的蛋白酶進行，而不論它們是天然或野生型蛋白酶，還是經基因工程改造的或合成的蛋白酶。或者，可用SSI(鏈黴菌屬枯草蛋白酶抑制劑)進行抑制作用的研究，將枯草蛋白酶定義為當用摩爾過量的SSI抑制時，殘留活性高達10％的蛋白酶。可按實施例8所述進行該試驗。在該定義的特定實施方案中，枯草蛋白酶具有高達8％，6％或5％的殘留活性。術語「高達」被認為等於「低於或等於」。可使用任何測定法測定蛋白酶活性，所述測定法中利用了底物，底物中包括與所述蛋白酶的特異性相關的肽鍵。類似地，使pH-試驗和溫度-試驗適應於所述蛋白酶。pH值-試驗的例子是pH5，6，7，8，9，10或11。溫度-試驗的例子是25，30，35，37，40，45，50，55，60，65或70℃。蛋白酶底物的例子是酪蛋白和pNA-底物，如Suc-AAPF-pNA(可得自例如SigmaS-7388)。該pNA-底物中的大寫字母指的是單字母胺基酸密碼。另一個例子是ProtazymeAK(由MegazymeT-PRAK製備成片劑的經azurine染色的交聯酪蛋白)。pH-活性和pH-穩定性研究優選pNA-底物，而溫度-活性研究優選ProtazymeAK底物。實驗部分描述了蛋白酶檢測法的例子。對本發明所用蛋白酶的來源沒有限制。因此，術語蛋白酶不僅包括天然或野生型蛋白酶，也包括其表現出蛋白酶活性的任何突變體，變體，片段等，以及合成的蛋白酶，如經改組的蛋白酶和共有蛋白酶。可以按照本領域公知的技術，例如通過定點誘變，PCR(使用含有所需突變的PCR片段作為PCR反應中的一個引物)，或隨機誘變製備經基因工程改造的蛋白酶。共有蛋白質的製備描述於例如EP897985。本發明所用的枯草蛋白酶家族酸-穩定性蛋白酶的例子是(i)得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484，嗜鹼芽孢桿菌NCIMB10438，尖孢鐮孢IFO4471，PaecilomyceslilacinusCBS102449，麴黴屬菌種CBS102448，AcremoniumchrysogenumATCC48272和基利支頂孢ATCC20338的蛋白酶；(ii)與(i)中的任何蛋白酶具有至少70，75，80，85，90或至少95％的胺基酸同一性的蛋白酶；(iii)與SEQIDNO1，SEQIDNO2，SEQIDNO3或SEQIDNO4中的任何一個具有至少70，75，80，85，90或至少95％的同一性的蛋白酶；(iV)與SEQIDNO5(完整序列1-397，或其片斷28-397或118-397)，SEQIDNQ6(完整序列1-367，或其片斷70-367或84-367)或SEQIDNO7中的任何一個具有至少70，75，80，85，90或至少95％的胺基酸同一性的蛋白酶。為了計算同一性百分比，可以使用本領域已知的任何電腦程式，例如GCG第8版程序包中提供的GAP(ProgramManualfortheWisconsinPackage，Version8，GeneticsComputerGroup，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)(Needleman，S.B和Wunsch，C.D.，(1970)，JournalofMolecularBiology，48，443-453)。使用具有下列設置的GAP進行多肽序列比較GAP生成罰分為5.0，GAP延伸罰分為0.3。在特定的實施方案中，本發明所用的蛋白酶是微生物蛋白酶，術語微生物表示蛋白酶得自，或源自微生物，或是得自微生物的蛋白酶類似物，片段，變體，突變體，或合成的蛋白酶。可在原始的野生型微生物菌株，在另一個微生物菌株或在植物中產生或表達所述蛋白酶，即該術語覆蓋了表達野生型，天然蛋白酶，以及在任何宿主中表達重組的，經基因工程改造的或合成的蛋白酶。本文所用術語微生物包括古細菌，細菌，真菌，病毒等。微生物的例子是細菌，例如芽孢桿菌屬細菌，如芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484，嗜鹼芽孢桿菌NCIMB10438，或其表現出蛋白酶活性的突變體或變體。其它微生物的例子是真菌，例如酵母或絲狀真菌，如選自擬青黴屬，如PaecilomyceslilacinusCBS102449，麴黴屬，如麴黴屬菌種CBS102448，支頂孢屬，如AcremoniumchrysogenumATCC48272，基利支頂孢ATCC20338或鐮孢屬，如尖孢鐮孢IFO4471；或其表現出蛋白酶活性的突變體或變體。在另一個實施方案中，蛋白酶是植物蛋白酶。源自植物的蛋白酶的例子是得自瓜果果肉的蛋白酶(Kaneda等，J.Biochem，78，1287-1296(1975))。術語動物包括所有動物，包括人。動物的例子有非-反芻動物和反芻動物，如奶牛，綿羊和馬。在特定的實施方案中，動物是非-反芻動物。非-反芻動物包括單胃動物，如豬(包括但不限於小豬，處於生長期的豬和大母豬)；家禽，如火雞和雞(包括但不限於適於烤焙的小雞，蛋雞)；小牛；和魚(包括但不限於鮭魚)。術語飼料或飼料組合物指的是適於或給動物攝入的任何化合物，製劑，混合物或組合物。在本發明的應用中，可在餵食之前，之後或同時給動物飼餵蛋白酶。優選在餵食之後飼餵蛋白酶。在本發明的上下文中，術語酸-穩定性指的是於37℃，在下列緩衝液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH3.5中保溫2小時之後，稀釋度相當於A280＝1.0的純蛋白酶的蛋白酶活性至少為參照活性的40％，所述活性是使用本文實施例2C中所述的檢測法測定的(底物Suc-AAPF-pNA，pH9.0，25℃)。在上述酸-穩定性定義的特定實施方案中，蛋白酶活性至少為參照活性的45，50，55，60，65，70，75，80，85或至少為參照活性的90％。術語參照活性指的是稀釋度相當於A280＝1.0的純品形式的相同蛋白酶於5℃，在下列緩衝液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0中保溫2小時之後的蛋白酶活性，其中按上文所述測定活性。換句話說，測定酸-穩定性的方法包括下列步驟a)將待測的蛋白酶樣品(純品形式，A280＝1.0)分成兩等份(I和II)；b)於37℃，pH3.5將等份I保溫2小時；c)測定等份I的殘留活性(pH9.0和25℃)；d)於5℃，pH9.0將等份II保溫2小時；e)測定等份II的殘留活性(pH9.0和25℃)；f)計算相對於等份II之殘留活性的等份I殘留活性的百分比。或者，在上述酸-穩定性定義中，步驟b)緩衝液的pH值可以是2.0，2.5，3.0，3.1，3.2，3.3或3.4。在與上述可替換的步驟b)緩衝液的pH值相關的上述酸-穩定性定義的其它可替換的實施方案中，與參照活性相比，殘留的蛋白酶活性至少為5，10，15，20，25，30，35，40，45或至少為50％。在其它實施方案中，步驟d)緩衝液的pH值可以是6.0，6.5，7.0，7.5，8.0或8.5。在上述酸-穩定性定義中，術語A280＝1.0指的是在光程長度為1cm的樣品池中，280nm下相對於緩衝液空白對照的光吸收值為1.0時的所述純蛋白酶濃度(稀釋度)。在上述酸-穩定性定義中，術語純蛋白酶指的是A280/A260的比率大於或等於1.70(見實施例2E)，且通過掃描經考馬斯-染色的SDS-PAGE凝膠測得其掃描強度至少約為對應於所述蛋白酶之帶的掃描強度的95％(見實施例2A)的樣品。或者，A280/A260的比率大於或等於1.50，1.60，1.65，1.70，1.75，1.80，1.85，或大於或等於1.90。然而，對於本發明的應用而言，蛋白酶不必是純的；它可以例如包括其它酶，甚至其它蛋白酶，此時可將其稱為蛋白酶製品。然而，明確定義的蛋白酶製品是有利的。例如，正確確定飼料中的蛋白酶劑量則要容易得多，所述蛋白酶基本上不含幹擾的或汙染的其它蛋白酶。術語正確確定劑量特指獲得持久不變的結果的目的，和基於所需結果最優化劑量的能力。在特定的實施方案中，明確定義了添加至飼料中的，或包含在飼料添加劑中的蛋白酶。明確定義指的是經大小排阻層析測定，蛋白酶製品至少為50％純(見實施例12)。在其它特定的實施方案中，經此方法測定，蛋白酶製品至少為60，70，80，85，88，90，92，94純或至少為95％純。在其它實施方案中，術語明確定義指的是蛋白酶製品在適當大小排阻柱上的分級分離僅顯示出一個主要的蛋白酶成分。本領域技術人員會知道如何選擇適當的大小排阻層析柱。起初可以在例如AmershamPharmaciaBiotech的Hiload26/60Superdex75pg柱上分級分離蛋白酶製品(見實施例12)。如果不能清楚地分開峰，可以嘗試不同的柱(例如改變柱顆粒的大小和/或柱的長度)，和/或改變樣品的體積。通過簡單而常用的嘗試法，可以選擇出具有足夠解析度(能清楚地分開峰)的柱，以此為基礎，按實施例12所述進行純度的計算。蛋白酶製品可以(a)直接加入飼料中(或直接用於植物蛋白質的處理方法)，或(b)用於生產一種或多種隨後要添加至飼料中(或用於處理方法)的中間體組合物，如飼料添加劑或預混物。上文所述的純度指的是上述(a)或(b)用途中的原始蛋白酶製品的純度。使用重組生產方法可以特別地獲得純度為此數量級的蛋白酶製品，而當通過傳統的發酵法生產蛋白酶時，獲得它們卻並非易事，而且批與批之間的變化較大。當然可以將這種蛋白酶製品與其它酶混合。在一個特定的實施方案中，本發明所用的蛋白酶除了具有酸-穩定性外，還具有接近中性的pH-活性最適值。術語接近中性的pH-活性最適值指的是下列一個或多個pH-最適值範圍為pH6.0-11.0，或pH7.0-11.0，或pH6.0-10.0，或pH7.0-10.0，或pH8.0-11.0，或pH8.0-10.0(參見本文實施例2B和7以及圖2和5)。在另一個特定實施方案中，本發明所用的蛋白酶除了具有酸-穩定性外，還具有熱穩定性。術語熱穩定性指的是下列一個或多個溫度最適值至少為50℃，52℃，54℃，56℃，58℃，60℃，62℃，64℃，66℃，68℃，或至少為70℃，參見本文實施例2D和7以及圖3和6。在另一個特定的實施方案中，根據本文實施例4的體外模型，本發明所用的蛋白酶能溶解植物蛋白質。本文所用術語植物蛋白質指的是包括至少一種得自或源自植物的蛋白質，包括經修飾的蛋白質和蛋白質衍生物的任何化合物，組合物，製品或混合物。在特定的實施方案中，植物蛋白質的蛋白質含量至少為10，20，30，40，50或60％(w/w)。植物蛋白質可得自植物蛋白質來源，例如豆類和穀類，例如豆科(Fabaceae)，十字花科(Cruciferaceae)，藜科(Chenopodiaceae)，禾本科(Poaceae)的植物材料，如大豆粉，羽扇豆粉和油菜籽粉。在特定的實施方案中，植物蛋白質來源是豆科的一種或多種植物，如大豆，羽扇豆，豌豆或蠶豆的材料。在另一個特定的實施方案中，植物蛋白質來源是藜科的一種或多種植物，如甜菜，糖用甜菜，菠菜或奎奴亞藜的材料。植物蛋白質來源的其它例子是油菜籽和甘藍。大豆是優選的植物蛋白質來源。植物蛋白質來源的其它例子是穀類植物，如大麥，小麥，黑麥，燕麥，玉米，水稻和高粱。根據本發明，用至少一種酸-穩定性枯草蛋白酶家族的蛋白酶處理植物蛋白質，導致植物蛋白質的溶解性增加。以下是使用本發明的蛋白酶可以獲得的溶解蛋白質的百分比至少為76.8％，77.0％，77.2％，77.4％，77.6％，77.8％，78.0％，78.2％，78.4％，78.6％或至少為78.8％，參見本文實施例4的體外模型。術語溶解蛋白質基本上指將蛋白質釋放至溶液中。這種溶解可能是在蛋白酶的介導下，從通常為複合的天然組合物，如飼料的其它成分中釋放出蛋白質而引起的。溶解可被測定為相對於未經蛋白酶處理的樣品而言，可溶性蛋白質量的增加(參見本文實施例4)。在處理方法的特定實施方案中，所述蛋白酶影響，或作用於植物蛋白質或蛋白質來源，或對它們發揮其溶解作用。為此，一般將植物蛋白質或蛋白質來源懸浮於溶劑，如含水溶劑，如水中，並根據所述酶的特徵調節pH和溫度值。例如，可在使實際蛋白酶的相對活性至少為50，或60，或70，或80或90％的pH值下進行處理。類似地，例如，可在使實際蛋白酶的相對活性至少為50，或60，或70，或80或90％(本文實施例2中定義了這些相對活性)的溫度下進行處理。繼續進行酶反應，直至獲得所需結果，然後，通過例如經熱-處理步驟滅活酶，終止或不終止酶反應。在本發明處理方法的另一個特定實施方案中，蛋白酶的作用是持久的，這意味著例如蛋白酶被加入到植物蛋白質或蛋白質來源中，但其溶解作用可以說並未啟動，直至後來在需要時，一旦建立適當的溶解條件，或一旦滅活任何酶抑制劑，或使用任何其它方法延遲酶的作用時才被啟動。在一個實施方案中，處理是對動物飼料或動物飼料中所用的植物蛋白質進行預處理，即在攝入前溶解蛋白質。術語改善動物飼料的營養價值指的是改善蛋白質的可利用性，導致蛋白質提取物增加，蛋白質產量提高，和/或蛋白質的利用情況有所改善。因此增加飼料的營養價值，改善動物的生長速率和/或體重的增加和/或飼料的轉化(即相對於增加的體重而言所攝取飼料的重量)。在特定的實施方案中，與對照相比，重量至少增加101％，102％，103％，104％，105％，106％或至少增加106.6％(參見本文實施例10)。在另一個特定的實施方案中，飼料轉化至多為(或不超過)99％，98％，97.5％，97％，或至多為96.6％。這等同於飼料轉化高達99％，98％，97.5％，97％，或高達96.6％。同樣也可參照本文實施例10(與對照相比)。可以任何形式在飼料中加入蛋白酶，所述蛋白酶是相對較純的蛋白酶，或者與欲添加至動物飼料中的其它成分相混合，即為動物飼料添加劑的形式，如所謂的動物飼料預混物。動物飼料添加劑除了酸-穩定性的枯草蛋白酶家族蛋白酶外，本發明的動物飼料添加劑還含有至少一種脂溶性維生素，和/或至少一種水溶性維生素，和/或至少一種痕量礦物質，和/或至少一種宏量礦物質。另外，任選的飼料-添加劑成分有生色劑，芳香化合物，穩定劑和/或至少一種選自下列的其它酶植酸酶EC3.1.3.8或3.1.3.26；木聚糖酶EC3.2.1.8；半乳聚糖酶EC3.2.1.89；和/或β-葡聚糖酶EC3.2.1.4(EC指的是源自NC-IUBMB的酶名稱1992版，1992)，也可參見環球網(www)，網址為http∥www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。在特定的實施方案中，明確限定了這些其它酶(如同上文對蛋白酶製品所作的限定和舉例那樣，參見實施例12)。通常，脂溶性和水溶性維生素以及痕量礦物質形成所謂的欲添加至飼料中的預混物的一部分，而宏量礦物質通常被單獨加入到飼料中。當加入本發明的酸-穩定性蛋白酶時，這些組合物類型中的任一種都是本發明的動物飼料添加劑。在特定的實施方案中，動物的食物或飼料中欲包含(或按規定必須包含)本發明的動物飼料添加劑，所述添加劑的水平為0.01-10.0％；更特別地為0.05-5.0％；或0.2-1.0％(％指的是每100克飼料中添加劑的克數)。預混物中更是如此。因此，通過將相同成分在飼料中的終濃度分別乘以10-10000；20-2000；或100-500(指的是上述3個百分比包含的區間)，即可得出動物飼料添加劑，如預混物中各個成分的濃度。下表A中顯示了各個飼料成分和飼料添加劑成分合乎需要的終濃度，即在飼料中的濃度。以下是這些成分實例非-排他性的列表脂溶性維生素的例子有維生素A，維生素D3，維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的例子有維生素B12，生物素和膽鹼，維生素B1，維生素B2，維生素B6，煙酸，葉酸和泛酸鹽，如D-泛酸鈣。痕量礦物質的例子有錳，鋅，鐵，銅，碘，硒和鈷。宏量礦物質的例子有鈣，磷和鈉。下表A中列出了對這些成分的營養需求-以家禽和小豬/豬舉例。營養需求指的是應該在食物中提供所示濃度的這些成分。這些數據彙編自NRC，豬的營養需求，第9次修訂版，1988，國立研究委員會農業部動物營養學委員會豬營養學小組委員會。NationalAcademyPress，Washington.D.C.1988；和NRC，家禽的營養需求，第9次修訂版，1994，國立研究委員會農業部動物營養學委員會家禽營養學小組委員會。NationalAcademyPress，Washington，D.C.1994。在可替換的實施方案中，本發明的動物飼料添加劑含有至少一種表A中特指的單個成分。至少一種指的是一種，或兩種，或三種，或四種，依此類推直至所有13種，或所有15種單個成分中的一種或多種。更具體地，在本發明的添加劑中包含至少一種單個成分，所述成分的量能使其在飼料中的濃度處於表A第4欄，或第5欄，或第6欄所示的範圍之內。如上文所解釋的，通過將這些範圍的區限乘以10-10000；20-2000；或100-500，即可得出相應的飼料添加劑的濃度。例如，考慮到維生素A的預混含量對應於10-10000IU/kg的飼料-含量，此運算會產生下列區間100-108IU；或200-2×107IU；或1000-5×106IU/kg添加劑。表A營養需求-和優選範圍動物飼料組合物動物飼料組合物或食物具有相對較高的蛋白質含量。根據上文所述的國立研究委員會(NRC)出版物，家禽和豬的食物具有下表B第2-3欄所示的特徵。魚食具有表B第4欄所示的特徵。另外，這種魚食通常具有的粗脂肪含量為200-310g/kg。以鮭魚食舉例說明這些魚食，所述魚食是在Aquaculture，principlesandpractices，T.VR.Pillay編，BlackwellScientificPublicationsLtd.1990；Fishnutrition，第2版，JohnE.Halver編，AcademicPressInc.1989的基礎上設計的。本發明的動物飼料組合物的粗蛋白含量為50-800g/kg，另外還含有至少一種本文所要求的蛋白酶。另外，或者在(上述粗蛋白含量的)替代實施方案中，本發明動物飼料組合物所具有的可代謝能量的含量為10-30MJ/kg；和/或鈣含量為0.1-200g/kg；和/或可利用的磷的含量為0.1-200g/kg；和/或甲硫氨酸的含量為0.1-100g/kg；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸的含量為0.1-150g/kg；和/或賴氨酸的含量為0.5-50g/kg。在特定的實施方案中，可代謝能量，粗蛋白，鈣，磷，甲硫氨酸，甲硫氨酸加半胱氨酸，和/或賴氨酸的含量在下表B的範圍2，3，4或5(R.2-5)的任一個之內。如AnimalNutrition，第4版，第13章(P.McDonald，R.A.Edwards和J.F.D.Greenhalgh編，LongmanScientificandTechnical，1988，ISBN0-582-40903-9)所述，粗蛋白被計算為氮(N)乘以係數6.25，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。通過Kjeldahl法(A.O.A.C.，1984，OfficialMethodsofAnalysis14thed.，AssociationofOfficialAnalyticalChemists，WashingtonDC)測定氮含量。可在NRC出版物NutrientRequirementsofSwine(1988)pp.2-6和EuropeanTableofEnergyValuesforPoultryFeed-stuffs，Spelderholtcentreforpoultryresearchandextension，7361DABeekbergen，TheNetherlands.GrafischbedrijfPonsen&looijenbv，Wageningen.ISBN90-71463-12-5的基礎上計算出可代謝的能量。可在飼料表的基礎上計算出全部的動物食物中鈣，可利用的磷和胺基酸的食物含量，所述飼料表如Veevoedertable1997，gegevensoverchemischesamenstelling，verteerbaarheidenvoederwaardevanvoedermiddelen，CentralVeevoederbureau，Runderweg6，8219pkLelystad.ISBN90-72839-13-7。在特定的實施方案中，本發明的動物飼料組合物含有至少一種如上文所定義的植物蛋白質或蛋白質來源。在另一個特定的實施方案中，本發明的動物飼料組合物含有0-80％玉米；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麥；和/或0-70％大麥；和/或0-30％燕麥；和/或0-40％豆粉；和/或0-10％魚粉；和/或0-20％乳清。例如，可將動物食物製備成搗碎的飼料(非-粒狀)或粒狀飼料。一般將磨碎的飼料相混合，再根據所需類別的詳細說明添加足夠量的必需維生素和礦物質。加入固體或液體酶製劑。例如，一般在混合步驟之前或之中加入固體酶製劑；一般在成粒步驟之後加入液體酶製品。也可以將酶摻入飼料添加劑或預混物中。食物中最終的酶濃度範圍為0.01-200mg酶蛋白質/kg食物，例如5-30mg酶蛋白質/kg動物食物。實施例11中顯示了動物飼料組合物的例子。表B動物食物中能量，蛋白質和礦物質的數值範圍在本發明處理植物蛋白質的方法的特定實施方案中，還包括另一個步驟，即加入植酸酶。在另一個特定的實施方案中，除了聯合使用植酸酶和蛋白酶進行處理以外，也可以加入其它酶，其中這些酶選自含有其它蛋白酶，植酸酶，脂解酶和葡糖苷酶/糖酶的組。WO95/28850中描述了這些酶的例子。當然，應該使用有效量的蛋白酶，即所述量足以改善飼料的溶解性和/或改善飼料的營養價值。目前，希望以下列的一種或多種量(劑量範圍)使用酶0.01-200；或0.01-100；或0.05-100；或0.05-50；或0.10-10，所有這些範圍皆為每kg飼料中蛋白酶的mg數(ppm)。為了測定每kg飼料中蛋白酶的mg數，從飼料組合物中純化出蛋白酶，使用相關測定法(參見蛋白酶活性，底物和測定法一節)測定純化蛋白酶的比活。也使用相同的測定法測定所述飼料組合物的蛋白酶活性，在這兩個測定結果的基礎上，計算出以每kg飼料中所含蛋白酶的mg數計的劑量。使用相同的原理測定飼料添加劑中蛋白酶的mg數。當然，如果可獲得製備飼料添加劑或飼料所用的蛋白酶樣品，可測定該樣品的比活(而不必從飼料組合物或添加劑中純化蛋白酶)。很多植物含有抗-營養因子，如凝集素和胰蛋白酶抑制劑。最重要的大豆抗-營養因子是凝集素大豆凝集素(SBA)和大豆胰蛋白酶抑制劑(STI)。凝集素是以相當強的特異性與特定的含糖分子結合的蛋白質，當其被消化時，可與小腸上皮結合。這可能導致上皮細胞的存活力下降，從而使營養物質的吸收減少。SBA是糖基化的四聚體凝集素，其亞單位的分子量約為30kDa，並對N-乙醯半乳糖胺具有高親和力。胰蛋白酶抑制劑影響小腸蛋白酶解，降低其消化蛋白質的能力，也會使胰腺分泌的消化酶增加，導致以消化酶的形式損失胺基酸。胰蛋白酶抑制劑的例子有Bowman-Birk抑制劑，其分子量約為8kDa，含有7個二硫鍵，並具有兩個特異於胰蛋白酶-樣和胰凝乳蛋白酶-樣蛋白酶的抑制性環。其它例子有所謂Kunitz抑制劑因子(例如大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑，其含有一個胰蛋白酶-樣蛋白酶的結合位點，分子量約為20kDa)。已證實本發明所用的蛋白酶可以水解抗-營養因子，如SBA凝集素，胰蛋白酶抑制劑BowmanBirk抑制劑和大豆Kunitz因子。參見實施例5的實驗部分。因此，本發明還涉及酸-穩定性蛋白酶水解，或減少抗-營養因子的量的用途，所述抗-營養因子如SBA凝集素和胰蛋白酶抑制劑，如BowmanBirk抑制劑和Kunitz因子，如大豆Kunitz因子。實施例1篩選酸-穩定性蛋白酶分析多種蛋白酶在pH3時的穩定性，目的是鑑定出具有必要的穩定性，從而能流經單胃動物酸性胃的蛋白酶。通過常規的層析法，如離子交換層析，疏水作用層析和大小排阻層析(參見例如ProteinPurification，Principles，HighResolutionMethods，andApplications，Jan-ChristerJanson，LarsRyden編，VCHPublishers，1989)純化蛋白酶。按下述測定蛋白酶活性於25℃，pH9.5中將蛋白酶與1.67％Hammarsten酪蛋白保溫30分鐘，然後加入TCA(三氯醋酸)至終濃度為2％(w/w)，過濾混合物以除去沉澱物，分析濾液的游離一級氨基(在基於OPA(鄰苯二醛)的比色試驗中，通過使用絲氨酸標準，測定340nm處的光吸收值來進行檢測(BiochemischeTaschenbuchteilII，Springer-Verlag(1964)，p.93和p.102))。一個酪蛋白蛋白酶單位(CPU)被定義為在標準條件下，即25℃和pH9.5，每分鐘釋放1mmolTCA-可溶性一級氨基所需酶的量。用水將蛋白酶稀釋至活性為0.6CPU/l，分成兩等份，然後分別用100mM檸檬酸鹽緩衝液，pH3和100mM磷酸鹽緩衝液，pH7將每等份進一步稀釋至0.3CPU/l。將稀釋的樣品置於37℃保溫1小時，將20μl樣品上樣於含有1％脫脂奶的1％瓊脂糖平板的孔中。37℃保溫平板(pH7.0)過夜，測量清亮的區域。在此試驗中，42種蛋白酶表現較好。已鑑定出其中的多種蛋白酶，參見實施例2，6，7和8。這些蛋白酶都屬於絲氨酸蛋白酶的枯草蛋白酶家族。實施例2得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的枯草蛋白酶的鑑定和比較研究按WO93/24623的實施例1所述，製備得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶。鑑定的目的是研究它們相對於Sub.Novo，Sub.Novo(Y217L)和SAVINASETM而言的pH-穩定性，pH-活性和溫度-活性分布圖。Sub.Novo是得自解澱粉芽孢桿菌的枯草蛋白酶，而Sub.Novo(Y217L)是其突變體，該突變體公開於WO96/05739中。使用常規方法從野生型菌株的培養物中製備和純化Sub.Novo，並按照EP130756的實施例1-2和15-16所述製備突變體。SAVINASETM是得自克勞氏芽孢桿菌(以前是遲緩芽孢桿菌NCIB10309)的枯草蛋白酶，可購自丹麥，NovozymesA/S，Krogshoejvej，DK-2880Bagsvaerd。美國專利號3723250中描述了它的製備。實施例2A測定蛋白酶樣品的SDS-PAGE純度通過下列方法測定蛋白酶樣品的SDS-PAGE純度在置於冰上的Eppendorf管中混合40μl蛋白酶溶液(A280濃度＝0.025)與10μl50％(w/v)TCA(三氯醋酸)。在冰上放置半小時之後，離心Eppendorf管(5分鐘，0℃，14,000×g)，小心取出上清液。在沉澱中加入20μlSDS-PAGE樣品緩衝液(200μlTris-甘氨酸SDS樣品緩衝液(2×)(125mMTris/HCl，pH6.8，4％(w/v)SDS，50ppm溴酚藍，20％(v/v)甘油，得自NOVEXTM的LC2676)+160μl蒸餾水+20μlβ-巰基乙醇+20μl3M未緩衝的TrisBase(SigmaT-1503))，將管煮沸3分鐘。短暫離心Eppendorf管，將10μl樣品上樣於得自NOVEXTM的4-20％梯度Tris-甘氨酸預製凝膠(基於Laemmli化學的聚丙烯醯胺梯度凝膠，但凝膠中不含SDS(Laemmli，U.K.，(1970)自然，vol.227，pp.680-685)，EC60255)。在兩種緩衝液的槽中，用Tris-甘氨酸電泳緩衝液(2.9gTrisBase，14.4g甘氨酸，1.0gSDS，加蒸餾水至1升)，以150V的恆定電壓進行電泳，直至溴酚藍示蹤染料到達凝膠的底部。電泳之後，通過緩慢振蕩，用100ml蒸餾水將凝膠浸洗3次，每次5分鐘。然後用Gelcode_BlueStainReagent(得自PIERCE的膠狀ComassieG-250產品，PIERCE目錄號為24592)緩慢振蕩凝膠1小時，再用蒸餾水緩慢振蕩清洗8至16小時，其間更換幾次蒸餾水。最後，在兩片玻璃紙之間乾燥凝膠。用裝配有Fotolook95v2.08軟體，得自AGFA的ArcusII掃描儀掃描乾燥的凝膠，並通過具有下列(Fotolook95v2.08)設置的File/Acquire命令，將掃描圖像引入Windows介面下的圖像評價軟體CREAMTM(目錄號990001和990005，Kem-En-Tec，丹麥)Original＝Reflective，Mode＝ColorRGB，Scanresolution＝240ppi，Outputresolution＝1201pi，Scalefactor＝100％，Range＝HistogramwithGlobalselection和Min＝0和Max＝215，ToneCurve＝None，Sharpness＝None，Descreen＝None和Flavor＝None，從而產生SDS-PAGE凝膠的*.img圖形文件，用於在CREAMTM中進行評價。用菜單命令Analysis/1-D評價*.img圖形文件。用LanePlaceTool將兩條掃描線置於*.img圖形文件上一條為樣品掃描線，一條為背景掃描線。將樣品掃描線置於自上樣狹槽最下方至溴酚藍示蹤染料位置最上方的樣品泳道(含所述蛋白酶)的中間。將背景掃描線置於與樣品掃描線平行的位置，但此位置是圖形化的SDS-PAGE凝膠上沒有上樣樣品的位置，背景掃描線的起點和終點垂直於樣品掃描線的起點和終點。背景掃描線代表真實的凝膠背景。掃描線的寬度和外形未經調節。用具有中度敏感性的1-D/Scan菜單命令紀錄沿著掃描線的強度。使用1-D/Editor菜單命令，從樣品掃描中扣除背景掃描。然後選擇1-D/Results菜單命令，將通過CREAMTM軟體計算出的蛋白酶峰面積的百分比用作蛋白酶的SDS-PAGE純度。獲得下列結果實施例2BpH-活性試驗使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)獲得pH-活性分布圖。試驗緩衝液100mM琥珀酸(Merck1.00682)，100mMHEPES(SigmaH-3375)，100mMCHES(SigmaC-2885)，100mMCABS(C-5580)，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用HCl或NaOH調節至pH值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。檢測溫度25℃。在各個pH值下，將300μl蛋白酶樣品(用0.01％Triton_X-100稀釋)與1.5ml試驗緩衝液混合，使混合物的pH達到試驗緩衝液的pH。通過加入1.5mlpNA底物(50mg溶解於1.0mlDMSO中，再用0.01％Triton_X-100稀釋45倍)以開始反應，混合之後，用分光光度計監測A450的增加，作為在所述pH下蛋白酶活性的測量結果。用其它pH值的試驗緩衝液重複進行試驗，將活性的測量結果作圖為針對pH的相對活性。用最高活性(pH-最適值)使相對活性歸一化，即將pH-最適值下的活性設置為1，或100％。稀釋蛋白酶樣品以確保所有的活性測量結果都能落入該試驗的劑量-反應曲線的線性部分。實施例2CpH-穩定性試驗使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)獲得pH-穩定性分布圖。試驗緩衝液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用HCl或NaOH調節至pH值為2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0或11.0。用各個受試pH值下的試驗緩衝液稀釋各個蛋白酶樣品(溶於1mM琥珀酸，2mMCaCl2，100mMNaCl，pH6.0，A280光吸收值＞10)至A280＝1.0。於37℃將經稀釋的蛋白酶樣品保溫2小時。保溫之後，用100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0稀釋蛋白酶樣品，使所有樣品的pH為pH9.0。在以下的活性測定中，溫度為25℃。將300μl經稀釋的蛋白酶樣品與1.5mlpH9.0試驗緩衝液混合。通過加入1.5mlpNA底物(50mg溶解於1.0mlDMSO中，再用0.01％Triton_X-100稀釋45倍)以開始活性反應，混合之後，用分光光度計監測A450的增加，作為(殘留)蛋白酶活性的測量結果。在不同pH-值下進行37℃保溫，將活性的測量結果作圖為針對pH的殘留活性。用平行保溫的活性(對照)使殘留活性歸一化，其中在測定活性之前用pH9.0的檢測緩衝液將蛋白酶稀釋至A280＝1.0，5℃保溫2小時以作為其它的保溫。在測定活性之前稀釋蛋白酶樣品，以確保所有的活性測量結果都能落入該試驗的劑量-反應曲線的線性部分。實施例2D溫度-活性試驗使用ProtazymeAK片劑獲得溫度分布圖。ProtazymeAK片劑是由Megazyme製備成片劑的經azurine染色的交聯酪蛋白。試驗緩衝液100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，用NaOH調節至pH值為9.0。通過緩慢攪拌將ProtazymeAK片劑懸浮於2.0ml0.01％Triton_X-100。在Eppendorf管中混合500μl該懸浮液和500μl試驗緩衝液，將管置於冰上。加入20μl蛋白酶樣品(用0.01％Triton_X-100稀釋)。通過將Eppendorf管轉移至設置為檢測溫度的Eppendorf熱混合儀來啟動試驗。在處於最高振蕩速率的Eppendorf熱混合儀上將管保溫15分鐘。通過將管移回冰浴以終止試驗性保溫。在冰冷的離心機中將管離心幾分鐘，用分光光度計讀出上清液的A650。在此試驗中包括空白緩衝液(替代酶)。A650(蛋白酶)-A650(空白)為蛋白酶活性的測量結果。在不同溫度下進行試驗，將活性的測量結果作圖為針對保溫溫度的相對活性。用最高活性(溫度最適值)使相對活性歸一化。稀釋蛋白酶樣品，以確保所有的活性測量結果都能落入該試驗的劑量-反應曲線的接近線性部分。表1為活性最適值(pH-和溫度活性)的一覽表。圖1-3為pH-穩定性，pH-活性和溫度-活性的分布圖，表2為蛋白酶在酸性pH-值下的pH-穩定性數據的詳細比較。表1多種蛋白酶的pH-和溫度最適值表2多種蛋白酶在pH2.0至5.0之間的pH-穩定性實施例2E純化的蛋白酶樣品的光吸收純度測定A280/A260比率按下述測定純化的蛋白酶樣品的A280/A260比率。A260指的是在光程長度為1cm的樣品池中，蛋白酶樣品在260nm下相對於緩衝液空白的光吸收值。A280指的是在光程長度為1cm的樣品池中，相同蛋白酶樣品在280nm下相對於緩衝液空白的光吸收值。用緩衝液稀釋實施例2和6中所得的純化蛋白酶樣品，直至分光光度計的A280讀數落入其反應曲線的線性部分。由讀數測定A280/A260比率。獲得下列結果實施例3得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶降解大豆粉(SRM)不溶性部分的能力檢測得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶使SBM的不溶性/不能被消化的部分靠近消化酶和/或添加的外源性酶的能力。將該蛋白酶的性能與兩種按照WO95/02044所述製備的天冬氨酸蛋白酶，ProteaseI和ProteaseII相比較。所述文獻還公開了這兩種酶在飼料中的用途。ProteaseI是II型麴黴胃蛋白酶(Aspergillopepsin)類蛋白酶，ProteaseII是I型麴黴胃蛋白酶類蛋白酶(它們都是天冬氨酸蛋白酶，即非-枯草蛋白酶類的蛋白酶)，它們皆得自Aspergillusaculeatus(參見上文所述的HandbookofProteolyticEnzymes)。在模擬單胃動物消化道(包括在pH2時用胃蛋白酶處理，在pH7時用胰酶製劑處理)的過程中產生了受試底物，即所謂的豆粉殘留物。在用胰酶製劑處理的步驟中，加入了一系列高劑量的商品酶，以降解可靠近現存商品酶的SBM成分。加入以下皆可購自丹麥，NovozymesA/S的酶ALCALASETM2.4L，NEUTRASETM0.5L，FLAVOURZYMETM1000L，ENERGEXTML，BIOFEEDTMPlusL，PHYTASENOVOTML。所用SBM是粒狀的飼料用標準48％蛋白質SBM。處理後，所得豆粉殘留物中僅剩下5％的總蛋白質。FITC標記方法隨後，按下述用FITC(MolecularProbes，F-143)標記殘留物將豆粉殘留物(溼重為25g，乾重約為5g)懸浮於100ml0.1M碳酸鹽緩衝液，pH9中，40℃攪拌1小時。使懸浮液冷卻至室溫，黑暗中用5-異硫氰酸螢光素(FITC)處理過夜。通過超濾(截留分子量為10,000)除去未結合的探針。FITC-試驗使用下列測定法，用經FITC標記的豆粉殘留物檢測蛋白酶降解豆粉殘留物的能力於37℃混合0.4ml蛋白酶樣品(A280＝0.1)與0.4mlFITC-豆粉殘留物(0.2M磷酸鈉緩衝液pH6.5中的10mg/ml懸浮液)，在0小時之後，和保溫22小時之後測定相對螢光單位(RFU485/535nm；激發/監測波長)。測定RFU之前，以20,000×g離心樣品1分鐘，將250微升上清液轉移至黑色的微滴盤中。使用VICTOR1420Multilabel計數器(體外，丹麥)進行測定。RFU的一般性描述可參見IainD.Johnson，IntroductiontoFluorescenceTechniques，HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicals，MolecularProbes，RichardP.Haugland，第6版，1996(ISBN0-9652240-0-7)。通過加入0.4ml緩衝液替代酶樣品來製備空白對照樣品。RFU樣品＝ΔRFU樣品-ΔRFU空白對照，其中ΔRFU＝RFU(22小時)-RFU(0小時)所得FITC值(RFU樣品值)示於下表3。FITC值的誤差容限一般為+/-20,000。與ProteaseI和ProteaseII形成對照的是，得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶能顯著降解豆粉殘留物。表3蛋白酶降解豆粉殘留物的能力實施例4體外檢測得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶在自動化的體外消化系統(模擬單胃動物的消化)中檢測以下蛋白酶溶解玉米-SBM(玉米-豆粉)蛋白質的能力，所述蛋白酶是得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶，和其它枯草蛋白酶，如Sub-Novo，SubNovo(Y217L)，SAVINASETM和ALCALASETM。在缺乏外源性枯草蛋白酶-樣蛋白酶時保溫玉米-SBM以用作空白對照。體外系統由30個燒瓶組成，其中，先將玉米-SBM底物與HCl/胃蛋白酶保溫-模擬胃消化，隨後，與胰酶製劑保溫-模擬腸消化。在胃-保溫期結束時，取出體外消化樣品，分析溶解的蛋白質。底物使用10g玉米-SBM食物，其中玉米-SBM的比例為6∶4(w/w)。SBM中的蛋白質含量為43％(w/w)，玉米粉中的蛋白質含量為8.2％(w/w)。10g玉米-SBM食物中的蛋白質總量為2.21g。消化酶胃蛋白酶(SigmaP-7000；539U/mg，固體)，胰酶製劑(SigmaP-7545；8xU.S.P(USPharmacopeia))。體外消化方法概況酶蛋白質的測定使用S.C.Gill&PH.vonHippel，AnalyticalBiochemistry182，319-326(1989)概述的原理，基於A280值和胺基酸序列(胺基酸組成)計算蛋白酶酶蛋白質的量。體外模型的實驗方法1.稱取10g底物置於100ml燒瓶中。2.於0分鐘，在燒瓶中邊混合邊加入46ml含胃蛋白酶(3000U/g食物)的HCl(0.1M)和1ml蛋白酶(0.1mg酶蛋白質/g食物)。將燒瓶置於40℃下保溫。3.於30分鐘，測定pH。4.於45分鐘，加入16mlH2O。5.於60分鐘，加入7mlNaOH(0.39M)。6.於90分鐘，加入5ml含胰酶製劑(8.0mg/g食物)的NaHCO3(1M)。7.於120分鐘，測定pH。8.於300分鐘，測定pH。9.於330分鐘，取出30ml樣品，置於冰上，然後離心(10000×g，10分鐘，4℃)。取出上清液，儲存於-20℃。通過凝膠過濾HPLC估計溶解的蛋白質通過使用凝膠過濾HPLC定量粗蛋白(CP)，估計出體外消化樣品上清液中的溶解蛋白質含量。融化上清液，流經0.45μm的聚碳酸酯濾器(Sartorius)過濾，並用H2O稀釋(1∶50，v/v)。通過使用SuperdexPeptidePE(7.5×300mm)凝膠過濾柱(Global)的HPLC層析經稀釋的樣品。用於等度洗脫的洗脫劑是含有150mMNaCl的50mM磷酸鈉緩衝液(pH7.0)。每次層析所需洗脫劑的總體積是26ml，流速為0.4ml/min。紀錄214nm處的洗脫分布圖，通過積分法測定分布圖下的總面積。為了由經積分的面積估計蛋白質含量，用經連續稀釋的，具有已知總蛋白質含量的體外消化玉米-SBM參照樣品繪製出校準曲線(R2＝0.9993)。通過Kjeldahl法(測定氮的百分比；A.O.A.C.(1984)，OfficialMethodsofAnalysis，第14版，WashingtonDC)進行該參照樣品的蛋白質測定。結果下表4顯示了結果，即多種蛋白酶在體外對蛋白質溶解性的作用。根據體外消化反應過程中，溶解於總體積為75ml中的10g玉米-SBM食物(2.21g蛋白質)的蛋白質總量，計算出溶解蛋白質的相對量。假定蛋白質完全溶解(100％)，上清液中的蛋白質含量將為2.95％(w/v)。通過單向分析方差(p＝0.0001)來分析結果。SD＝標準差；n＝每次處理重複的次數(n＝5)。與其它蛋白酶相比，得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶對蛋白質溶解性的作用要好得多。表4A，B，C上標子母不相同的值顯者不同(P＜0.05)。實施例5降解凝集素SBA和大豆Bowman-Birk及Kunitz抑制劑檢測得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶水解大豆凝集素(SBA)和大豆Bowman-Birk及Kunitz胰蛋白酶抑制劑的能力。於37℃，pH6.5中將純的SBA(Fluka61763)，Bowman-Birk抑制劑(SigmaT-9777)或Kunitz抑制劑(大豆胰蛋白酶抑制劑，BoehringerMannheim109886)與蛋白酶保溫2小時(蛋白酶∶抗-營養因子＝1∶10，基於A280)。保溫緩衝液50mM二甲基戊二酸，150mMNaCl，1mMCaCl2，0.01％TritonX-100，pH6.5。由SDS-PAGE凝膠上本來有的SBA或胰蛋白酶抑制劑帶的消失，和低分子量降解產物的出現估計蛋白酶降解SBA和蛋白酶抑制劑的能力。用考馬斯藍染色凝膠，通過掃描測定帶的強度。下表5顯示了結果，即所降解的抗-營養因子的百分比。也期望在保溫豆粉與候選蛋白酶之後，能應用Westem技術，用抗SBA，Bowman-Birk抑制劑或Kunitz抑制劑的抗體估計蛋白酶降解大豆中的抗-營養因子的能力(參見WO98/56260)。表5實施例6製備其它酸-穩定性的枯草蛋白酶製備嗜鹼芽孢桿菌蛋白酶將嗜鹼芽孢桿菌NCIMB10438的凍幹培養物接種於搖瓶中，所述搖瓶各含有100ml具有下列組成的BPX培養基土豆澱粉100g/l，大麥粉50g/l，BAN800MG(得自NovozymesA/S)0.05g/l，酪蛋白酸鈉10g/l，豆粉20g/l，磷酸氫二鈉9g/l，PluronicPE61000.1ml/l，自來水若干。接種前，用10ml1M碳酸氫三鈉將每個搖瓶的pH調節至9.7。於30℃，以300rpm將菌株發酵4天。將此培養物接種於含100mlBPX培養基的新搖瓶中發酵3天。純化在1升燒杯中，以10000×g將培養液離心30分鐘。混合上清液，通過流經SeitzK-250縱深濾板(depthfilterplate)進行過濾以進一步澄清上清液。通過在截留分子量為3kDa的聚醚碸盒(Filtron)上進行超濾以濃縮已澄清的濾液。將濃縮的酶轉移至G25Sephadex柱(AmershamPharmaciaBiotech)上的50mMH3BO3，5mM3，3′-二甲基戊二酸，1mMCaCl2，pH7(緩衝液A)中，並上樣於已用緩衝液A平衡的Bacitracin瓊脂糖柱(UpfrontChromatographyA/S)。用緩衝液A清洗Bacitracin柱以除去未結合的蛋白質，然後使用添加有25％2-丙醇和1M氯化鈉的緩衝液A從柱上洗脫蛋白酶。集中得自Bacitracin柱的，具有蛋白酶活性的級分，通過G25Sephadex層析，將級分轉移至20mMCH3COOH/NaOH，1mMCaCl2，pH5(緩衝液B)中。將緩衝液交換的蛋白酶收集物上樣於已用緩衝液B平衡的SOURCE30S柱(AmershamPharmaciaBiotech)。用緩衝液B清洗SOURCE30S柱，然後用緩衝液B中線性遞增的NaCl梯度(0至0.5M)洗脫蛋白酶。檢測柱級分的蛋白酶活性，通過SDS-PAGE分析含蛋白酶的級分。集中純的級分，用於進一步鑑定。製備其它酸-穩定性枯草蛋白酶按照上文關於製備得自嗜鹼芽孢桿菌NCIMB10438的蛋白酶的一般性描述，使用常規方法製備尖孢鐮孢(FusariumOxysporum)IFO4471，嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)NCIMB10438，PaecilomyceslilacinusCBS102449，麴黴屬菌種(Aspergillussp.)CBS102448，AcremoniumchrysogenumATCC48272和基利支頂孢(Acremoniumkiliense)ATCC20338的蛋白酶。序列測定下列部分胺基酸序列SEQTDNO1得自AcremoniumchrysogenumATCC48272的蛋白酶的N-末端ALVTQNGAPWGLGTISHRQPGSTSYIY；SEQIDNO2得自嗜鹼芽孢桿菌NCIMB10438的蛋白酶的N-末端NQVTPWGITRVQAPTAW；SEQIDNO3得自PaecilomyceslilacinusCBS102449的蛋白酶的N-末端AYTQQPGAPWGLGRISH；SEQIDNO4得自尖孢鐮孢IFO4471的蛋白酶的N-末端ALTTQSGATWGLGTVSHRSRGS。得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶的胺基酸序列，即本文中的SEQIDNO5先前已被測定(參見美國專利5650326，SEQIDNO4，6和8)。在公開的蛋白質資料庫中檢索相關序列，揭示出以下結果SEQIDNO6Geneseqp/r65936(指的是EP6236/2甲的得自Paecilo-myceslilacinusCBS143.75的蛋白酶)-與SEQIDNO3相關；SEQIDNO7Geneseqp/r74334(指的是JP-07095882中的得自芽孢桿菌屬菌種THS-1001的蛋白酶)-與SEQIDNO2相關。根據有關用於專利程序的微生物保藏的國際認可的布達佩斯條約，按下述將Paecilomyceslilacinus和麴黴屬菌種的菌株保藏於荷蘭的CentraalbureauvoorSchimmelcultures(CBS)，P.OBox273，3740AGBaam保藏日2000年1月17日CBS保藏號麴黴屬菌種102448保藏日2000年1月17日CBS保藏號Paecilomyceslilacinus102449由NovoNordiskA/S進行保藏，後來轉讓給了Hoffmann-LaRocheAG。實施例7其它枯草蛋白酶的鑑定和比較研究製備自嗜鹼芽孢桿菌NCIMB10438，尖孢鐮孢IFO4471，PaecilomyceslilacinusCBS102449，麴黴屬菌種CBS102448，AcremoniumchrysogenumATCC48272和基利支頂孢ATCC20338的蛋白酶都是枯草蛋白酶。按實施例2所述測定蛋白酶樣品的純度。獲得下列結果n.d.＝未檢測測定法實施例2中描述了pH-活性，pH-穩定性和溫度-活性的測定法(pNA底物Suc-AAPF-pNA(SigmaS-7388)被用於所有蛋白酶的pH-活性和-穩定性分布圖，而ProtazymeAK片劑被用於溫度分布圖)。活性(pH-和溫度活性)最適值的概況見表6。pH-穩定性，pH-活性和溫度-活性的分布圖見圖4-6，蛋白酶在酸性pH-值下pH-穩定性數據的詳細比較見表7。表6多種蛋白酶的pH-和溫度最適值表7多種蛋白酶在pH2.0至5.0之間的pH-穩定性實施例8用鏈黴菌屬枯草蛋白酶抑制劑(SSI)抑制蛋白酶pNA底物抑制後，使用Suc-AAPF-pNA(Sigma_S-7388)測定殘留活性。試驗緩衝液100mM琥珀酸(Merck1.00682)，100mMHEPES(SigmaH-3375)，100mMCHES(SigmaC-2885)，100mMCABS(C-5580)，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％Triton_X-100，pH9.0。檢測溫度25℃。通過層析從白淺灰鏈黴菌FERMP-1205(S-3253)發酵上清液中純化SSI。所用SSI製品的純度超過95％-純度是通過實施例2A所述的方法測定的。或者，可從日本的Wako公司獲得SSI，其目錄號為303-05201，這種SSI是由DaiwaKaseiK.K.生產的(參見例如http∥search.wako-chem.cojp/lifedb_e/lifedocs_e/44834.asp)。在進行下述抑制試驗之前，用0.01％TritonX-100將SSI稀釋至A280濃度＝0.01。蛋白酶所用蛋白酶的純度超過95％-純度是通過實施例2A所述的方法測定的。在進行下述抑制試驗之前，用0.01％TritonX-100將蛋白酶稀釋至A280濃度＝0.010。通過下列方法測定鏈黴菌屬枯草蛋白酶抑制劑(SSI)對蛋白酶的抑制作用。將300μl蛋白酶樣品(A280濃度＝0.010)與300μlSSI(A280濃度＝0.010)和1.5ml試驗緩衝液混合。室溫下保溫15分鐘，然後通過加入1.5mlpNA底物(50mg溶解於1.0mlDMS0中，再用0.01％Triton_X-100稀釋45倍)，混合之後，用分光光度計監測A450的增加，從而測定殘留活性。作為對照(無SSI)，使用300μl0.01％TritonX-100替代SSI。用對照活性(無SSI)使殘留活性歸一化，即未被SSI抑制給出100％殘留活性，完全被SSI抑制給出0％殘留活性。獲得下列結果*未測定實施例9其它酸-穩定性枯草蛋白酶降解大豆粉(SBM)不溶性部分的能力按實施例3所述，檢測按實施例6所述製備的其它酸-穩定性枯草蛋白酶使SBM的不溶性/不能被消化的部分靠近消化酶和/或添加的外源性酶的能力。所得結果示於下表8。為了進行比較，將實施例3中所得的ProteasesI和II的結果也包括在表8中。表8其它蛋白酶降解豆粉殘留物的能力實施例10得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的酸-穩定性枯草蛋白酶對適於烤焙的小雞的生長特性的作用根據法國官方指導活動物實驗的說明，在Roche動物營養研究中心(CRNA，F-68305Village-Neuf，法國)進行試驗。性別分離的一日齡小雞(「RossPM3」)由商業孵化所提供。將小雞圈養在用鐵絲網作地面的多層雞籠中，這些雞籠被置於環境受控的室內。隨意供給飼料和自來水。第8天，按體重將小雞分組，6隻小雞為一組，對它們進行對照處理，即接受不含酶的實驗食物，或進行酶處理，即接受每kg飼料添加100mg芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶酶蛋白質的實驗食物。用12組重複每種處理，每個性別6組。在第8和29天給各組稱重。測定中間期(intermedrateperiod)的飼料消耗，計算體重增加量和飼料轉化率。實驗食物基於以玉米澱粉和豆粉(44％粗蛋白)為主要成分(表9)，所述食物由CRNA生產。在約70℃使飼料成為粒狀(壓模形狀3×20mm)。以固定量的水稀釋適當量的芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶，噴灑在粒狀的飼料上。對對照處理而言，用相同的方式使用足夠量的水進行處理。為了進行統計學評價，使用SAS包(SASInstituteInc.，1985)中的GLM程序進行方差的雙因子分析(因子處理和性別)。當表現出顯著的處理效果(p＜0.05)時，用Duncan試驗分析處理方式之間的差異。由於技術上的原因，從統計學評價中排除一籠酶處理。表2中列出了適於烤焙的小雞自第8天至第29天的生長表現的結果。在處理和性別之間不存在相互作用，因此，提供了兩種性別合併的總結果。添加有芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶的實驗食物改善了體重增加，以數字表示為增加了6.6％。添加蛋白酶也略微增加了飼料攝入(3.1％)。芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶顯著改善了適於烤焙的小雞的飼料轉化(3.4％)。考慮到玉米澱粉是很容易消化的成分，可以假定所觀察到的結果主要是由酶對豆粉的作用引起的。因此，結果表明芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶改善了豆粉的營養價值。總之，研究表明在含有大量豆粉的小雞飼料中以100mg酶蛋白質/kg飼料的量添加芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484蛋白酶可導致體重在數字上的增加，並能顯著改善飼料轉化。參考文獻EEC(1986)DirectivedelaCommissiondu9avril1986fixantlaméthodedecalculdelavaleurénérgetiquedesalimentscomposésdestinésàlavolaille.JournalOfficieldesCommunautésEuropéennes，L130，53-54。SASInstituteInc.(1985)SAS_User’sGuide，Version5Edition.CaryNC。表9實驗食物的組成1所分析的含量90.6％乾物質，45.3％粗蛋白，2.0％粗脂肪，4.9粗纖維2相當於90mg拉沙裡菌素-Na/kg飼料作為抗球蟲劑(anticoccidial)3基於所分析的營養物質的含量進行計算(EC-等式；EEC，1986)飼料成分的供貨商玉米澱粉法國RoquettesFrères，F-62136Lestrem豆粉44德國RekasanGmbH，D-07338Kaulsdorf動物脂法國FondoirsGachotSA，F-67100Strasbourg豆油法國EwocoSarl，F-68970GuemarDL-甲硫氨酸法國ProduitRocheSA，F-92521Neuilly-sur-SeineMCP法國BrenntagLorraine，F-54200Toul鹽法國MinoterieModeme，F-68560Hirsingue結合劑法國MinoterieModeme，F-68560Hirsingue預混物(AMvolchairNS4231)法國Agrobase，F-01007Bourg-en-BresseAvatec法國ProduitRocheSA，F-92521Neuilly-sur-Seine表10適於烤焙的小雞自第8天至第29天的表現兩種性別合併的結果；平均值±st.dev.一行內的平均值，如上標不同，則平均值顯著不同(p＜0.05)1由於技術上的原因，從統計學評價中排除一籠實施例11用於火雞和屬於鮭科的魚的，添加有酸-穩定性枯草蛋白酶的預混物和食物製備具有下列組成的預混物(每千克的含量)5000000IE維生素A1000000IE維生素D313333mg維生素E1000mg維生素K3750mg維生素B12500mg維生素B21500mg維生素B67666mg維生素B1212333mg煙酸33333mg生物素300mg葉酸3000mgD-泛酸鈣1666mgCu16666mgFe16666mgZn23333mgMn133mgCo66mgI66mgSe5.8％鈣在此預混物中加入按實施例2所述製備的，得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶，加入量相當於10g蛋白酶酶蛋白質/kg。按下述製備粒狀火雞起始和飼養食物，所述食物具有下表所示的組成(基於Leeson和Summers，1997，但通過使用最優化程序AGROSOFT_重新計算過，不含肉粉)，且每kg含100mg蛋白酶酶蛋白質在級聯混合器中混合磨碎的玉米，豆粉，魚粉和植物油。以10g/kg食物的量加入石灰石，磷酸鈣和鹽，以及上述預混物，接著進行混合。將所得混合物製成粒狀(用蒸汽調節，然後進行成粒步驟)。也按上文的一般性概述製備鮭魚的兩種食物。實際的組成示於下表(彙編自Refstie等(1998)，Aquaculture，vol.162，p.301-302)。通過使用Agrosoft_飼料最優化程序重新計算估計的營養物質含量。在食物中加入按實施例2所述製備的，得自芽孢桿菌屬菌種NCIMB40484的蛋白酶，加入的量相當於每kg食物100mg蛋白酶酶蛋白質。實施例12測定含蛋白酶的酶產品的純度可通過基於含蛋白酶的酶產品在大小排阻層析柱上的分級分離的方法，測定含蛋白酶的酶產品，例如商購的多-組分酶產品之類的蛋白酶製品的純度。大小-排阻層析也被稱為凝膠過濾層析，它基於多孔的凝膠基質(填充於柱中)，其孔徑大小的分布與待分離的蛋白質分子的大小相當。相對較小的蛋白質分子可從外圍的溶液中擴散至凝膠中，而較大的分子因其大小的關係而不能以相同的程度擴散至凝膠中。結果，根據大小即可分離蛋白質分子，較大的分子比較小的分子先從柱中洗脫出來。蛋白質濃度的測定用購自PIERCE的BCA蛋白質檢測試劑盒(等同於PIERCE目錄號為23225)測定含蛋白酶的酶產品中的蛋白質濃度。雙辛可寧酸的鈉鹽(BCA)是穩定的水溶性化合物，它能與鹼性環境中的一價銅離子(Cu1+)形成深紫色複合物。BCA試劑形成BCA蛋白質檢測試劑盒的基礎，該試劑盒能監測蛋白質與鹼性Cu2+反應(Biuret反應)產生的一價銅離子。此反應產生的顏色是穩定的，並且隨著蛋白質濃度的增加，而成比例的加深(Smith，P.K.(1985)，AnalyticalBiochemistry，vol.150，pp.76-85)。BCA工作溶液由50份試劑A與1份試劑B混合而成(試劑A是PIERCE目錄號23223，它在鹼性的碳酸鹽緩衝液中含有BCA和酒石酸鹽；試劑B是PIERCE目錄號23224，它含有4％CuSO4*5H2O)。將300μl樣品與3.0mlBCA工作溶液混合。於37℃保溫30分鐘，然後將樣品冷卻至室溫，讀出A490值作為樣品中蛋白質濃度的測量結果。在試驗中包括牛血清白蛋白(PIERCE目錄號23209)的稀釋液作為標準。樣品預-處理如果含蛋白酶的酶產品是固體，首先於5℃將產品溶解於/懸浮於20倍體積的100mMH3BO3，10mM3，3′-二甲基戊二酸，2mMCaCl2，pH6(緩衝液A)至少15分鐘，如果此階段的酶是懸浮液，則流經0.45μ的濾器以過濾懸浮液，給出清亮的溶液。從此時起，溶液即被處理成含蛋白酶的液體酶產品。如果含蛋白酶的酶產品是液體，首先於5℃將產品置於6-8000Da截留分子量的SpectraPor透析管(得自SpectrumMedicalIndustries，目錄號為132670)，對著100倍體積的緩衝液A+150mMNaCl(緩衝液B)透析至少5小時，以除去使含蛋白酶的液體酶產品具有高粘度的製劑化合物，所述化合物對大小-排阻層析不利。如果在透析過程中形成沉澱物，則需流經0.45μ的濾器以過濾經透析的含蛋白酶的酶產品。用上述蛋白質濃度測定法測定經透析的酶產品中的蛋白質濃度，用緩衝液B稀釋酶產品，得到準備進行大小-排阻層析的，蛋白質濃度為5mg/ml的樣品。如果經透析的酶產品的蛋白質濃度低於5mg/ml，也可以使用。大小-排阻層析用緩衝液B(流速1ml/min)平衡300mlHiLoad26/60Superdex75pg柱(AmershamPharmaciaBiotech)。將1.0ml含蛋白酶的酶樣品上樣於柱，用緩衝液B(流速1ml/min)洗脫柱。從柱的流出液中收集2.0ml級分，直至所有上樣的樣品都從柱上洗脫下來。通過適當的檢測法分析收集的級分的蛋白質濃度(參見上述蛋白質濃度測定法)和蛋白酶活性。適當檢測法的例子是Suc-AAPF-pNA試驗(參見實施例2B)。其它適當的檢測法是例如CPU試驗(參見實施例1)和ProtazymeAK試驗(參見實施例2D)。調節蛋白酶活性試驗的條件，例如pH，以儘可能多地測定經分級分離的樣品中的蛋白酶。上文所提及的檢測法的條件是適當條件的例子。其它適當的條件也在上文有關測定蛋白酶活性的章節中提到。將一個或多個蛋白酶檢測法中具有活性的蛋白質峰定義為蛋白酶峰。蛋白酶峰純度的計算方法為用峰中的蛋白質量除以所有被鑑定的蛋白酶峰中的總蛋白質量。使用上述方法將含蛋白酶的酶產品純度計算為用酸-穩定性蛋白酶峰中的蛋白質量除以所有被鑑定的蛋白酶峰中的蛋白質量。序列表序列表霍夫曼-拉羅奇有限公司(F.Hoffmann-laRocheAG)酸穩定性枯草蛋白酶在動物飼料中的用途6092.204-woDK2000002002000-02-087PatentInversion3.0127PRTAcremoniumchrysogenumATCC482721AlaLeuValThrGlnAsnGlyAlaProTrpGlyLeuGlyThrIleSer151015HisArgGlnProGlySerThrSerTyrIleTyr2025217PRT嗜鹼芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)NCIMB104382AsnGlnValThrProTrpGlyIleThrArgValGlnAlaProThrAla151015Trp317PRTPaecilomyceslilacinusCBS1024493AlaTyrThrGlnGlnProGlyAlaProTrpGlyLeuGlyArgIleSer151015His425PRT尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum)IFO44714AlaLeuThrThrGlnSerGlyAlaThrTrpGlyLeuGlyThrValSer151015HisArgSerArgGlySer205397PRT芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)NCIMB40484SIGNAL(1)..(27)peptide(118)..(397)mat_peptide(28)..5MetLysPheLysLysIleAlaAlaLeuSerLeuAlaThrSerLeuAla-25-20-15LeuPheProAlaPheGlyGlySerSerLeuAlaLysGluAlaProLys-10-5-115ProPheGlnProIleAsnLysThrLeuAspLysGlyAlaPheGluSer101520GlyGluValIleValLysPheLysAspGlyValSerLysLysAlaGln253035GlySerAlaLeuAsnLysAlaGluAlaAsnGluGlnLysAlaSerAla404550LysAspProPheGlnValLeuGluValAlaAspValAspGlnAlaVal556065LysAlaLeuGluAsnAsnProAsnValGluTyrAlaGluProAsnTyr70758085ThrPheGlnAlaThrTrpSerProAsnAspProTyrTyrSerAlaTyr9095100GlnTyrGlyProGlnAsnThrSerThrProAlaAlaTrpAspValThr105110115ArgGlySerSerThrGlnThrValAlaValLeuAspSerGlyValAsp120125130TyrAsnHisProAspLeuAlaArgLysValIleLysGlyTyrAspPhe135140145IleAspArgAspAsnAsnProMetAspLeuAsnGlyHisGlyThrHis150155160165ValAlaGlyThrValAlaAlaAspThrAsnAsnGlyIleGlyValAla170175180GlyMetAlaProAspThrLysIleLeuAlaValArgValLeuAspAla185190195AsnGlySerGlySerLeuAspSerIleAlaSerGlyIleArgTyrAla200205210AlaAspGlnGlyAlaLysValLeuAsnLeuSerLeuGlyCysGluCys215220225AsnSerThrThrLeuLysSerAlaValAspTyrAlaTrpAsnLysGly230235240245AlaValValValAlaAlaAlaGlyAsnAspAsnValSerArgThrPhe250255260GlnProAlaSerTyrProAsnAlaIleAlaValGlyAlaIleAspSer265270275AsnAspArgLysAlaSerPheSerAsnTyrGlyThrTrpValAspVal280285290ThrAlaProGlyValAsnIleAlaSerThrValProAsnAsnGlyTyr295300305SerTyrMetSerGlyThrSerMetAlaSerProHisValAlaGlyLeu310315320325AlaAlaLeuLeuAlaSerGlnGlyLysAsnAsnValGlnIleArgGln330335340AlaIleGluGlnThrAlaAspLysIleSerGlyThrGlyThrAsnPhe345350355LysTyrGlyLysIleAsnSerAsnLysAlaValArgTyr3603653706367PRTPaecilomyceslilacinusCBS143.75peptide(70)..(367)peptide(84)..(367)6AlaArgAlaProLeuLeuThrProArgGlyAlaSerSerSerSerThr151015AlaSerThrLeuSerSerSerArgThrAlaCysProSerProLeuSer202530ThrArgLeuSerAlaLeuCysProArgArgProThrAlaSerThrThr354045ThrPheSerGluAlaSerArgAsnLeuAsnAlaAsnAspLeuLysThr505560LeuArgAspHisProAspValGluTyrIleGluGlnAspAlaIleIle65707580ThrIleAsnAlaTyrThrGlnGlnProGlyAlaProTrpGlyLeuGly859095ArgIleSerHisArgSerLysGlySerThrThrTyrGluTyrAspThr100105110SerGlyGlySerGlyThrCysAlaTyrValIleAspThrGlyValGlu115120125AlaSerHisProGluPheGluGlyArgAlaSerGlnIleLysSerPhe130135140IleSerGlyGlnAsnThrAspGlyAsnGlyHisGlyThrHisCysAla145150155160GlyThrIleGlySerLysThrTyrGlyValAlaLysLysThrLysIle165170175TyrGlyValLysValLeuAspAsnSerGlySerGlySerTyrSerGly180185190IleIleSerGlyMetAspPheAlaValGlnAspSerLysSerArgSer195200205CysProLysGlyValValAlaAsnMetSerLeuGlyGlyGlyLysAla210215220GlnSerValAsnAspGlyAlaAlaAlaMetIleArgAlaGlyValPhe225230235240LeuAlaValAlaAlaGlyAsnAspAsnAlaAsnAlaAlaAsnTyrSer245250255ProAlaSerGluProThrValCysThrValGlyAlaThrThrSerSer260265270AspAlaArgSerSerPheSerAsnTyrGlyAsnLeuValAspIlePhe275280285AlaProGlySerAsnIleLeuSerThrTrpIleGlyGlyThrThrAsn290295300ThrIleSerGlyThrSerMetAlaThrProHisIleValGlyLeuGly305310315320AlaTyrLeuAlaGlyLeuGluGlyPheProGlyAlaGlnAlaLeuCys325330335LysArgIleGlnThrLeuSerThrLysAsnValLeuThrGlyIlePro340345350SerGlyThrValAsnTyrLeuAlaPheAsnGlyAsnProSerGly3553603657269PRT芽孢桿菌屬菌株(Bacillussp.)THS-10017AsnGlnValThrProTrpGlyIleThrArgValGlnAlaProThrAla151015TrpThrArgGlyTyrThrGlyThrGlyValArgValAlaValLeuAsp202530ThrGlyIleSerThrHisProAspLeuAsnIleArgGlyGlyValSer354045PheValProGlyGluProSerTyrGlnAspGlyAsnGlyHisGlyThr505560HisValAlaGlyThrIleAlaAlaLeuAsnAsnSerIleGlyValVal65707580GlyValAlaProAsnAlaGluLeuTyrAlaValLysValLeuGlyAla859095AsnGlySerGlySerValSerSerIleAlaGlnGlyLeuGlnTrpThr100105110AlaGlnAsnAsnIleHisValAlaAsnLeuSerLeuGlySerProVal115120125GlySerGlnThrLeuGluLeuAlaValAsnGlnAlaThrAsnAlaGly130135140ValLeuValValAlaAlaThrGlyAsnAshGlySerGlyThrValSer145150155160TyrProAlaArgTyrAlaAsnAlaLeuAlaValGlyAlaThrAspGln165170175AsnAsnAsnArgAlaSerPheSerGlnTyrGlyThrGlyLeuAsnIle180185190ValAlaProGlyValGlyIleGlnSerThrTyrProGlyAsnArgTyr195200205AlaSerLeuSerGlyThrSerMetAlaThrProHisValAlaGlyVal210215220AlaAlaLeuValLysGlnLysAsnProSerTrpSerAsnThrGlnIle225230235240ArgGlnHisLeuThrSerThrAlaThrSerLeuGlyAsnSerAsnGln245250255PheGlySerGlyLeuValAsnAlaGluAlaAlaThrArg26026權利要求1.至少一種酸-穩定性蛋白酶在動物飼料中的用途，其中所述蛋白酶(i)是屬於枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當用SSI抑制時，殘留活性低於10％。2.至少一種酸-穩定性蛋白酶在製備用於動物飼料的組合物中的用途，其中所述蛋白酶(i)是屬於枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當用SSI抑制時，殘留活性低於10％。3.權利要求1的用途，其中所述蛋白酶的劑量是每kg飼料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白質。4.權利要求2的用途，其中蛋白酶的所需劑量是每kg飼料0.01-200mg蛋白酶酶蛋白質。5.改善動物飼料的營養價值的方法，其中在所述飼料中添加至少一種酸-穩定性蛋白酶，其中所述蛋白酶(i)是屬於枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當用SSI抑制時，殘留活性低於10％。6.動物飼料添加劑，其含有(a)至少一種酸-穩定性蛋白酶；和(b)至少一種脂溶性維生素，和/或(c)至少一種水溶性維生素，和/或(d)至少一種痕量礦物質，和/或(e)至少一種宏量礦物質；其中所述蛋白酶(i)是屬於枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當用SSI抑制時，殘留活性低於10％。7.權利要求6的動物飼料添加劑，其中蛋白酶的量相當於每kg飼料需添加0.01-200mg蛋白酶蛋白質。8.權利要求6-7中任一項的動物飼料添加劑，其進一步含有植酸酶，木聚糖酶，半乳聚糖酶，和/或β-葡聚糖酶。9.動物飼料組合物，其粗蛋白含量為50-800g/kg，且含有至少一種酸-穩定性蛋白酶，其中所述蛋白酶(i)是屬於枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當用SSI抑制時，殘留活性低於10％。10.權利要求9的動物飼料組合物，其中所述蛋白酶的量為每kg飼料0.01-200mg蛋白酶蛋白質。11.處理植物蛋白質的方法，包括在至少一種植物蛋白質或蛋白質來源中添加至少一種酸-穩定性蛋白酶的步驟，其中所述蛋白酶(i)是屬於枯草蛋白酶家族；和/或(ii)當用SSI抑制時，殘留活性低於10％。12.權利要求11的方法，其中所述至少一種植物蛋白質來源中包括大豆。全文摘要枯草蛋白酶家族的酸－穩定性蛋白酶，它們在含有所述蛋白酶的動物飼料，飼料－添加劑和飼料組合物中的用途，以及使用所述蛋白酶處理植物蛋白質的方法。文檔編號A23J3/34GK1398161SQ0180470公開日2003年2月19日申請日期2001年2月5日優先權日2000年2月8日發明者彼得·R·奧斯特加爾德,卡斯滕·肖霍姆,安娜－瑪麗·克倫特申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司