一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物及可視化試劑盒的製作方法

2023-06-10 15:31:56

專利名稱：一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物及可視化試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及豬感染乙型腦炎病毒的快速檢測試劑盒及引物。
背景技術：
流行性乙型腦炎病毒又稱日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV),簡稱乙腦病毒，所引起的疾病簡稱乙腦，乙腦是一種人畜共患的病毒性傳染病，可以感染人類和多種動物，可以導致人的中樞神經系統疾病和豬的繁殖障礙，嚴重危害著人類的健康和畜牧業的發展。乙腦病原學實驗室診斷方法可以檢測病例的腦組織、胎兒、胎盤以及體液等中的病毒抗原。目前的診斷方法有:免疫細胞化學法、反向被動血凝試驗、螢光抗體染色法和RT-PCR技術。日本長崎大學運用基因擴增的傳統方法，發展了實時環介導逆轉錄等溫擴增技術(reverse transcription loop-mediatedisothemal amplification,RT-LAMP),檢測JEV的敏感性可以達到IPFU。然而，上述現有技術仍存在著缺點和不足:①實驗結果的判斷不夠迅速直觀需要貴重儀器設備，不利於推廣檢出效率還不夠高。

發明內容
本發明的主要目的是，針對上述現有技術存在的缺陷提供一種可以用肉眼迅速判定實驗結果，並利用環引物加強反應的檢測試劑盒。為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:—對檢測豬流行性乙型腦炎病毒的環引物，其應用於環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)中，其特徵在於，該對環引物包括:上遊環引物(FL)，其序列如序列表SEQ ID N0.5 所示:5』-CAGAAITTTCCTGGnTTCCCTGA-3』 ；下遊環引物(BL)，其序列如序列表SEQ ID N0.6 所示:5』-GGTGGTAGCAGCAGAAATGGCA-3，。一組檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物，其應用於環介導逆轉錄等溫擴增技術(RT-LAMP)中，其特徵在於，該組引物包括:上遊內部引物(FIP)，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示:5』 -CGCTGCTGGATAGCGTCCTT GAATTCGTGC TAGATTTGCA CCCTGG-3』 ；下遊內部引物(BIP)，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示:5』 -AAGAACAGCTGTGTTGGCAC CGGATATCGT ACTGGGAGCC CT-3』 ；上遊外部引物(F3)，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示:5』 -ACACCCCAAACATGTTGAGA-3』 ；下遊外部引物(B3)，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示:5』 -CTCTCTGCACTGCTGAAGTT-3』 ；上遊環引物(FL)，其序列如序列表SEQ ID N0.5 所示:5』-CAGAAITTTCCTGGnTTCCCTGA-3』；下遊環引物(BL)，其序列如序列表SEQ ID N0.6 所示:5』-GGTGGTAGCAGCAGAAATGGCA-3，。檢測豬流行性乙型腦炎病毒的可視化試劑盒，其特徵在於，其組成為:10 X Thermopol 反應緩衝液；10mmol /T, dNTPs ；乙腦病毒總RNA ；上遊內部引物FIP，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示；下遊內部引物BIP，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示；上遊外部引物F3，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示；下遊外部引物B3，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示；上遊環引物FL，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示；下遊環引物BL，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示；Bst DNA聚合酶大 片段；AMV反轉錄酶；20 X SYBR Green I ；DEPC ddH20。如上所述的可視化試劑盒在非活體樣品的豬流行性乙型腦炎病毒檢測中的應用，其特徵在於，其步驟為:(I)在反應管中加入以下組分並混勻:10 X Thermopol 反應緩衝液，2.5 U L ；待測樣品總RNA5.25 U L，陽性對照反應管中則加入陽性樣品總RNA5.25 U L ；8U/管Bst DNA聚合酶大片段，IuL ；AMV 反轉錄酶 0.25 ii L ;10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ；20pmol/管上遊內部引物，0.8iiL ;20pmol/管下遊內部引物，0.8iiL ;5pmol/管上遊外部引物,0.2 ii L ;5pmol/管下遊外部引物,0.2 ii L ;20pmol/管上遊環引物，0.L ;20pmol/管下遊環引物，0.L ;DEPC ddH20 補齊至 25 ii L ;(2)置於42°C下保溫30min，進行逆轉錄反應；(3)置於6(T65°C下保溫3(T90min，進行LAMP擴增反應；(4)置於 80°C下 IOmin,滅活 Bst DNA 聚合酶；(5)懸置I ii L20XSYBR Green I於反應管蓋，將之彈入反應液中並混勻；(6)將反應管置於紫外透射儀下，可見綠色螢光產生則待測樣品為陽性。
如上所述的應用，步驟(4)後得到的LAMP擴增反應產物也可以利用凝膠成像系統進行檢測，其特徵在於:在檢測時，使用TAE/TBE緩衝液試驗伴侶配製瓊脂膠，添加約20g/LGoldView 核酸染料染色，對反應產物進行電泳檢測，電泳(260V/2000mA)約45分鐘，觀察結果，出現如圖4所示的特異條帶則待測樣品為陽性。本發明的有益效果為:本發明提供了一種豬乙型腦炎病毒診斷環引物加強型可視化試劑盒，同時提供了一種檢測程序簡單、靈敏度和特異性較高的基因檢測手段。本發明設計並使用了 RT-LAMP引物和環引物，優化反應體系，結果判定實現可視化，環引物加強反應。對豬乙型腦炎檢測診斷防治具有較大意義。


圖1為NS3基因保守區LAMP擴增結果。圖2為LAMP擴增後產物的可視化結果，a為可見光下的結果，b為紫外光下的結果。圖3為LAMP擴增後產物的酶切鑑定結果。圖4為不同反轉錄時間的LAMP擴增結果。圖5為不同反應時間LAMP擴增的結果。圖6為NS3基因的LAMP檢測特異性凝膠成像結果。圖7a、b、c依次為RT-LAMP、RT-PCR和螢光RT-PCR的檢測結果圖。圖8為乙型腦炎病毒檢測實時RT-LAMP螢光走勢圖。
具體實施例方式一、JEV NS3基因保守區的LAMP擴增:以JEV總RNA為模板，用本發明提供的引物進行JEV NS3基因保守區的擴增，反應體系為:25 U L反應體系中含有:IOXThermopol 反應緩衝液(NEB 公司)，2.L ；JEV 總 RNA5.25 U L ；8U/管Bst DNA聚合酶大片段(NEB公司)，IiiL;AMV 反轉錄酶(NEB 公司)0.25 ii L ;10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ；20pmol/ 管上遊內部引物(FIP)，0.8 ii L ；20pmol/ 管下遊內部引物(BIP)，0.8 ii L ；5pmol/ 管上遊外部引物(F3)，0.L ；5pmol/ 管下遊外部引物(B3)，0.2 ii L ；20pmol/ 管上遊環引物(FL)，0.4 ii L ；

20pmol/ 管下遊環引物(BL)，0.4 ii L ；(上述引物均為寶生物工程(大連)有限公司合成)DEPC ddH20 補齊至 25 ii L。
按上述反應體系分多組進行實驗，各組一同在42°C下逆轉錄反應30min後；然後分別在溫度為63°C、64°C、65°C的水浴鍋中保溫進行LAMP擴增反應Ih，80°C下滅活Bst DNA聚合酶IOmin後，進行電泳檢測；檢測結果顯示，在63°C、64°C條件下，都能擴增到條帶，電泳條帶呈梯狀分布，與理論結果相符，陰性對照的擴增結果只有引物聚體帶出現。如圖1所示，M道為DNA分子量標記DL2000 ;1、2、3道分別為63°C、64°C、65°C條件下的擴增結果；4道為陰性對照。若在反應管中加入L20X的SYBR Green I，可見陽性管出現黃綠色，陰性管為褐色。將加入了 20X的SYBR Green I的反應管放置到紫外燈下照射，陽性反應管發出螢光，而陰性對照無明顯變化。4000rpm離心30s後，可見陽性管的反應液有明顯白色沉澱，這是因為擴增後形成的焦磷酸離子和溶液中的鎂離子結合而形成焦磷酸鎂沉澱所致。如圖2所示，N管為陰性對照，P管為LAMP的擴增產物。
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二、LAMP擴增產物的酶切鑑定:擴增的產物是環狀的重複的長度不等的啞鈴狀的DNA雙鏈，需經酶切後產生大小特異的條帶以進一步驗證其LAMP擴增的特異性。酶切反應的反應體系為:25 U L反應體系中含有:IOX內切酶反應緩衝液，2 ii L ；EcoR I 酶，I U L ;RT-LAMP 的擴增產物，5u L ；ddH20 補至 25 U L。將上述反應物混勻離心後，37 °C反應2h。反應後取5iiL反應液，用含0.5iig/mL的EB的2%瓊脂糖凝膠電泳對酶切反應產物進行檢測。LAMP擴增產物酶切鑑定的結果如圖3所示，其中M道為DNA分子量標準DL2000 ； I道為NS3基因LAMP擴增後產物經EcoR I酶消化後的結果；2道為NS3基因LAMP擴增後產物。理論上，LAMP擴增產物存在兩個EcoRI內切酶位點，酶切後生成兩種產物，大小分別為IlObp和130bp。由圖3可見，檢測結果與理論值相符。三、逆轉錄時間的優化:將反應物分為六組，一同放入42 °C水浴鍋中反應，分別在反應後Omin、IOmin、20min、30min、40min和50min後取出，再在63°C反應lh，待反應產物全部取出後，取5 y L反應液，用含0.g/mL EB的2%瓊脂糖凝膠電泳對反應產物進行檢測。電泳檢測結果如圖4所示，其中，M道為DNA分子量標準DL2000 ;1_6道分別為反轉錄時間為Omin、10min、20min、30min、40min和50min的反應物；7道為陰性對照。由圖4結果可見，省略逆轉錄步驟會對後續的等溫擴增有一定的影響，但逆轉錄反應10-50min後，不同的逆轉錄時間對後續的反應沒有顯著的影響。四、LAMP擴增反應時間的優化:在相同的反轉錄條件下，採用不同反應時間進行環介導等溫擴增，反應結果如圖5所示，其中，M道為DNA分子量標準DL2000 ；1道為陰性對照；2_5道分別為NS3基因在反應30min、40min、50min、60min後的LAMP擴增結果。由圖5結果可見:在反應時間為30min左右時，可見微弱的梯狀條帶；反應時間在30-60min之間時，梯狀條帶逐漸變亮；反應時間在60min左右時，梯狀條帶表現最明顯。因此，LAMP擴增反應的最佳時間為60mim。五、特異性試驗:分別提取豬瘟病毒、豬偽狂犬病毒、豬細小病毒、藍耳病病毒、口蹄疫病毒、豬圓環2型病毒的RNA或DNA，用本發明的RT-LAMP試劑盒及方法進行檢測。檢測結果如圖6所示，其中M道為DNA分子量標準DL2000 ；1道為流行性乙型腦炎病毒；2道為陰性對照；3道為豬瘟病毒；4道為豬偽狂犬病毒；5道為豬細小病毒；6道為藍耳病病毒；7道為口蹄疫病毒；8道為豬圓環2型病毒；9道為豬丹毒；10道為豬大腸桿菌。由圖6結果可見，本發明的試劑盒及檢測方法特異性較好，與其它疾病沒有交叉反應。六、敏感性對比實驗:取JEV總RNA (8.13 X 108PFU/mL),按5倍比例連續稀釋後，將各組RNA分別應用於RT-LAMP、RT-PCR和螢光定量PCR反應。其中:RT-LAMP的實驗條件與具體實施方式
第一部分相同。RT-PCR所用引物為:JE-E-Pl:5，-TGCTGTTGGTCGCTCCGG CT TA-3，；JE-E-P2:5， -TGTCAATGGCACATCCAGTG-3，；使用一步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司，大連)，按說明書進行操作。螢光定量PCR使用螢光定量PCR試劑盒(華銀公司，廣州)，按說明書進行操作。如圖7a_c所示，RT-LAMP的檢測極限為稀釋57倍，RT-PCR的檢測極限為稀釋55倍，螢光定量PCR為53倍(結果顯示稀釋53倍的檢測結果出現華銀公司試劑盒陽性判定曲線)。因此，RT-LAMP比RT-PCR大約敏感25倍，比螢光定量PCR大約敏感625倍。七、乙型腦炎病毒檢測的實時RT-LAMP方法:按照具體實施方式
第一部分記載的方法配製反應體系，在反應管中添加I u LQuant-1T PicoGreen,置於 Roche LightCycle2.0 螢光定量 PCR 儀中，每隔 I 分鐘收集一次螢光。結果如圖8所示。結果表明，在反應的第37分鐘，螢光值開始迅速上升。在反應I小時左右，螢光值達到最大值。結果與具體實施方式
第四部分中的LAMP擴增時間梯度電泳圖基本一致。八、本發明RT-LAMP檢測方法對不同JEV毒株的檢測結果:
採用本發明RT-LAMP方法對SA14-14-2株、SA103株、⑶06株3株不同毒株的檢測結果均為陽性。且與RT-PCR檢測結果一致。說明本發明的RT-LAMP試劑盒及檢測方法在病毒流行性乙型腦炎病毒的檢測中具有較好的適用性和應用前景。
權利要求
1.一對檢測豬流行性乙型腦炎病毒的環引物，其特徵在於，該對環引物包括: 上遊環引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下遊環引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示。
2.一組檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物，其特徵在於，該組引物包括: 上遊內部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 下遊內部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.2所示； 上遊外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 下遊外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 上遊環引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下遊環引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示。
3.檢測豬流行性乙型腦炎病毒的可視化試劑盒，其特徵在於，其組成為: IOXThermopol反應緩衝液；`10mmol /T, dNTPs ； 乙腦病毒RNA ； 上遊內部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.1所示； 下遊內部引物，其序列如序列`表SEQ ID N0.2所示； 上遊外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.3所示； 下遊外部引物，其序列如序列表SEQ ID N0.4所示； 上遊環引物，其序列如序列表SEQ ID N0.5所示； 下遊環引物，其序列如序列表SEQ ID N0.6所示； Bst DNA聚合酶大片段； AMV反轉錄酶； 20XSYBR Green I ；DEPC ddH20。
4.如權利要求3所述的可視化試劑盒在非活體樣品的豬流行性乙型腦炎病毒檢測中的應用，其特徵在於，其步驟為: (I)在反應管中加入以下組分並混勻: `10 X Thermopol 反應緩衝液，2.5 u L ； 待測樣品總RNA5.25 u L，陽性對照反應管中則加入陽性樣品總RNA5.25 u L ； 8U/管Bst DNA聚合酶大片段，IuL ； AMV反轉錄酶0.25u L ；10mmol /T, dNTPs, 2.5 U L ； 20pmol/管上遊內部引物,0.8 u L ； 20pmol/管下遊內部引物,0.8 u L ； 5pmol/管上遊外部引物，0.2uL； 5pmol/管下遊外部引物，0.2uL； 20pmol/管上遊環引物,0.4u L ； 20pmol/管下遊環引物,0.4u L ； DEPC ddH20 補齊至 25u L ；(2)置於42°C下保溫30min，進行逆轉錄反應；(3)置於6(T65°C下保溫3(T90min，進行LAMP擴增反應；(4)置於80°C下IOmin,滅活BstDNA聚合酶；(5)懸置Iii L20XSYBR Green I於反應管蓋，將之彈入反應液中並混勻；(6)將反應管置於紫 外透射儀下，可見綠色 螢光產生則待測樣品為陽性。
全文摘要
本發明提供了一組檢測豬流行性乙型腦炎病毒的引物，包括上遊內部引物、下遊內部引物、上遊外部引物、下遊外部引物、上遊環引物和下遊環引物，其序列依次如序列表SEQ ID No.1-6所示。本發明還提供了包含該組引物的檢測豬流行性乙型腦炎病毒的可視化試劑盒及利用該試劑盒檢測非活體樣品上是否含有豬流行性乙型腦炎病毒的方法。本發明提供的引物、試劑盒和檢測方法，優化了反應體系，結果判定實現了可視化，對豬乙型腦炎檢測診斷防治具有較大意義。
文檔編號C12Q1/70GK103103294SQ20131005376
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月19日 優先權日2013年2月19日
發明者林志雄, 田純見, 何曉明, 羅瓊, 魚海瓊, 羅長保, 陳茹, 劉志玲, 王宏, 吳曉薇, 畢英佐, 馬靜雲 申請人:廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心