用於酶活性確定的磁性生物傳感器的製作方法

2023-06-10 09:06:51 1

專利名稱：用於酶活性確定的磁性生物傳感器的製作方法
技術領域：
本發明涉及檢測或診斷領域，具體而言，涉及用於體內和體外應用中 的生物分子診斷。更具體而言，本發明涉及一種使用磁性粒子來執行酶法 測定的磁感測設備。
背景技術：
在診斷領域中，例如醫學診斷領域中，將傳感器用於執行所有種類的 測定。在這些測定中，可以確定特定目標材料的濃度。測定還用於監測酶 轉化。
公知的目標的實例是DNA、 RNA、肽、蛋白質、藥物、病原體、激素、 糖和細胞物質。在測定中通常使用標記來進行目標濃度的確定。當前所用 的標記是光學標記和螢光標記。
在特定疾病的檢測中，希望確定在複雜生物樣品中的酶活性。不是所 有測定設備都適合於此，針對以下內容可能出現問題測定的靈敏度、非 特異性結合、過慢的結合，其導致對所測量的酶活性得到不準確的結果、 或者複雜的預純化步驟，其不是用戶友好性的。
而且，許多用於確定酶活性的已知的測定使用人造底物，其在與酶發 生反應吋提供顏色效果。該顏色效果用於確定酶活性。對於指定的酶，會 難以找到這種人造底物，因此希望提供一種測定，其不完全依賴於獲得這 種人造底物。
本發明的目的是提供一種感測設備，其克服了這些缺陷中的一個或多個。

發明內容
我們意外發現，磁性傳感器非常適用於酶法測定。
因此，本發明的一個方面涉及一種方法，用於使用磁性傳感器來確定酶活性。本發明的另一方面涉及一種適用於該方法的設備。由以下的詳述，並結合附圖，其藉助於實例來說明本發明，本發明的 這些及其它方面會變得顯而易見。引用的參考標記涉及附圖。


圖1示出了酶(1)修飾底物(2)來形成產物(3)的實施例。圖2示出了酶(1)降解底物(2)來形成產物(3)的實施例。圖3示出了結合組分(4)偶聯於傳感器表面(6)的實施例。圖4示出了底物(2)到產物(3)的轉化導致底物切割並且該底物隨後不再結合到固定結合組分(4)的實施例。圖5示出了底物固定在固體表面，並且結合組分(4)固定在傳感器表面的實施例。圖6示出了進行了磁標記的結合組分(9)結合酶的實施例。圖7—10示出了捕獲機制的一個具體實施例，在此，酶被進行了磁標記的結合組分(9)捕獲，並施加磁場來將捕獲的酶吸引到表面，該表面包含固定在其上的底物。
具體實施方式
在當指代單數名詞時使用了不定冠詞或定冠詞時，例如"一"、"這個"， 這就包括多個該名詞，除非明確表述了是另一種情況。應注意，在本說明書和權利要求書中所用的術語"包括"不應被詮釋 為限於之後所列出的裝置；其不排除其它元件或步驟。本發明涉及磁性傳感器的使用，磁性傳感器用於分析酶活性。該方法 尤其適用於分析在複雜生物樣品中存在的酶的活性。使用本發明的優點在 於，其省去了對於樣品的多種預純化方法的需求。磁性傳感器用於酶活性確定的另一有利特徵在於，可以在反應期間， 直接確定酶促反應的動力學，因此，當前的使用和方法也適於酶一底物親 合力確定。在本發明中，磁性傳感器被定義為傳感器設備，其使用磁性標記來確認特定組分的存在。
Zhao等人(Angew Chew Intl Ed 2003， 42， No 12, 1375-1378頁)公開了磁 性粒子在酶法測定中的使用。檢測是基於磁性粒子簇的形成，用1.5T超導 磁體以MR成像來對磁性粒子簇進行成像。這個MR成像設備沒有包含在 根據本發明的磁性傳感器設備的定義中。根據本發明的設備檢測結合到傳 感器表面的磁性標記的存在。
我們將在本發明的具體實施例的範圍內論述本發明。 根據一個方面，本發明涉及一種使用磁性傳感器設備分析酶活性的方 法，其中，通過使用結合組分(4)和磁性標記(5)來確定酶(1)修飾底物(2)來形 成產物(3)的活性，該方法包括以下步驟
(a) 在傳感器表面上固定底物(2)或結合組分(4)，
(b) 使所述底物(2)與所述酶(l)接觸，
(c) 向所述結合組分或所述底物提供磁性標記，
(d) 使所述結合組分與底物(2)或產物(3)相接觸，以允許將所述結合組分 (4)直接或間接連接到所述底物(2)或所述產物(3)，
(e) 用磁性傳感器檢測所述磁性標記。
可以以任何適當的順序來執行這些步驟。在該方法的優選實施例中， 在使底物與酶相接觸之前，固定底物或結合組分(步驟a)。
優選地，在單獨的製備步驟中，向結合組分或底物提供磁性標記。 在優選的事件順序中，在步驟(a)、 (b)之後執行步驟(d)、 (e)。 在本發明的步驟中，向結合組分和/或底物提供磁性標記。優選地，在 標記與結合組分或底物之間的鍵是共價鍵，但其它類型的鍵，例如氫鍵， 也是可以的。
磁性標記也被稱為磁珠或磁性粒子。磁性標記優選是球形的，但這不 是對全部實施例的要求。其它適合的形狀例如是圓柱形、棒形、立方體和 橢圓形。
藉助於術語"磁性標記"，可以理解該標記包括一種或多種磁性粒子的 任何適當的形式，例如磁性的、反磁性的、順磁性的、超順磁性的、鐵磁 性的，其是永久地或暫時地在磁場中產生磁偶極子的磁性的任何形式。適 合的磁性標記材料的實例是Fe304珠。磁性標記的尺寸在大多數實施例中都不是重要的，但對於許多生物傳 感器應用來說，非常優選的標記是小尺寸的。優選的磁性標記具有從1到
3000nm的尺寸(通常以最長的直徑來表示)，更優選的是從5到500nm，再 更優選的從10到300nm，最優選的從30到250nm。
磁性標記的檢測通常藉助於電場、磁場或電磁場的施加來進行。 本發明涉及酶活性的確定。可以用該方法來確定其活性的適合的酶例 如是從包含以下的組中選出的caspase類、蛋白酶類、激酶類。該方法及 使用尤其適於確定需要輔因子的酶的活性，輔因子存在於包含該酶的生物 樣品中，但其可能不會倖免於大量的預純化過程，與磁檢測相比，該過程
對於其它檢測方法而言是常用的。
酶會存在於專門為此準備的樣品(7)中，或者可以是待分析的"原料" 的一部分，以確定其相對於特異性底物的酶活性。所要求權利的方法的一 個優點在於，"原料"，例如包括血液和尿液在內的體液的預純化無需獲得 可靠的數據。
酶的活性通常以單位來表示。單位通常定義為在特定時幀(分鐘或小時) 中轉化特定量(摩爾或克)的底物所需要的酶的量。比活性也可以表示為單位 /樣品體積。
在本發明中，"降解酶"被定義為輔助將底物(2)切割為產物(3)的酶(例 如，肽鏈內切酶或核酸內切酶)或將底物(2)分解為產物(3)的酶(例如鏈肽端 解酶(exopeptidase)或核酸外切酶(exonuclease))為產物(3)的酶，其中產物(3) 是降解產物。通常切割導致至少兩個產物部分的釋放。
在該方法中，本發明的使用和設備，使用了結合組分。"結合組分"是 以可測量的強度結合另一組分的組分，該強度大於非特異性結合的強度。
結合組分可以是肽或蛋白質，具有對底物或產物的結合親和性。結合 組分的實例是抗體或其功能片段及衍生物，例如Fab片段、單鏈Fv、 VHH、 重鏈抗體。抗體可以指非蛋白質化合物，以及蛋白質或肽。結合組分優選 以高特異性、高親和力結合，優選與底物或產物的鍵合能夠經受測定條件。 結合組分的其它實例是受體蛋白質、配體、適體、寡核苷酸、或這些中任 一種的功能片段或衍生物。
在本發明的優選實施例中，底物是蛋白質或肽，因為它們易於通過酶促反應轉化為產物。可選的底物是其它生物或化學物質，例如核酸、脂類、 碳水化合物和螯合劑。圖1示出了本發明的第一種優選實施例。在該實施例中，確定了酶(l)修飾底物(2沐形成產物(3)的活性。在該具體實施例中，將底物(2)固定在傳 感器表面(6)上。包含底物修飾酶(1)的樣品(7)與傳感器表面相接觸。根據反 應條件，但假定這些是正確的，底物(2)會在某種程度上被轉化為產物(3)， 除非該酶是完全無活性的。在該實施例中，產物(3)保持附著到傳感器表面。 採用磁性標記對結合組分(4)進行標記。結合組分(4)特異性結合產物(3)，該 產物保持固定在傳感器表面上。磁性傳感器，例如嵌入在傳感器表面中的 磁阻傳感器，可以檢測磁性粒子與標記的結合。產物(3)的量以及由此的酶 的活性與檢測到的標記的量成比例。樣品(7)優選的是流體樣品。水性組合物非常適用於該方法。在可替換實施例中，結合組分(4)不直接結合產物(3)，而是結合初級結 合組分(8)，該初級結合組分(8)直接結合產物(3)。在此情況下，在初級結合 部分(8)被暴露並偶聯於連接到另一結合組分(4)的磁體之後，可以進行檢測。 該實施例的實例包括以下方法其中，經由配體/結合物(binder)相互作用， 例如生物素-鏈親和素、半抗原/抗半抗原、或地高辛/抗地高辛相互作用，初 級結合部分與攜帶磁性標記的結合部分相互作用。在圖2中示出了另一實施例。在該實施例中，底物(2)被酶(1)降解。在 該實施例中，會難以測量由在與酶接觸後由降解產生的產物。因此，在該 實施例中，結合組分直接或間接地結合底物。在此情況下，底物就是所謂 的未修飾的底物。在與含酶的樣品(7)進行溫育之後發現的結合組分的量與 存在於樣品中的酶活性逆相關。在該實施例中，優選的是，磁性標記連接 到結合組分。在更優選的實施例中，結合組分直接結合底物。在可替換實施例中，本發明涉及一種使用磁性傳感器設備分析酶活性 方法，其中，確定了酶(1)修飾底物(2)以形成產物(3)的活性，該方法包括以 下步驟(a) 固定能夠結合底物(2)或產物(3)的結合組分，(b) 提供具有磁性標記的底物(2)，(c) 使底物(2)與所述酶接觸，(d) 使結合組分與底物(2)或產物(3灘接觸，以允許將結合組分(4)直接或 間接地連接到底物(2)或產物(3)，
(e) 用傳感器優選的是磁性傳感器來檢測磁性標記。 該實施例的一個方面在圖3中示出。在該實施例中，底物直接或間接
偶聯於磁性標記，結合組分(4)偶聯於傳感器表面(6)。結合組分特異性結合 仍包含磁性標記的產物(3)。結合組分(4)不結合或以低得多的程度結合底物 (2)。該方法尤其適用於小底物。在不希望受任何理論的限制的情況下，認 為該方法減小了傳感器表面的酶一底物相互作用的位阻。
在圖4中說明了另一實施例。在該實施例中，能夠結合帶有磁性標記(5) 的底物(2)的結合組分(4)被固定在傳感器表面。底物與包含酶(l)的樣品相接 觸。底物(2)轉化為產物(3)導致底物的切割，其不再結合所述結合組分。在 反應後檢測到的磁性標記的量與存在於樣品中的酶活性逆相關。該實施例 尤其適用於降解酶的活性的分析。
因此，在優選實施例中，本發明涉及一種如上確定的方法，其中
(a) 酶是降解酶，並且
(b) 結合組分結合底物(2)
(c) 酶促降解反應導致組分(3b)的形成，其包含磁性標記，且不結合所述 結合組分。
在另一實施例中，為了提供對反應條件和底物、產物及酶的濃度的更 好的控制，底物與結合組分(4)都固定在表面上。優選地，它們每一個都固 定在彼此接近的不同表面上，更優選地，所述表面基本上是彼此平行並彼 此相對的。
該實施例的特徵在於
a) 底物(2)與結合組分(4)固定在表面上，
b) 所述底物包括磁性標記，
c) 酶活性導致底物的降解，從而使得產物(3)包含磁性標記，
d) 產物(3)結合所述結合組分(4)，結合組分(4)優選地位於朝向固定有底 物的傳感器表面的一個表面上。
在該實施例中，優選的是，底物固定在固體表面上，結合組分(4)固定 在傳感器表面上，以便能夠檢測結合到產物(3)的磁性標記，產物(3)結合所述結合組分(4)。在圖5中示出了該實施例。任選地在該實施例中，具有磁性標記的第二結合組分(9)結合酶。這允 許人們通過施加磁場以捕獲酶或者將其帶入到傳感器的特定空間中，來掌 控該反應。這在圖6且更具體地在與圖7 — 10中示出。在圖6中，結合酶(1)的結合組分(9)偶聯於磁性粒子，並捕獲酶。其優 點在於，可以在傳感器系統中進行完整的分離，這就允許在可獲得各酶的 亞型的特異性結合組分的情況下，區分各種亞型的酶的活性。圖7_10示出了捕獲機制的一個具體實施例。該方法允許辨別具有同 種酶活性的不同酶(例如唾液澱粉酶和胰澱粉酶)的活性。在圖7中，磁性標 記的結合組分捕獲目的酶。隨後施加磁場，來將捕獲的酶吸引到包含固定 的底物的表面。沒有被捕獲到的酶未被吸引到該表面，並在該步驟被洗掉。 通過刺激，可以將捕獲的酶帶向包含固定底物的表面(圖8)。隨後在降解反 應中將底物酶促轉化為產物(3)。在該降解中，釋放了半抗原化磁性標記。 再次藉助於刺激，將標記帶到包含固定的結合組分的傳感器表面，該結合 組分結合存在於產物(3)中的半抗原，其在酶促反應中被釋放。這在圖9中 示出。由此，標記結合到固定的結合組分。在任選的進一步的步驟中，通 過改變磁場的方向以使得僅有連接到固定結合組分(4)的強結合磁性標記保 留在適當位置，可以除去非半抗原化磁性標記。這在圖10中示出。使用所 結合半抗原化磁性標記的量來計算存在於樣品中的酶活性。根據另一個實施例，在根據本發明的方法中，用以下方式來確定酶活 性。為底物(2)提供磁性標記。該底物還連接到初級結合組分(8)的第一部分。 初級結合組分(8)優選地結合到結合組分(4)，結合組分(4)附著於傳感器表 面。活性酶切割該底物，以便得到分離的初級結合組分(8)和分離的磁性標 記。由於以下兩種機制，使得磁性標記結合到傳感器表面的速率減小a)初 級結合組分(8)不再偶聯於磁性標記；以及b)初級結合組分(8)的被切割的 單元結合到結合組分(4)。結果，磁性標記與傳感器表面上結合部分的結合 速率是酶活性的量度。較高的結合速率表示較低的酶活性。任選地，如上 所述的方法包括如下所述的其它步驟。任選地，包括清洗步驟。該清洗步驟可以用於除去非特異性結合的磁 性標記、酶及其它組分。在另一個方面，本發明涉及一種適於酶活性的確定的磁性傳感器設備。 該設備優選包括
(i) 至少一個電場或磁場產生裝置(IO)，用於將電場或磁場施加到包含 磁性標記的樣品流體，
(ii) 至少一個磁性傳感器元件(ll)，
(iii) 至少一個傳感器表面，
(iv) 至少一個用於流體組分的入口，
(V)至少一個用於流體組分的出口 。
優選地，該設備還包括反應室，用於執行酶促反應。
通常，磁性感測設備對於特異性附著於傳感器表面的磁性標記是敏感 的，並在一定程度上還對沒有特異性附著於傳感器表面但在其附近的標記 是敏感的。為了使該設備高度特異於結合到傳感器表面的磁性標記，該設 備優選包括傳感器表面，其包括固定在其上的底物或結合組分。
底物和結合組分還可以分別以幹或溼的形式來提供。
在優選實施例中，尤其對於執行圖5—10所示出的方法的，該設備包 括傳感器表面，其包括結合產物(3)的固定結合組分，優選的是結合產物 (3)的抗體；以及固體表面，其包括固定的底物(2)。優選的是，包含固定的 底物(2)的固體表面在傳感器表面附近。
任選地，該設備包括用於控制溫度的裝置和/或用於清潔的裝置。 本發明還涉及一種晶片，其包括如上所述的設備中的至少一個，更優 選的是如上所述的多個設備。
磁性傳感器元件可以是任何適宜的元件，但優選的是從AMR(各向異性 磁阻)，GMR(巨磁阻)或TMR(隧道效應磁阻)傳感器元件中選擇的。基於其 它原理的傳感器元件，例如霍爾傳感器元件或SQUIDS，也可以用於所要求 權利的設備。
反應室可以是設備中的分離實體，或者可以是一個線形的反應空間。 反應室是在設備中樣品(7)與酶(1)發生接觸的空間。
該設備或晶片優選地包括底座，所述所述組分放置在底座上。該底座 可以由任何適宜的材料製造，例如玻璃、塑料或其組合。
在另一方面中，本發明涉及一種試劑盒，且包括結合了至少一個結合組分和底物的、如以上所指明的設備。這種設備適用於可以轉化底物的酶
的酶活性分析。適合的底物和結合組分可以作為所述試劑盒的分開的部分
來提供，或可以集成到該設備中。
優選地，底物和結合組分中的至少一個被固定在設備的表面上(更優選
的是傳感器表面)。
任選地，該試劑盒還包括其它組分，例如反應介質、輔因子。 本發明的設備、方法和系統適用於傳感器多路復用(即，不同傳感器和
傳感器表面的並行使用)，標記多路復用(即，不同類型標記的並行使用)，
和室多路復用(B卩，不同反應室的並行使用)。
本發明中所述的設備、方法和系統可以用作用於小體積樣品的快速、 穩固及易於現場使用的生物傳感器。該設備優選包括反應室，其可以是與 緊湊型讀取器一起使用的一次性用品，包含一個或多個磁場發生裝置，以
及一個或多個檢測裝置。此外，本發明的設備、方法和系統可以用於自動 化高通量測試。在此情況下，反應室例如是裝配在自動化工具中的孔板或 小池。
權利要求
1、 一種用磁性傳感器設備分析酶活性的方法，其中，藉助於使用結合組分(4)和磁性標記來確定酶(1)修飾底物(2)以形成產物(3)的活性，所述方法包括以下步驟(a) 在傳感器表面上固定所述底物(2)或所述結合組分(4)，(b) 使所述底物接觸所述酶，(c) 為所述結合組分或所述底物提供磁性標記，(d) 將所述結合組分(4)與底物(2)或產物(3)相接觸，以允許將所述結合組 分(4)直接或間接地連接到所述底物(2)或所述產物(3)，(e) 用磁性傳感器檢測所述磁性標記。
2、 如權利要求l所述的方法，其中，確定了酶(1)將底物(2)修飾為產物 (3)的所述活性，其中，所述底物固定在傳感器表面上。
3、 如權利要求2所述的方法，其中，所述結合組分(4)直接結合所述產 物(3)。
4、 如權利要求2所述的方法，其中，所述結合組分(4)結合初級結合組 分(8)，該初級結合組分(8)直接結合所述產物(3)。
5、 如權利要求l所述的方法，其中，確定了酶(1)降解底物(2)的所述活 性，其中，所述結合組分直接或間接地結合所述底物。
6、 如權利要求5所述的方法，其中，所述結合組分(4)結合初級結合組 分(8)，該初級結合組分(8)直接結合所述底物(2)。
7、 一種用磁性傳感器設備分析酶活性的方法，其中，確定了酶(l)修飾 底物(2)以形成產物(3)的活性，所述方法包括以下步驟(a) 固定能夠結合底物(2)或產物(3)的結合組分(4)，(b) 為底物(2)提供磁性標記，(c) 使所述底物(2)接觸所述酶，(d) 將所述結合組分(4)與底物(2)或產物(3)相接觸，以允許將所述結合組 分(4)分別直接或間接地連接到所述底物(2)或所述產物(3)，(e) 用磁性傳感器檢測所述磁性標記。
8、 如權利要求7所述的方法，其中(a) 所述酶是降解酶，並且(b) 所述結合組分結合底物(2)，(c) 酶促降解反應導致形成組分(3b)，所述組分(3b)包括所述磁性標記， 且不結合所述結合組分。
9、 如權利要求1所述的方法，用於確定降解酶的活性，其中a) 所述底物(2)和所述結合組分(4)固定在表面上，b) 所述底物包括磁性標記，c) 所述酶活性導致所述底物的降解，以致於產物(3)包括所述標記，以及d) 產物(3)結合到所述結合組分(4)。
10、 如權利要求9所述的方法，其中，具有磁性標記的第二結合組分 結合所述酶，並且可以施加磁場來捕獲所述酶或者將其帶入到所述傳感器 的特定空間中。
11、 如權利要求10所述的方法，其中，所述底物固定在固體表面，並 且所述結合組分(4)固定在磁性生物傳感器的傳感器表面。
12、 一種用於分析酶(1)在將底物(2)修飾為產物(3)時的酶活性的設備，包括i) 至少一個電場或磁場產生裝置，用於將電場或磁場施加到包含磁性 標記的樣品流體，ii) 至少一個磁性傳感器元件，iii) 至少一個傳感器表面，iv) 至少一個用於流體組分的入口，v) 至少一個用於流體組分的出口。
13、 如權利要求12所述的設備，其中，底物和/或結合組分固定在所述 傳感器表面(iii)。
14、 如權利要求13所述的設備，其包括傳感器表面，其包含結合產 物(3)的固定結合組分，優選的是結合所述產物(3)的抗體；以及固體表面， 其包括固定在其上的底物(2)。
15、 一種晶片，其包含至少一個如權利要求12 — 14中任意一項所述的設備，更優選的是包含多個如權利要求12—14中任意一項所述的設備。
16、 一種用於酶分析的試劑盒，包括如權利要求12所述的設備以及適合的酶底物和/或結合組分。
全文摘要
磁性傳感器非常適用於確定酶活性。在優選實施例中，本發明涉及一種用於確定在將底物(2)修飾為產物(3)時的酶的活性的方法，該方法包括結合底物或結合組分，其可以將例如底物或產物結合到傳感器表面。這使得能夠易於檢測連接到底物、產物或結合組分上的磁性標記。
文檔編號G01N33/543GK101313218SQ200680043963
公開日2008年11月26日 申請日期2006年11月21日 優先權日2005年11月25日
發明者E·R·福森納爾, M·W·J·普林斯 申請人:皇家飛利浦電子股份有限公司