培育重組蛋白質表達細胞的方法

2023-06-10 20:17:21

專利名稱：培育重組蛋白質表達細胞的方法
技術領域：
本發明涉及一種培育重組蛋白質表達細胞的新方法，更確切地說，是涉及培育適合於能選擇性地獲得在末端沒有蛋氨酸殘基(下文稱為「Met」)的一種有價值多肽的這類重組蛋白質表達細胞的新方法。該蛋氨酸殘基是對應於一個轉譯起始密碼子。該方法是通過在培養基中，控制所用的溶解氧含量而實現的。
近年來，在生物化學領域中，尤其是在基因重組技術方面已取得了顯著的進展，為製備大量具有生理活性的物質，例如，在過去僅能少量得到的淋巴細胞活素，就已開拓出多種基因工程技術。
以上這些技術包括的一種方法是通過把多肽基因引入大腸桿菌(E.coli)載體並使該大腸桿菌細胞通過複製、轉錄和轉譯表達該多肽，以大量生產所想要的有價值的多肽。已知這種方法在目前是最具代表性和最具優越性的方法。
用這種基因工程技術製備有價值多肽時，無論宿主細胞是真核細胞抑或是原核細胞，由於多肽的轉譯都是在對應於蛋氨酸的起始密碼子(ATG)部位起始的，所製得的該多肽的氨基末端(N-末端)是蛋氨酸。已知由生物細胞天然產生這種多肽時，其氨基末端的蛋氨酸是被宿主細胞內的氨基肽酶或類似酶切掉的(J.D.Watson，MolecularBiologyoftheGene(I)，3rdEdition，translatedbyKin-ichiroMiuraetal.，p.375(1977))。
然而，當採用帶有一種引入的外源肽〔諸如幹擾素-α(IFN-α)、生長激素(GH)或白細胞間素-2(IL-2)〕的載體所轉化的細胞時，尤其是探索培育這種細胞來大量製備有價值多肽時，宿主細胞內所存在的酶不能完全顯示其活性，結果產生出大量仍保留有N-末端為蛋氨酸的多肽(seeNature，293，408(1981)，etc)。已知帶有N-末端為蛋氨酸的多肽(例如，IL-1α和IL-1β)，其生物活性低於N-末端沒有蛋氨酸的天然多肽，而N-末端沒有蛋氨酸的多肽，也許因具有抗原性之故，是不能天然產生的。因此，該多肽用作藥物時，很可能要受到各種限制。
最近，有人提出使蛋氨酸氨基肽酶〔A.BEN-BASSATetal.，J.Bact.，169，751-757(1987);C.G.Milleretal.，P.N.A.S.，84，2718(1987)〕，氨基肽酶M〔S.Nakagawaetal.，Bio/Technol.，5，824(1987)〕或類似酶對帶有N-末端為蛋氨酸的多肽起反應以切去蛋氨酸。儘管如此，這種方法僅對具有特定順序的多肽適用而不適用於其它各種各樣的類似肽，而且所用的酶價格昂貴，因此，這種方法實際應用時，仍需繼續加以改進。
本發明的一個目的是提供一種切去N-末端蛋氨酸的方法，不管哪一種多肽，該方法適用於各種有價值的多肽。
本發明的另一個目的是提供一種切去N-末端蛋氨酸的方法，該方法具有容易實施，適於工業生產以及滿意的經濟效益等優點。
本發明提供了一種培育重組蛋白質表達細胞的方法，該方法包括在培養基中培育用帶有其中引入所想要的多肽基因的細胞質表達載體所轉化的一種宿主細胞，包括在培養基中限定使用不高於約20%飽和濃度的溶解氧的含量，以獲得從多肽中切去了對應於該表達蛋白質中起始密碼子的蛋氨酸的多肽。
為實現上述目的，我們已進行了深入的研究，我們發現在培養基中培育重組蛋白質表達細胞時，想要的N-末端沒有蛋氨酸的多肽的比例取決於培養基中溶解氧的含量，還發現通過適當地控制溶解氧的含量可從本質上有選擇性地獲得想要的沒有蛋氨酸的多肽，根據這些發現，我們完成了本發明。
根據本發明，關於這類多肽的製備，可通過簡單的方法，即將一種由帶有引入了多肽的基因的一種細胞質表達載體所轉化的宿主細胞，在一含有特定的溶解氧含量的適宜培養基中進行培育，不管採用何種多肽，均可從本質上、有選擇性地製得想要的N-末端沒有蛋氨酸的多肽。因此，本發明的方法適宜於工業生產，且從經濟效益而言，具有無需採用任何昂貴的酶即可實施的優點。
用本發明方法製備的有價值多肽並不專門限於上文所說明的那一種，對具有已知胺基酸順序或經已知DNA順序編碼的多種多肽也適用。這類多肽的例子有白細胞間素-1(IL-1)、白細胞間素-2(IL-2)、白細胞間素-3(IL-3)、白細胞間素-4(IL-4)、白細胞間素-5(IL-5)、白細胞間素-6(IL-6)、集落刺激因子(M-CSF、GM-CSF、G-CSF等)、腫瘤壞死因子(TNF)、淋巴細胞素素(LT)和類似的淋巴細胞活素等。
有價值的宿主細胞為用於該細胞質表達系統，即其中所用的載體為鍵連有想要的多肽基因的蛋白質表達系統中已知的各種細胞和即將在下面列出的轉譯起始密碼子。這類宿主細胞的例子有大腸桿菌、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、肺炎雙球菌(Diplococcuspneumoniae)、酵母、放線菌等。
以上這些宿主細胞可用已知方法轉化，用於製備轉化株的表達載體、編碼構成該載體的想要的多肽基因、各種表達該基因的調節子如啟動子、編碼結合位點和轉錄終止區的核糖體的順序、摻入該基因的起點載體等也是已知的。此外，採用有關基因重組技術中的已知方法也可容易地製得上述各種物質。
本發明方法用於表達由大腸桿菌轉化的IL-1α和IL-1β及其衍生物是特別方便和有效的。
本發明關於用於由大腸桿菌進行細胞質表達的IL-1系統，下面將會更詳細地加以說明，其它操作步驟可基本上相似。
本方法所用的IL-1α或IL-1β基因，可按照已知的天然IL-1α或IL-1β的胺基酸順序，採用例如亞磷酸三酯法(Nature，310105(1984))或類似的核酸化學合成法，完全地、一次性地合成，或可用含有該基因的細胞或類似細胞，用常規方法，進行一次性萃取和分離。此外，IL-1基因已被確定，也是有效的。這類基因的例子就是下面對比文獻中所列出的那些基因。
＊Nishidaetal.，B.B.R.C.，143，345(1987)＊Frutanietal.，NucleicAcidRes.，13，5869(1985)＊EuropeanPatentApplication出版物編號237967＊EuropeanPatentApplication出版物編號237073表達該基因所用的啟動子可以是諸如λPL，λPR，trp，lacC，tufB，recA和lpp中任何一種已知的啟動子，其中以trp啟動子特別有效。
除了上述文獻中所列出的那些基因合用外，帶有IL-1基因的細胞質表達載體和這類啟動子並且對本發明是方便合用的還包括已經公開的那些載體和啟動子，例如Kikumotoetal.，B.B.R.C.，147，315(1987)。
通過常規方法可將這些質粒引入用作宿主細胞的大腸桿菌中，藉以轉化大腸桿菌。
用於培育所得到的轉化株的培養基，可以是任何一種綜合培養基、天然培養基等，這些培養基通常用於培養大腸桿菌和產生想要的多肽。可利用的碳源通常包括例如葡萄糖、果糖、乳糖、甘油、甘露糖醇、山梨糖醇等。可利用的氮源的例子有氯化銨、硫酸銨、酪蛋白胺基酸、酵母提取液、多腖、肉提取液、細菌胰蛋白腖、玉米漿等。其他有用的營養素的例子有K2HPO4、KH2PO4、NaCl、MgSO4、維生素B1、MgCl2等。具有下列組成的培養基特別適用於培育用帶有trp啟動子的表達載體的大腸桿菌。
Na2HPO4·12H2O 6g/lKH2PO43g/lNaCl0.5g/lNH4Cl 1g/l細菌酪蛋白胺基酸10g/l細菌酵母提取液0.5g/lL-半胱氨酸HCl75mg/lL-脯氨酸75mg/lL-亮氨酸75mg/l用4NNaOH將上述培養基調至pH7.4，隨後於121℃高壓滅菌30分鐘或於123℃蒸汽加熱滅菌20分鐘。接著，於接種前，立即把分別已滅過菌的下列混合物無菌地加到培養基中。
1M MgSO4·7H2O 2ml/l1M CaCl2·2H2O 0.1ml/l7.5mg/ml硫胺素HCl1ml/l40%葡萄糖18.75ml/l在適於轉化株生長的條件下，即通常最好在pH為5.5-8.5，18-40℃條件下，通氣並攪拌培育轉化株。
按照本發明，進行上述培育時，要嚴格掌握培養基中的溶解氧含量，要限定其不高於約飽和濃度的20%，較好為約0-15%，最好為約0-5%。因此，在培育期間，當轉化株開始表達該蛋白質，即對數生長期時，尤其在對數生長期的最後階段，要限制溶解氧濃度。溶解氧濃度例如可通過適當地改變通氣條件，攪拌條件來加以控制。其詳情將在下面實施例中加以說明。
這樣，即可製得從其中切去了對應於該被表達蛋白質中起始密碼子的蛋氨酸的想要的有價值的多肽。
用常規方法，例如用酶免疫測定法(EIA)可證實該想要的多肽的產生。
用例如聲處理、SDS緩衝液的Laemmeli方法(Laemmeli，U.K.，Nature，227，680(1970))等常規方法分離和純化所得到的細胞可提取該想要的多肽。
本發明方法能從本質上，有選擇性地提供從中切去了蛋氨酸的想要的有價值的多肽。不過，該產品很可能含有有蛋氨酸的多肽，要檢驗該產品是否為含有蛋氨酸的多肽，例如可用TSK-SP-5PW(7.5×75mm層析柱，為ToyoSodaMfg。有限公司產品)進行凝膠色譜分析並在280nm處測定其組分的吸光度;或通過丹磺醯化作用、肽順序儀(AppliedBiosystems)等方法來測定N-末端的蛋氨酸含量。
按本發明方法製備的想要的多肽，可利用其理化性質，通過各種常規方法純化(例如參見「BiologicalDataBookⅡ，」pp.1175-1259，第1版，第1次印刷，1980年6月23日，KabushikiKaishaTokyoKagakudojin出版)。有需要在溫和的條件下，如通過滲透打擊，從宿主中提取多肽，以便保留其高級結構。處理純化的有效方法包括採用常用蛋白質沉澱劑、超濾作用、分子篩色譜法(凝膠過濾)、液相色譜法、離心、電泳、親合色譜法，滲析以及上述各方法的結合使用。
具體地說，上述方法可按如下所述進行首先，將從細胞提取液中所得到的上清液對想要的多肽部分純化，部分純化的處理例如可用諸如丙酮、甲醇、乙醇、丙醇或二甲基甲醯胺(DMF)之類的一種有機溶劑，或諸如乙酸、高氯酸(PCA)或三氯乙酸(TCA)之類的一種酸作為蛋白質沉澱劑;用諸如硫酸銨、硫酸鈉或磷酸鈉之類的鹽作為鹽析劑和/或用滲析膜、平板膜、空心纖維膜等進行超濾。這些處理通常與在常規條件下所進行的方法相同。
接著，將如此所獲得純化的粗產品進行凝膠過濾，回收顯示出想要多肽的活性組分。合用的凝膠過濾劑並無特別限制，它包括由葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺瓊脂糖凝膠、纖維素等組成的凝膠過濾劑。合用的凝膠過濾劑的實例還有諸如市場上可得到的交聯葡聚糖G型、交聯葡聚糖LH型、瓊脂糖凝膠型、瓊脂丙烯型(以上全是琅瑪西亞產品)、細纖維(Cellofine)(Chisso公司)凝膠過濾劑P型、凝膠過濾劑A型(A、P型均為Bio-RadLab.產品)、Ultro凝膠-C(LKB產品)、TSK-G型(ToyoSodaMfg.有限公司產品)等。
從顯示出想要多肽活性的組分中，可分離出均一的想要的多肽，例如採用羥基磷灰石柱、DEAE離子交換柱色譜法、CM或SP法，聚焦色譜法、逆相高性能液相色譜法等。或其各方法之結合，對組分進行親合色譜法分析。
用各種已知方法對組分進行聚焦色譜法分析時，適用的分析柱例如有PBE94(pharmaciaFineChemicals)等，適用的起始緩衝劑例如有咪鹽酸等，適用的洗脫劑例如有多緩衝液74(PharmaciaFineChemicals)和鹽酸(pH4.0)的混合物等。
例如可用C4Hi-Pore逆相HPLC柱(Bio-Rad實驗室)等進行逆相高性能液相色譜法。可用乙腈、三氟乙酸(TFA)、水等、或上述各溶劑的混合物作為洗脫劑。這樣，所分離得到的多肽，其N-末端就沒有蛋氨酸。
如此得到的想要多肽與對應於天然產生的多肽具有相同的生理活性，且同樣適用於製備與含有天然產生的這種多肽相同的藥物製劑。
所配製的這些藥物製劑，通常是以藥物組合物的形式，它包括有效量的多肽和適用的藥物載體。合用的藥物載體的例子包括諸如填料、補充劑、結合劑、溼潤劑、分散劑、表面活性劑之類的賦形劑和稀釋劑。這些藥物載體通常用於製備所想要的藥物劑型。至於藥物組合物的劑型並無特別限制，只要它們含有有效量的按本發明所製備的多肽，例如可以是片劑、粉劑、粒劑、丸劑等固體劑型，但是，通常適用的組合物劑型為注射用的溶液劑、懸浮劑、乳化劑等。另外，這類組合物也可以是幹製品，在臨用前用與外加適合的載體配成液體。上述藥物組合物可用常規方法製備。
按照所製得藥物組合物的劑型，該組合物可經一適合的途徑給藥，例如注射用的組合物可經靜脈、肌肉、皮下、皮內、腹膜內或其它途徑給藥。固體組合物可以口服或腸內給藥。組合物中活性成分的含量和組合物的藥用劑量，可按照給藥方法和劑型、使用目的、患者的病情等加以適當確定，但不能固定不變。通常需要將約1-80%(重量)的活性成分加到藥物製劑中，得到按活性成分計算，成人每日劑量約為0.1μg-10mg的製劑。製劑不一定一天只給藥一次。每天約藥劑量可分為3-4次。
下面各實施例將更詳細地說明本發明。
在下面各實施例中，各物質的生理活性可通過下列方法進行測定。
(1)IL-1α活性的測定用C3H/HeJ小鼠的胸腺細胞，採用J.J.Oppenhein等人的方法(J.Immunol.，116，1466(1976))測定，以LAF表示其活性。
(2)GIF活性的測定將稀釋成各種濃度的每份0.1ml試驗溶液加入96井微量培養板(Corning有限公司產品)的各個井中。接著，將含有10%FCS(小牛胎血清)和含有人黑素瘤細胞A375的2×104細胞/ml的0.1ml Eagle′s MEM懸浮液加入各井中。用一個CO2恆溫箱(Napco有限公司)溫育細胞4天。溫育後，將0.05ml的0.05%中性紅(Wako Junyaku有限公司)加到各井中，隨後於37℃溫育兩小時。移去上清液後，將0.3ml的磷酸緩衝鹽水慢慢地注入各井進行洗滌。移去上洗滌液後，將等量的磷酸一鈉和乙醇的混合物0.1ml注入各井，用一微量混合器攪拌平板幾分鐘。再用一光度計，以在540mμ處的吸光度，測家96井徵量滴定平板(Titer check multiscane，product of Flow Lab.)中進入細胞的染料量，以確定其生長抑制活性。隨後鑑別出對對照組細胞生長顯示出50%抑制的那個試驗組(即該試驗組抑制了對照組所測得的1/2吸光度)，把該試驗組稀釋倍數的倒數視為GIF活性單位。因此，例如GIF活性為10單位時，即使該試驗溶液再稀釋10倍，該溶液仍只有抑制50%細胞生長的活性。
以下各實施例將參照下面


。
圖1是用按照實施例2所得到的想要多肽進行液相色譜分析的圖示。
實施例1將人IL-1β細胞質表達載體ptrpGIF-α(按布達佩斯條約，已於1985年12月12日，按歐洲專利申請公布號237967公開的大腸桿菌×1776/ptrpGIF-α保藏號為FERMBP-949，保藏於日本工業科學和技術廳的發酵研究所(FRI)(地址日本1-3，Higashi1-chome，Yatabe-machi，Tsukuba-gun，Ibaraki-ken，305，)引入大腸桿菌HB101。由此而得到的轉化株也已按布達佩斯條約，於1988年10月7日保藏於FRI，其保藏號為FERMBP-2089。用一菌環量的上述細胞接種到含下列組分的LB培養基(200ml)，於37℃震搖過夜溫育細胞，得到預保溫的培養物。
LB培養基的組分胰蛋白腖(Difco)10g/l細菌酵母提取液(Difco)5g/lNaCl(WakoJunyaku有限公司)10g/l(pH)(7.5)用一特定量的上述預保溫培養物接種具有下面給定組分的生產培養基，在下面表1所列出的條件下，隨後以一種不同的通氣速率將其接種到一個發酵罐內。
生產培養基的組分Na2HPO4·12H2O 6g/lKH2PO43g/lNaCl0.5g/lNH4Cl 1g/l細菌酪蛋白胺基酸10g/l細菌酵母提取液0.5g/lL-半胱氨酸鹽酸75mg/lL-脯氨酸75mg/lL-亮氨酸75mg/l用4NNaOH將上述培養基調至pH7.4，隨後於120℃高壓滅菌30分鐘或於123℃蒸汽加熱滅菌20分鐘。接著，將分別滅菌過的下列各組分於接種時無菌地加入培養基中。
1M MgSO4·7H2O 2ml/l1M CaCl2·2H2O 0.1ml/l7.5mg/ml硫胺素鹽酸1ml/l40%葡萄糖18.75ml/l表1恆溫箱發酵罐(MarubishiMSJ-U3)培養基上述生產培養基培養基用量20l培育溫度37℃通氣0.25vvmor0.5vvm攪拌200r.p.m.
pH滅菌後以7.0開始接種量預保溫的培養物400ml/20升培養基溫育時間8小時培育時，要用一個溶解氧計(Marubishi生物工程有限公司)檢查培養基的溶解氧濃度。當以0.25vvm速率進行通氣時，對數生長期間培養基的溶解氧濃度至少為0%飽和度，即約5%-0%的飽和濃度。當以0.5vvm速率進行通氣時，對數生長期間培養基的溶解氧濃度至少為20%飽和濃度，即一般於約25%-20%飽和濃度之間變化。
生產培育完全後，將10ml培養物於10，000×g離心10分鐘，隨後收集細胞，接著將細胞懸浮於1ml的1M Na2HPO4(Wako Junyaku有限公司產品)，使其於4℃靜置數小時。之後，懸浮液進行聲處理。所得細胞碎片於10，000×g離心10分鐘，收集上清液。
將500μl 100mM CH3COONa(pH5.5)加入500μl上清液中，於4℃使混合物靜置30分鐘，用0.22-μm過濾器(Millipore產品)濾除所生成的沉澱。濾液進行液相色譜法分析(採用Utrochrom GTi(LKB產品);TSK凝膠SP-TPW7.5×75mm柱;吸附緩衝液50mM CH3COONa(pH5.5);用50mM CH3COONa與0.5M NaCl(pH5.5)進行梯度洗脫，得Met(+)IL-1β和Met(-)IL-1β兩組分。Met(+)/Met(-)的比例可由所繪製出的圖中所示的面積比計算出，表2示出了該計算結果。
表2通氣速率Met(+)/Met(-)之比0.25vvm0.0790.5vvm0.385表2表明用較低的通氣速率，其結果所產生的Met(+)的比例極小，這就使得有可能選擇性地生產Met(-)。
實施例2由載體ptrpGIF-α-71S所轉化的大腸桿菌HB101(HB101/ptrpGIF-α-71S);保藏號為FERMBP-1296，已按布達佩斯條約於1987年2月20日保藏在FRI，並以歐洲專利申請公布號237967公開)對IL-1β衍生物進行細胞質表達。該衍生物即為其中第71位半胱氨酸(Cys)被絲氨酸(Ser)取代的人IL-1β，該人IL-1β是採用Hitachi發酵罐(200升)，於0.5vvm通氣速率下，按與實施例1相同的方法培育的，隨後，按實施例1的方法進行相同處理和相同的液相色譜法程序。對數生長期的培養基的溶解氧濃度約為5%-0%飽和濃度。
圖1表示所得到的色譜法分析圖。在該圖中，用(1)表示Met(+)，而用(2)表示Met(-)。
圖1顯示出本發明方法能選擇性地獲得Met(-)。
權利要求
1.一種培育重組蛋白質表達細胞的方法，該方法包括在培養基中，培育一種由細胞質表達載體所轉化的宿主細胞，該細胞質表達載體中引入了一種多肽基因，培養基中溶解氧的含量限於不高於約20%飽和濃度，以得到從中已切掉對應於該表達多肽中起始密碼子的蛋氨酸的多肽。
2.權利要求1所定義的一種方法，其中多肽是淋巴細胞活素。
3.權利要求1所定義的一種方法，其中多肽是白細胞間素-1、白細胞間素-2、白細胞間素-3、白細胞間素-4、白細胞間素-5、白細胞間素-6、集落刺激因子、腫瘤壞死因子或淋巴細胞毒素。
4.權利要求1所定義的一種方法，其中宿主細胞是大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)、酵母或放線菌。
5.權利要求1所定義的一種方法，其中宿主細胞是大腸桿菌。
6.權利要求1所定義的一種方法，其中多肽是白細胞間素-1，宿主細胞是大腸桿菌。
7.權利要求6所定義的一種方法，其中白細胞間素-1是白細胞間素-1α或白細胞間素-1β。
8.權利要求1所定義的一種方法，其中多肽基因的啟動子是λPL、λPR、trp、lacC、tufB、recA或lpp。
9.權利要求8所定義的一種方法，其中多肽基因的啟動子是trp。
10.權利要求1所定義的一種方法，其中培養基中溶解氧的含量約為0%-5%飽和濃度。
11.權利要求1所定義的一種方法，其中培養基中溶解氧的含量是在對數生長期進行控制的。
全文摘要
本發明公開了一種培育重組蛋白質表達細胞的方法，該方法包括在培養基中，培育一種由細胞質表達載體所轉化的宿主細胞，該細胞質表達載體中引入了一種多肽基團，培養基中溶解氧的含量限於不高於約20％飽和濃度，以得到從中已切掉對應於該表達多肽中起始密碼子的蛋氨酸的多肽。
文檔編號C07K14/52GK1033837SQ8810782
公開日1989年7月12日 申請日期1988年11月9日 優先權日1987年11月9日
發明者高野雅明, 鴨頭峻, 平井嘉勝 申請人:大塚製藥株式會社